本发明涉及遗传工程化的真菌细胞、优选酵母的开发，其可以以可控制的和经济的方式生产特定链长度的脂肪酸衍生产物。更具体地，本发明涉及生产非常长链脂肪酸(very long chain fatty acid，VLCFA)产物和衍生物，例如，非常长链脂肪醇，例如，二十二醇、非常长链脂肪酸，例如，芥子酸、神经酸，以及这样的非常长链脂肪醇和脂肪酸的蜡酯，例如，希蒙得木油酯，其可以用于生产一系列工业化学品和油，以及药物和美容产品。
背景技术：
伯醇是具有多种工业应用的化合物产品类别，这包括多种的生物燃料和专门化学品。伯醇还可以用于制造大量的其他工业产品，包括聚合物和表面活性剂。高级伯醇，也称为脂肪醇，及其衍生物具有许多商业应用，包括用作表面活性剂、润滑剂、塑化剂、溶剂、乳化剂、润肤剂、增稠剂、调味剂、香料和燃料。脂肪醇可以进一步脱水成α-烯烃，其可用于制造聚合物、润滑剂、表面活性剂、塑化剂，也可以用于燃料配方中。
生产脂肪醇的当前的技术涉及脂肪酸的无机催化剂介导还原成相应的伯醇。用于这个过程的脂肪酸来自天然来源，例如，植物和动物油和脂肪，主要是椰子、棕榈、棕榈仁、牛油和猪油。这些多种来源具有不同的脂肪酸组成；特别重要的是存在多变的酰基链长度。结果，来自这些脂肪酸的脂肪醇也具有多变的链长度。脂肪醇的链长度极大地影响分子的化学和物理性质，因而不同的链长度被用于不同的应用。当前脂肪醇通过例如脂肪酸的加氢作用、末端烯烃的加氢甲酰化、正链烷烃的部分氧化以及乙烯的Al催化聚合来生产。脂肪醇还可以通过产自石油化工原料的α-烯烃的化学水化来制造。遗憾的是，直接从基于石油的线型烃(正链烷烃)的氧化来产生脂肪醇是商业上不可行的。这种不可行是由于正链烷烃的氧化主要产生仲醇、叔醇或酮，或这些化合物的混合物，但是不产生高产量的脂肪醇。另外，生产脂肪醇的当前已知方法的缺点是它们受限于相对昂贵的原料，特别是乙烯，其是通过石油的热裂化产生的。另外，当前的方法需要好几个步骤以及好几种催化剂类型。
植物初级脂肪醇以游离形式存在，或通过酯键与脂肪酸例如棕榈酸连接得到蜡酯，或与芳族化合物例如阿魏酸连接得到羟基肉桂酸烷基酯。这些多种化合物通常是植物的细胞外脂质屏障的成分：包被着气生表面的表皮、各种内部和外部组织层的细胞壁中存在的木栓质，以及花粉粒的外壁中存在的孢粉质。这些蜡质通常是非常长链(C20-C34)脂肪酸以及衍生物，包括初级脂肪醇和蜡酯的复杂混合物。蜡酯还可以充当能量储存，例如，希蒙得木(Simmondsia chinensis)籽油的情况。
不同于大多数其他植物，希蒙得木种子的油，按重量计算构成种子的45-55％，主要由脂肪酸与醇类的非常长链单酯组成(按重量计算97-98％)而不是甘油三酯。这些酯通常被称为蜡酯，是长度主要在36-46个碳的直链酯，酯键大约在链的中心处。由于其皮肤学性质，在室温下作为液体存在的油被广泛用作美容和药物工业中的原材料。希蒙得木油还被用作鲸油的替代，作为润滑剂和作为塑化剂。由于它不经历脂肪酶水解，因而是不易消化的，希蒙得木油也被研究作为食物中的非卡路里脂肪替代物。
然而，希蒙得木油的供应相对短缺以及它极好的性质导致了相当高的价格，阻碍它用于商业制备大量有用的衍生物和产品。
因而，需要可替代的方法来低成本地生产商业性的和可扩大数量的非常长链脂肪酸衍生产物，包括希蒙得木油。
早先，在异源表达特定的酶，包括脂肪酸还原酶(FAR)和蜡酯合成酶时，与脂肪酸底物或相关前体的饲喂相组合，仅在酵母和大肠杆菌中证明了长链脂肪醇与非常长链蜡酯的合成(Kalscheuer等人，2006；Li等人，2008；Teerawanichpan and Qiu，2010))。然而，这些解决方案不适合于以低成本方式生产可扩大数量的非常长链脂肪酸衍生产物。
技术实现要素：
本发明提供了遗传工程化的真菌细胞，优选的酵母，包括用于生物合成非常长链脂肪酸产物或衍生物的基因，如非常长链脂肪酸，例如，芥子酸、神经酸，非常长链脂肪醇，例如，二十二醇，和/或蜡酯，例如希蒙得木油酯，以及以可控制的和经济的方式生产这样的非常长链脂肪酸产物的方法，所述产物可以用于生产一系列工业化学品和油，例如，润滑剂，以及药物和美容产品，例如，乳化剂、软化剂。
