一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用。

背景技术：

DNA聚合酶是一类以单链DNA为模板，合成其互补链的酶类。和其他来源于自然环境中的酶一样，DNA聚合酶在进化中已经适应了其发挥功能的环境，有相应的最适反应条件。不同来源的DNA聚合酶有不同的性质和功能，除聚合酶活性外，绝大多数也都包含外切酶活性(3’-5’外切酶活性或5’-3’外切酶活性)，其中最常用的是来自一种水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的耐热Taq酶。Taq DNA聚合酶属于DNA聚合酶I家族，具有聚合酶和5’-3’外切酶活性，其聚合产物通常会在3’端形成一个带A的粘性末端。目前的研究已经对Taq酶的各方面性质有了比较明确的认识。在实际应用中，除野生型Taq酶外，也对野生型Taq酶做了不同的突变以优化其各方面的性能。

目前，现有技术中有对Taq DNA聚合酶做突变或融合某些DNA结合蛋白来改善Taq酶的某些方面性能，比如热稳定性、延伸速度、延伸长度等。在目前高速发展的高通量测序技术应用中，Taq酶也被用来在建库过程中给短的DNA片段末端加A，以利于后续加接头等操作。除了野生型Taq酶之外，用于加A的酶还可以是DNA结合蛋白修饰过的Taq酶、3’-5’外切酶活性缺失的klenow酶、5’-3’外切酶活性缺失的Taq酶等。

由于目前已有的用于加A的酶普遍存在效率较低的情况，不能有效加A导致接头无法连接到DNA片段上，所以，大大限制了高通量测序中建库的质量和效率。因此，需要对野生型Taq酶进行改造，使之适应目前高通量测序技术的建库需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用，克服了现有高通量测序技术中DNA片段末端加A效率低的缺陷，改造得到氨基酸序列如SEQ NO.1所示的突变型Taq酶，此突变型Taq酶加A效率得到较大提高，更加适应高通量测序建库的需求。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种可提高加A效率的突变型Taq酶，含有下述1-6个突变位点：突变位点1：E315K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第315位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点2：E388V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第388位的谷氨酸突变为缬氨酸；突变位点3：E507K，即野生型Taq酶氨基酸序列中第507位的谷氨酸突变为赖氨酸；突变位点4：D578G，即野生型Taq酶氨基酸序列中第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸；突变位点5：A608V，即野生型Taq酶氨基酸序列中第608位的丙氨酸突变为缬氨酸；突变位点6：M747R，即野生型Taq酶氨基酸序列中第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸。

本发明所述可提高加A效率的突变型Taq酶，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。

本发明还提供编码所述突变型Taq酶的基因。

进一步，本发明编码所述突变型Taq酶的基因的核苷酸序列如SEQNO.2所示。需要说明的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述突变型Taq酶的核苷酸序列并不局限于SEQ NO.2所示序列，也可以是由与SEQ NO.2所示核苷酸序列突变一个或几个核苷酸形成同义突变得到可编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

再，本申请提供了一种载体，该载体包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列。

进一步，所述载体包含如SEQ NO.2所示的核苷酸序列。

一种重组细胞，包含：包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列，或包含可编码所述突变型Taq酶的核苷酸序列的载体。

进一步，所述重组细胞所使用的宿主细胞为BL21。

一种含有所述突变型Taq酶的聚合酶试剂。

本发明所述突变型Taq酶在高通量测序中的应用。

本发明所述可提高加A效率的突变型Taq酶的制备方法，其包括如下步骤：

1)构建含编码突变型Taq酶的核苷酸序列的载体：利用含有突变位点信息的引物，对含有野生型Taq酶基因的质粒进行PCR扩增；得到目的条带后利用同源重组得到重组质粒或直接转化得到突变质粒，测序验证；

