本发明涉及细胞提取技术领域，具体涉及一种具有提升注入式自体脂肪成活率的复活因子提纯和萃取工艺。
背景技术：
自体脂肪从人体自身某些部位吸取多余的皮下脂肪细胞，然后经过吸出的混合物经净化处理、注入药物得到复合脂肪颗粒，选择完整的颗粒脂肪细胞通过注射的方式再移植到自己需要进行脂肪填充的部位，例如乳房、面部等，用以治疗胸部扁平、两侧乳房不对称、浅表微细皱纹、薄嘴唇隆成厚嘴唇等等。但是目前很多脂肪填充后有一定程度的被吸收，为了保证最好的效果需要进行再次手术，脂肪的用量过多或注射过于集中，大量脂肪堆积会因供血不足导致脂肪坏死、溶解、吸收，极易引发感染，出现纤维化或钙化、脂肪坏死等后遗症，很多的自体脂肪在注射之后，成活率都较低，会造成手术的负面效果，影响手术成果，需要使用PRP来提高自体脂肪注射的成活率，因此设计了一种提升注入式自体脂肪成活率复活因子提纯和萃取工艺。
技术实现要素：
针对以上问题，本发明提供了一种提升注入式自体脂肪成活率复活因子提纯和萃取工艺，能够很好的提取出自体脂肪注射所需的PRP，大大提高了从细胞中提取PRP的效率，能够保证自体脂肪注射后的活力，使得自体脂肪注射手术更加安全可靠，值得推广。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种提升注入式自体脂肪成活率复活因子提纯和萃取工艺，该方法包括以下步骤：
（a）对于全血样本的采集：采集成人血液，放入试管内，在离心机内离心12-14min；离心之后血液加入抗凝剂静置30min。
（b）全血样本的分离：静置后的全血样本分为三个明显的层次，吸取上清血浆用于提取富血小板血浆；加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀。
（c）全血样本的发酵：将全血样本加入发酵液内，得到全血样本发酵液，搅拌10min后静置，提取出发酵液上清。
（d）发酵液上清冷冻处理：将发酵液上清加入冻存液，重悬全血发酵液，加入冻存容器，使用半导体制冷设备冷冻，温度逐步降低，并放入液氮罐内保存。
（e）全血样本细胞复苏：将冷冻的发酵液从液氮罐内取出，经过生理盐水水浴，在发酵液重新液化之后，静置处理。
（f）复活因子的提纯与萃取：静置后的液体加入离心管内，放在离心机内进行二次离心处理，离心完成后在恒温环境下静置处理，弃掉离心管上层的血浆，加入新的血浆样本，使得沉淀的血小板重新悬浮，得到复活因子。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（a）中，离心机转速保持1000-1100rpm，使得全血样本初步分离，便于将血小板与血清分离开来。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（a）中，抗凝剂采用乙二胺四乙酸、草酸钠、肝素与枸橼酸钠混合制成，所述抗凝剂与全血样本比例为1:9~11。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（b）中，溶液在室温下静置，最上层为含血小板的血浆层，中间层呈现黄色，为血块黄层，最低层厚度最大，为红细胞层。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（b）中，羟乙基淀粉溶液每100ml组分为含羟乙基淀粉130/0.4 6g和氯化钠0.9g。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（c）中，发酵液与全血样本的比例为1:20~22，发酵液采用核酸型发酵液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（d）中，冻存液为小牛血清与DMSO混合物，且小牛血清与DMSO比例为1:9，其中DMSO浓度为10%。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（d）中，半导体制冷设备温度降低速率为8-12℃/min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（e）中，生理盐水浓度为5%。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（f）中，离心机转速保持800-1000rpm，恒温温度为23-25℃，确保血小板的重新悬浮。
本发明的有益效果：
本发明能够很好的提取出自体脂肪注射所需的PRP，大大提高了从细胞中提取PRP的效率，能够保证自体脂肪注射后的活力，使得自体脂肪注射手术更加安全可靠，值得推广。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：
一种提升注入式自体脂肪成活率复活因子提纯和萃取工艺，该方法包括以下步骤：
（a）对于全血样本的采集：采集成人血液，放入试管内，在离心机内离心12-14min；离心之后血液加入抗凝剂静置30min。
