制备重组红鳍东方鲀IFN‑γ蛋白的基因及方法与流程

本发明属于生物基因工程领域，尤其涉及一种制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的基因及方法。

背景技术：

红鳍东方鲀是中国重要的养殖品种，经济价值高，繁育养殖技术成熟。随着养殖规模不断扩大，疾病特别是病毒性、寄生虫性、细菌性疾病对红鳍东方鲀的危害很大，对养殖业造成严重损失；病害防治成为养殖过程中较为棘手的问题。目前对红鳍东方鲀病害的研究还不成熟，对于疾病的防治仍以防预为主，因此，提高鱼体自身抗病能力在养殖过程中显得尤为重要。

干扰素γ（interferon gama, IFN-γ）属于Ⅱ型干扰素，是一类由Th细胞和NK细胞分泌表达的天然糖蛋白。作为一种细胞因子，IFN-γ能促进 MHCⅠ类及Ⅱ类抗原的加工提呈、调节Th1细胞免疫应答、以及调节其他一些免疫细胞而在机体免疫调节过程中发挥重要作用；此外IFN-γ还具有抗病毒、抗肿瘤、抗细胞增殖、抗寄生虫等作用。

IFN-γ自被发现并证实干扰素具有抗病毒作用以来一直是人们研究的热点，但鱼类IFN-γ研究起步较晚。斑马鱼(Danio rerio)、大西洋鲑鱼(Salmo salar)和斑点绿河鲀（Tetraodon nigroviridis）等鱼类的干扰素基因于2003年被克隆到近年来，金鱼、鲶鱼、红鳍东方鲀等的IFN-γ基因也已被克隆。D. Igawa等通过人工诱导斑马鱼IFN-γ的产生，证实两种斑马鱼IFN-γ基因IFN-γ-1和IFN-γ-2 的存在，并通过构建原核表达载体诱导表达出相应的蛋白。Jun Zou 等根据虹鳟与大西洋鲑基因组的高等同源性，从虹鳟头肾细胞的cDNA 文库中筛选出虹鳟的IFN-γ基因，并对其生物活性进行试验，结果表明IFN-γ基因与另一种免疫基因混合免疫虹鳟能够提高鱼体免疫力。目前，重组草鱼干扰素（rCiIFN）已通过原核表达方式被大量发酵，且已证明将草鱼rCiIFN 蛋白掺入饲料中可有效提高草鱼幼鱼成活率。但是，迄今为止，还没有关于真核表达获得重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的基因及方法。

本发明的技术解决方案是：一种制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

一种制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 将DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入真核表达质粒pPICZαA上，得到真核表达重组质粒pPICZαA-IFN-γ；

b. 将得到的真核表达重组质粒pPICZαA-IFN-γ电转化入毕赤酵母GS115感受态中，筛选阳性克隆；

c. 将筛选出的阳性克隆接种到BMGY液体培养基内扩大培养至OD_600nm=2~6，离心收集菌体；

d. 用无菌水重悬所收集的菌体，使OD_600nm=1.0~2.0，离心后收集菌体； BMMY液体培养基重悬菌体后转接至100mL含BMMY液体培养基的锥形瓶中，使OD_600nm=1.0~2.0；28~30℃、250~300 rpm震荡培养96h，期间每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为1.0%；12000rpm，4℃离心3min收集上清，PBS缓冲液透析，3KD超滤管浓缩，75%硫酸铵沉淀法再次浓缩上清中的蛋白，收集沉淀，即得重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白。

本发明是在天然红鳍东方鲀IFN-γ基因的基础上进行密码子优化，并在序列两端加入酶切位点等，继而以改造的基因制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白，与现有技术相比，具有如下优点：（1）能够在毕赤酵母中高效表达，表达量占菌体总蛋白的80%以上；（2）所表达的重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白主要分泌到毕赤酵母细胞外的培养基中，不需要超声破碎等繁琐操作就可以得到重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白，且其稳定性好，可重复性高，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例重组质粒的双酶切电泳鉴定图。

图2是本发明实施例不同甲醇浓度所诱导的重组蛋白表达的电泳图。

图3是WISH细胞在本发明实施例重组蛋白作用下的增殖百分曲线。

图4是WISH细胞在本发明实施例重组蛋白作用下的回归直线图。

具体实施方式

本发明是利用生物信息学软件对红鳍东方鲀IFN-γ DNA序列（GenBank: AJ616216.2）进行分析，获得其成熟肽序列，编码167个氨基酸。将目的基因序列进行密码子优化并在其N端添加XhoⅠ及kex 2蛋白酶切位点，C端保留终止密码子并添加XbaⅠ酶切位点。优化的IFN-γ DNA序列如SEQ ID NO:1所示，用于制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白。

本发明的重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 合成SEQ ID NO:1所示的基因并将其克隆入真核表达质粒pPICZαA上，得到真核表达重组质粒pPICZαA-IFN-γ。

对得到的真核表达重组质粒pPICZαA-IFN-γ进行双酶切鉴定，结果如图1所示。

图1: M1为DL2000 Marker，1为双酶切后的重组质粒pPICZαA- IFN-γ，2为重组质粒pPICZαA- IFN-γ，M2为λ-HindⅢ Marker，结果表明双酶切得到了分子量大小分别为3.5kbp和504bp的条带，与理论值相同，证明目的基因片段已成功连接至真核表达质粒pPICZαA内。

b. 将Sac I快切酶线性化后的真核表达重组质粒电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞内，电击条件为：电压1500V，电阻250Ω，电容25μF；将转化后的菌液涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS固体培养基中，28~30℃培养至长出菌落；1~2mL无菌水吹洗转化后涂布的平板，将平板上的菌体尽量洗下，梯度稀释后，吸取100~200μL涂布在Zeocin质量浓度为1mg/mL和2mg/mL的YPDS平板上，28℃培养至长出菌落，挑取高拷贝菌株，筛选出阳性克隆。