2)将步骤1)得到的载体转化宿主细胞得到重组细胞：将载体转化到宿主细胞中，利用抗生素筛选得到正确转化的重组细胞；

3)培养并收集重组细胞，提取纯化突变型Taq酶。

进一步，步骤1)中，所述引物的具体序列如下：

E315K-1：TTCCCGCAAGAAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTG；

E315K-2：CCCACATGGGCTTCTTGCGGGAAAGCACAAAGCC；

E388V-1：CACCACCCCCGTGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGC；

E388V-2：GGGCCACCCCCACGGGGGTGGTGTTGGAAGGGTC；

E507K-1：CGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC；

E507K-2：TGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG；

D578G-1：AAGTAGCTCCGGCCCCAACCTCCAGAACATCCCC；

D578G-2：GGAGGTTGGGGCCGGAGCTACTTAGCCTGCCCGT；

A608V-1：GCTATTGGTGGTGCTGGACTATAGCCAGATAGAG：

A608V-2：TATAGTCCAGCACCACCAATAGCCACCCCTCCTC；

M747R-1：GGCCGAGCGCCGCGCCTTCAACATGCCCGTCCAGG；

M747R-2：TGTTGAAGGCGCGGCGCTCGGCCGCCTCCCGCAC。

本发明上述引物中包含了需要突变的位点和替换过的碱基。

本发明测试结果显示：与野生型Taq酶相比，使用本发明改造的所述突变型Taq酶进行加A的实验组文库产量明显提高，文库分布无异常，充分说明所述突变型Taq酶的加A效果得到显著提高。

本发明的有益效果：

本发明对野生型Taq酶进行定向突变优化，使之适应在高通量测序技术中的应用要求，得到所述突变型Taq酶。该突变型Taq酶使加A效率得到提升，增加了建库效率，可应用于更低起始量模板和增加建库完整性和覆盖度。

附图说明

图1为本发明实施例4文库的琼脂糖凝聚电泳检测结果。

图2为本发明实施例4文库分布检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1构建含编码突变型Taq酶的核苷酸序列的载体

利用基因合成的方法，合成引物序列如下：

E315K-1：TTCCCGCAAGAAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTG；

E315K-2：CCCACATGGGCTTCTTGCGGGAAAGCACAAAGCC；

E388V-1：CACCACCCCCGTGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGC；

E388V-2：GGGCCACCCCCACGGGGGTGGTGTTGGAAGGGTC；

E507K-1：CGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACC；

E507K-2：TGCCGGTCTTCTTCGTCTTGCCGATGGCGGGAAG；

D578G-1：AAGTAGCTCCGGCCCCAACCTCCAGAACATCCCC；

D578G-2：GGAGGTTGGGGCCGGAGCTACTTAGCCTGCCCGT；

A608V-1：GCTATTGGTGGTGCTGGACTATAGCCAGATAGAG；

A608V-2：TATAGTCCAGCACCACCAATAGCCACCCCTCCTC；

M747R-1：GGCCGAGCGCCGCGCCTTCAACATGCCCGTCCAGG；

M747R-2：TGTTGAAGGCGCGGCGCTCGGCCGCCTCCCGCAC；

以包含野生型Taq酶基因序列的质粒为模板，利用PCR对野生型Taq酶基因进行扩增。PCR扩增分为6个反应，分别以E315K-2和E388V-1，E388V-2和E507K-1，E507K-2和D578G-1，D578G-2和A608V-1，A608V-2和M747R-1，M747R-2和E315K-1为引物，在50μl反应体系中，10μM的引物各加入2μl，以Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme，货号P505)为DNA聚合酶。扩增条件为95℃ 30s；95℃ 15s；60℃ 15s；72℃ 30s-3min；72℃ 5min；共30个循环。

扩增结束后，在50μl反应体系中直接加入1μl DpnI，37℃恒温孵育2小时，消化原始质粒模板。以1％-1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带后切胶回收。将回收产物利用MutMultiS Fast Mutagenesis Kit V2(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme，货号C215)进行重组反应，37℃恒温孵育0.5小时。

取20μl冷却反应液，加入到100μl DH5α感受态细胞(Vazyme)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入500μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天挑取单克隆，测序。测序结果表明：本发明合成的突变型Taq酶的核苷酸序列如SEQ NO.2所示，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

实施例2将载体转化宿主细胞得到重组细胞：

取10ng测序验证无误的载体以同样转化方法转化到BL21感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆。

实施例3培养并收集重组细胞，提取纯化突变型Taq酶

将单克隆重组细胞挑入3ml LB液体培养基中，摇培6-8h，然后转接扩大培养至300ml LB液体培养基中，摇培4-6h后，加入IPTG至终浓度为50mmol/L后继续摇培过夜，诱导目的蛋白表达。将300ml菌液分装至50ml离心管中，以5000rpm离心10min收集菌体。每100ml菌液离心后加入10ml洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.9；50mmol/L右旋糖；1mmol/L EDTA)重悬，冰上放置1h；3500rpm离心3min重新收集菌体，加入50ml预裂解缓冲液(洗脱缓冲液加4g/L溶菌酶)，室温放置15min；加入50ml裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH7.9；50mmol/L KCl；1mmol/L EDTA；1mmol/L PMSF；0.5％Tween-20(V/V)；0.5％NP-40(V/V))，剧烈振荡混匀，75℃孵育1h，不时振荡，然后将裂解混合液转移至50m1离心管，4℃5000rpm离心15min，转移上清液至新的离心管中，加入30g硫酸铵，室温迅速混匀。15000rpm离心15min，将蛋白沉淀物重新悬浮至20ml洗脱缓冲液中，在储存缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH7.9；50mmol/L KCl；0.1mmol/L EDTA；0.5mmol/L PMSF；1mmol/L DTT；50％glycerol(V/V)中透析至少12h。透析后，用储存缓冲液1∶1稀释，储存于-80℃。