（b）全血样本的分离：静置后的全血样本分为三个明显的层次，吸取上清血浆用于提取富血小板血浆；加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀。
（c）全血样本的发酵：将全血样本加入发酵液内，得到全血样本发酵液，搅拌10min后静置，提取出发酵液上清。
（d）发酵液上清冷冻处理：将发酵液上清加入冻存液，重悬全血发酵液，加入冻存容器，使用半导体制冷设备冷冻，温度逐步降低，并放入液氮罐内保存。
（e）全血样本细胞复苏：将冷冻的发酵液从液氮罐内取出，经过生理盐水水浴，在发酵液重新液化之后，静置处理。
（f）复活因子的提纯与萃取：静置后的液体加入离心管内，放在离心机内进行二次离心处理，离心完成后在恒温环境下静置处理，弃掉离心管上层的血浆，加入新的血浆样本，使得沉淀的血小板重新悬浮，得到复活因子。
步骤（a）中，离心机转速保持1000-1100rpm，使得全血样本初步分离，便于将血小板与血清分离开来；步骤（a）中，抗凝剂采用乙二胺四乙酸、草酸钠、肝素与枸橼酸钠混合制成，所述抗凝剂与全血样本比例为1:9~11；所述步骤（b）中，溶液在室温下静置，最上层为含血小板的血浆层，中间层呈现黄色，为血块黄层，最低层厚度最大，为红细胞层；步骤（b）中，羟乙基淀粉溶液每100ml组分为含羟乙基淀粉130/0.4 6g和氯化钠0.9g。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤（c）中，发酵液与全血样本的比例为1:20~22，发酵液采用核酸型发酵液；步骤（d）中，冻存液为小牛血清与DMSO混合物，且小牛血清与DMSO比例为1:9，其中DMSO浓度为10%；步骤（d）中，半导体制冷设备温度降低速率为8-12℃/min；步骤（e）中，生理盐水浓度为5%；步骤（f）中，离心机转速保持800-1000rpm，恒温温度为23-25℃，确保血小板的重新悬浮。
目前对于自体脂肪注射如何提高成活率，主要有这几个方法，一、注意选择抽吸的方法，尽量采用空针吸脂，负压不要超过0.05MPa手术中抽吸脂肪组织的方法直接影响手术的结果。因为，手术抽吸过程中，不可避免地会造成部分细胞的损坏及破坏。损伤的程度大，活细胞就越少，存活率也就越低。多数学者主张用空针吸脂，其负压不超过0.05MPa，这样可减少细胞的破坏。如用其它无创技术抽吸脂肪，则吸管都应选用4mm以下的细管为佳。由于整个手术是在皮下无大的血管和神经分布的脂肪层内进行，所以抽吸出来的都是脂肪，患者基本不出血、无痛苦。二、尽量选择脂肪活性比较高的大腿部位脂肪研究发现，人体不同部位的脂肪组织的脂蛋白酶的活性存在差异。发现大腿部位的脂肪组织的脂蛋白酶的活性高于其他部位。LPL的活性高，有利于移植脂肪细胞的再生成活。大腿及臀部的LPL活性最高，依次为下腹部、上腹部递减。根据这项研究以及这些部位的深层脂肪分布，故宜在躯干的下半部首选作自体脂肪丰胸脂肪移植的供区。三、丰太阳穴时尽量将脂肪分多个点分散注射自体脂肪丰太阳穴的原则是将脂肪多个点分散注射，均匀分散在受区组织中。每个点注入量不超过1ml，应避免将大量的脂肪集中在某一部位，注射后按摩抚平。此法由于脂肪体积小、部位分散、植入物血运易建立，有利于脂肪颗粒的成活。四、脂肪颗粒的纯化处理萃取优质脂肪收集脂肪颗粒应用4度生理盐水清洗过滤，洗尽已破坏的脂肪细胞，脂滴及血液。纯化过程应特别注意无菌操作;还应尽量减少脂肪颗粒在体外的存放时间，以提高脂肪细胞生存率。
其中，实验通过测定自动收集器收集的每一管中的核糖以及蛋白含量，可以得出发酵液经sepharose-4FF柱洗脱后的分布曲线，结果表明，最先洗脱得到的是荚膜多糖，最后洗脱得到的为蛋白质和核酸，由于蛋白质和核酸往往小于荚膜多糖，sepharose-4FF凝胶分离收集管中PRP核糖的合并依据两个原则：其一，合并管的主要成分是核糖，其二：分子量符合中国药典规定的Kd小于0.5的比例占50％以上，采用本领域常见的实验方法计算PRP核糖的洗脱曲线，计算KD＝O.5时对应的洗脱体积就可以确定收集范围。因此sepharose-4FF可以很方便的分离蛋白质、核酸以及核糖，最先收集的荚膜多糖中，接近外水体积的荚膜多糖的分子量比较大，中间位置出来的荚膜多糖的分子量比较小，依前所述，分子量大小只是糖单元重复数不同，由于荚膜多糖分子量普遍过大，因此分子量大和小的荚膜多糖的免疫原性差别不大。
经过实验表明，本发明生产出的复活因子，在注射自体脂肪之后，能够很好的提高自体脂肪的活性，自体脂肪注射后的成活率提高了60%，而且对于身体无副作用。
基于上述，本发明的优点在于，本发明能够很好的提取出自体脂肪注射所需的PRP，大大提高了从细胞中提取PRP的效率，能够保证自体脂肪注射后的活力，使得自体脂肪注射手术更加安全可靠，值得推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。