将筛选出的阳性克隆接种至YPDS液体培养基内扩大培养OD_600nm=1.0~2.0，取少量菌液，煮-冻-煮法提取宿主基因组DNA，并以其为模板，以SEQ ID NO:2所示的上游引物及SEQ ID NO:3所示的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35cycles；72℃，7min，4℃，保存。PCR产物送至宝生物生物工程（大连）有限公司进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示，表明真核表达重组质粒pPICZαA-IFN-γ转化入真核宿主GS115细胞内。

c. 将筛选出的阳性克隆接种到BMGY培养基内扩大培养，离心收集菌体：

将筛选出的阳性克隆接种于装有15mL BMGY液体培养基的100mL摇瓶中，28~30℃、250-300 rpm震荡培养16~18 h，至OD_600nm=2.0，室温下1500~3000g离心5min，收集菌体；

d. 无菌水重悬所收集的菌体，使OD_600nm =1.0，离心收集菌体，用BMMY液体培养基重悬菌体后转接至100mL 含BMMY培养基的锥形瓶中，使OD_600nm =1.0；28~30℃、250~300 rpm震荡培养96h，期间每24h向培养基中添加甲醇（作诱导剂）至终浓度为1.0%；12000rpm，4℃离心3min收集上清，PBS缓冲液透析，3KD超滤管浓缩，75%硫酸铵沉淀法再次浓缩上清中的蛋白，收集沉淀，即得重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白。用微孔滤膜过滤除菌，可以作为抗病添加剂，免疫佐剂等。

分别取采用不同的甲醇终浓度（0.5%、1.0%、1.5%）进行诱导的产物SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图2所示。图2中: M：protein ladder，1：甲醇终浓度为0.5%的上清液；2：甲醇终浓度为1.0%的上清液；3：甲醇终浓度为1.5%的上清液；4：甲醇终浓度为1.0%的细胞沉淀。

结果表明：甲醇终浓度为1%诱导表达96小时得到的蛋白量最多，占菌体总蛋白的80%以上。

重组蛋白活性检测：

用完全培养基将传代2-3次的WISH细胞配制成每1mL含2.5×10⁵~3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，于37℃ 5%CO₂下培养4~6小时至细胞长成单层。用Bradford法测定浓缩后蛋白样品浓度，操作按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒（生工生物）说明书进行。

浓缩后的上清液作为活性检测供试品。干扰素标准品与供试品（本发明实施例所得到的重组蛋白）按照4¹，4²，4³，4⁴，4⁵，4⁶，4⁷，4⁸倍进行稀释，每个实验组进行3次重复试验。将配制完成的标准品和供试品溶液分别移入接种WISH细胞的细胞培养板中，每孔100 μL，于37℃ 5%CO₂下培养18~24小时，弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡口炎型病毒（VSV，-70℃保存）用攻毒培养液稀释至约100 TCID₅₀，每孔100 μL，于37℃ 5%CO₂下培养24小时（镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/mL），然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入20μL MTT，37℃ 5%CO₂下培养4h，每孔加入DMSO 150μL，37℃5%CO₂下培养2h，后摇晃10min，在波长570nm处测吸光度，记录测定结果。实验数据采用四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果。

供试品生物学活性（IU/mL）=Pr×(Ds×Es)/(Dr×Er)

式中：Pr为标准品生物学活性，IU/mL；

Ds为供试品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效量的稀释倍数。

WISH细胞在本发明实施例重组蛋白作用下的增殖百分曲线及回归曲线分别如图3，图4所示。（图3：R：重组蛋白组细胞增殖百分曲线，S：标准蛋白组细胞增殖百分曲线； 图4：R：重组蛋白组细胞增殖增殖百分曲线，S：标准蛋白组细胞增殖增殖百分曲线；线性（R）：重组蛋白组细胞增殖回归直线，线性（S）：标准蛋白组细胞增殖回归直线）表明本发明实施例所得的重组蛋白粗品具有明显的生物学活性，其效价为2018 IU/mL。

序列表

<110>大连海洋大学

<120>制备重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白的基因及方法

<130>

<160>3

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tcttacattc ctgttgagat gaataagact attcaaaact tgttgggtca ttatactatt 60

actaacaaag aattgttcga cggtaagcca atcttctcca aggagccatt gtccggaaac 120

ttgcaggccg agatgatcta catgtccgcc attttgcaaa cctacgataa gattttgaac 180

caaatgttga aggagttgcc aaccccaggt ccaactactg ctcagtcttc tggtgacaag 240

ggtaccgccg agttgagatc tcagcttaac tacattttga agaagattac taacttgcgt 300

attcaacatt acaataagcc agagcaattg ttgaagatgt tgcaaccatt gagagaagtt 360

caattcaaca acgctgtcat ccaatccaag gccttgtggg agttgatcaa ggtctacaga 420

gaggcttcct ccttgccaaa caagttggag aagcgtagac gtagacgtcg tagacagacc 480

cagatgtcca ttagaggtca ttaa 504

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 2

GCTGCTAAAGAAGAAGGGGT 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

AGATCCTCTTCTGAGATGAG 20