实施例4突变型Taq酶和野生型Taq酶的性能比较

将2份10ng起始DNA模板分别利用VAHTS Nano DNA Library PrepKit for(由南京诺唯赞生物科技有限公司生产，Vazyme，货号ND601)进行片段化和末端修复后，用等量突变型Taq酶和野生型Taq酶进行加A反应。然后加接头连接，用试剂盒中的扩增模块进行文库扩增，得到文库。

对文库进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，DNA marker为100bp DNA ladder(购于Takara公司，货号3422A)。由图1可知，从等体积建库产物在紫外下的亮度来看，突变型Taq酶组在300bp左右的条带亮度均高于野生型Taq酶组，可见，突变型Taq酶的建库效率高于野生型Taq酶。

进一步，使用荧光染料Qubit进行文库浓度测定，测定结果如表1所示。由表1可知，突变型Taq酶组文库的浓度明显增大，充分说明突变型Taq酶的加A效率得到了显著提高。

将文库稀释后，用Agilent Technologies 2100Bioanalyzer购于AgilentTechnologies公司)进行文库分布检测，结果如图2所示，图2显示二者分布正常。

综上表明：与野生型Taq酶相比，本发明所述突变型Taq酶进行加A的实验组文库产量明显提高，突变型Taq酶的加A效率显著提高，且文库分布无异常。

表1

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>南京诺唯赞生物科技有限公司

<120>一种可提高加A效率的突变型Taq酶及其制备方法和应用

<160>2

<210>SEQ ID NO. 1

<211>833

<212>PRT

<213>人工合成

MNSGMLPLFE PKGRVLLVDG HHLAYRTFHA LKGLTTSRGE PVQAVYGFAK SLLKALKEDG 60

DAVIVVFDAK APSFRHEAYG GYKAGRAPTP EDFPRQLALI KELVDLLGLA RLEVPGYEAD 120

DVLASLAKKA EKEGYEVRIL TADKDLYQLL SDRIHVLHPE GYLITPAWLW EKYGLRPDQW 180

ADYRALTGDE SDNLPGVKGI GEKTARKLLE EWGSLEALLK NLDRLKPAIR EKILAHMDDL 240

KLSWDLAKVR TDLPLEVDFA KRREPDRERL RAFLERLEFG SLLHEFGLLE SPKALEEAPW 300

PPPEGAFVGF VLSRKKPMWA DLLALAAARG GRVHRAPEPY KALRDLKEAR GLLAKDLSVL 360

ALREGLGLPP GDDPMLLAYL LDPSNTTPVG VARRYGGEWT EEAGERAALS ERLFANLWGR 420

LEGEERLLWL YREVERPLSA VLAHMEATGV RLDVAYLRAL SLEVAEEIAR LEAEVFRLAG 480

HPFNLNSRDQ LERVLFDELG LPAIGKTKKT GKRSTSAAVL EALREAHPIV EKILQYRELT 540

KLKSTYIDPL PDLIHPRTGR LHTRFNQTAT ATGRLSSSGP NLQNIPVRTP LGQRIRRAFI 600

AEEGWLLVVL DYSQIELRVL AHLSGDENLI RVFQEGRDIH TETASWMFGV PREAVDPLMR 660

RAAKTINFGV LYGMSAHRLS QELAIPYEEA QAFIERYFQS FPKVRAWIEK TLEEGRRRGY 720

VETLFGRRRY VPDLEARVKS VREAAERRAF NMPVQGTAAD LMKLAMVKLF PRLEEMGARM 780

LLQVHDELVL EAPKERAEAV ARLAKEVMEG VYPLAVPLEV EVGIGEDWLS AKE 833

<210>SEQ ID NO. 2

<211>2502

<212>DNA

<213>人工合成

atgaattcgg ggatgctgcc cctctttgag cccaagggcc gggtcctcct ggtggacggc 60

caccacctgg cctaccgcac cttccacgcc ctgaagggcc tcaccaccag ccggggggag 120

ccggtgcagg cggtctacgg cttcgccaag agcctcctca aggccctcaa ggaggacggg 180

gacgcggtga tcgtggtctt tgacgccaag gccccctcct tccgccacga ggcctacggg 240

gggtacaagg cgggccgggc ccccacgccg gaggactttc cccggcaact cgccctcatc 300

aaggagctgg tggacctcct ggggctggcg cgcctcgagg tcccgggcta cgaggcggac 360

gacgtcctgg ccagcctggc caagaaggcg gaaaaggagg gctacgaggt ccgcatcctc 420

accgccgaca aagaccttta ccagctcctt tccgaccgca tccacgtcct ccaccccgag 480

gggtacctca tcaccccggc ctggctttgg gaaaagtacg gcctgaggcc cgaccagtgg 540

gccgactacc gggccctgac cggggacgag tccgacaacc ttcccggggt caagggcatc 600

ggggagaaga cggcgaggaa gcttctggag gagtggggga gcctggaagc cctcctcaag 660

aacctggacc ggctgaagcc cgccatccgg gagaagatcc tggcccacat ggacgatctg 720

aagctctcct gggacctggc caaggtgcgc accgacctgc ccctggaggt ggacttcgcc 780

aaaaggcggg agcccgaccg ggagaggctt agggcctttc tggagaggct tgagtttggc 840

agcctcctcc acgagttcgg ccttctggaa agccccaagg ccctggagga ggccccctgg 900

cccccgccgg aaggggcctt cgtgggcttt gtgctttccc gcaagaagcc catgtgggcc 960

gatcttctgg ccctggccgc cgccaggggg ggccgggtcc accgggcccc cgagccttat 1020

aaagccctca gggacctgaa ggaggcgcgg gggcttctcg ccaaagacct gagcgttctg 1080

gccctgaggg aaggccttgg cctcccgccc ggcgacgacc ccatgctcct cgcctacctc 1140

ctggaccctt ccaacaccac ccccgtgggg gtggcccggc gctacggcgg ggagtggacg 1200

gaggaggcgg gggagcgggc cgccctttcc gagaggctct tcgccaacct gtgggggagg 1260

cttgaggggg aggagaggct cctttggctt taccgggagg tggagaggcc cctttccgct 1320

gtcctggccc acatggaggc cacgggggtg cgcctggacg tggcctatct cagggccttg 1380

tccctggagg tggccgagga gatcgcccgc ctcgaggccg aggtcttccg cctggccggc 1440

caccccttca acctcaactc ccgggaccag ctggaaaggg tcctctttga cgagctaggg 1500

cttcccgcca tcggcaagac gaagaagacc ggcaagcgct ccaccagcgc cgccgtcctg 1560

gaggccctcc gcgaggccca ccccatcgtg gagaagatcc tgcagtaccg ggagctcacc 1620

aagctgaaga gcacctacat tgaccccttg ccggacctca tccaccccag gacgggccgc 1680

ctccacaccc gcttcaacca gacggccacg gccacgggca ggctaagtag ctccggcccc 1740

aacctccaga acatccccgt ccgcaccccg cttgggcaga ggatccgccg ggccttcatc 1800

gccgaggagg ggtggctatt ggtggtgctg gactatagcc agatagagct cagggtgctg 1860

gcccacctct ccggcgacga gaacctgatc cgggtcttcc aggaggggcg ggacatccac 1920

acggagaccg ccagctggat gttcggcgtc ccccgggagg ccgtggaccc cctgatgcgc 1980

cgggcggcca agaccatcaa cttcggggtc ctctacggca tgtcggccca ccgcctctcc 2040

caggagctag ccatccctta cgaggaggcc caggccttca ttgagcgcta ctttcagagc 2100

ttccccaagg tgcgggcctg gattgagaag accctggagg agggcaggag gcgggggtac 2160

gtggagaccc tcttcggccg ccgccgctac gtgccagacc tagaggcccg ggtgaagagc 2220

gtgcgggagg cggccgagcg ccgcgccttc aacatgcccg tccagggcac cgccgccgac 2280

ctcatgaagc tggctatggt gaagctcttc cccaggctgg aggaaatggg ggccaggatg 2340

ctccttcagg tccacgacga gctggtcctc gaggccccaa aagagagggc ggaggccgtg 2400

gcccggctgg ccaaggaggt catggagggg gtgtatcccc tggccgtgcc cctggaggtg 2460

gaggtgggga taggggagga ctggctctcc gccaaggagt ga 2502