实施方式的一个方面涉及能够生产VLCFA和/或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。所述遗传修饰的真菌细胞包含至少一个编码脂肪酰基-辅酶A(fatty acyl-CoA)还原酶的外源基因，以及至少一个编码延伸酶的基因，和/或至少一个编码脂肪酸合成酶的基因。所述至少一个编码延伸酶的基因是编码延伸酶的过量表达的内源基因和/或编码延伸酶的外源基因。相应地，所述至少一个编码脂肪酸合成酶的基因是编码脂肪酸合成酶的过量表达的内源基因和/或编码脂肪酸合成酶的外源基因。
实施方式的另一个方面涉及能够生产VLCFA或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。所述遗传的真菌细胞包含至少一个编码分枝杆菌属(Mycobacterium)脂肪酸合成酶的基因。
实施方式的进一步的方面涉及生产VLCFA和/或VLCFA衍生物的方法。所述方法包括在培养基中培养根据所述实施方式的遗传修饰的真菌细胞。所述方法还包括从所述遗传修饰的真菌细胞和/或从所述培养基分离VLCFA和/或所述VLCFA衍生物。
酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)是非常重要的细胞工厂，因为它已经广泛用于生物燃料、化学品和药物的生产，因而在开发可以用于生产一整套不同产物的这种酵母的平台菌株方面有着很高的关注。然而问题是，这种用于高效生产脂肪酸衍生产物的平台细胞工厂的效率不足以良好的工业应用。在一个实施方式中，本发明是酵母的多基因修饰方法，通过组合从脂肪酰基-辅酶A到长链或非常长链脂肪醇和/或蜡酯的直接转化途径，产生稳定的和可扩大的平台，用于生产非常长链脂肪酸衍生产物。
在一个实施方式中，通过所述重组真菌细胞例如酵母产生的所述VLCFA衍生物，例如，脂肪醇、脂肪酸、蜡酯等，是非常长链脂肪醇，优选的二十二醇，其可以用于工业化学品或药物和美容产品的生产。在另一个实施方式中，所述VLCFA衍生物是非常长链脂肪酸，优选的芥子酸((Z)-二十二碳-13-烯酸)，其被用作工业化学品或药物和美容产品中的成分。在又一个实施方式中，本发明的VLCFA衍生物是神经酸((Z)-二十四碳-15-烯酸)，其可以用于药物和食物产品。例如，神经酸可以用于治疗脱髓鞘疾病，包括多发性硬化。另外，神经酸还可以利用它的营养价值，作为膳食补充剂，例如，在婴儿食品和/或婴儿配方食品中。在另一个实施方式中，本发明的VLCFA衍生物是蜡酯，优选的希蒙得木油/酯，其可以用于生产工业化学品或药物和美容产品。在下文发明的说明中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1.显示了VLCFA、VLC-脂肪醇和相应的蜡酯的合成。背景酵母菌株(Δpox1，ACC1**)提供了丙二酰基-辅酶A的增强的前体供应，用于脂肪酸延伸。向非常长链的延伸通过延伸酶或通过脂肪酸合成酶(FAS)(分枝杆菌衍生的，进化的酵母FAS)系统进行。异源的非常长链特异性还原酶催化反应去往脂肪醇。VLCFA蜡酯合成酶将非常长链脂肪酸与非常长链脂肪醇组合，产生非常长链蜡酯。取决于目标产物，脱饱和酶基因OLE1被增量调节(单不饱和的FAs)或减量调节(饱和的FAs)。
图2.显示了蜡酯的合成，通过脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和蜡合成酶(WS)催化。
图3.显示了脂肪醇和蜡酯生物合成。在SD-URA+2％葡萄糖培养基中孵育48小时的摇瓶培养物的气相色谱图。图线代表酿酒酵母JV03菌株，表达意大利蜂(Apis mellifera，Am)或水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)VT8(MaFAldhR)脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，以及衍生自不动杆菌(Acinetobacter baylyi，Ab)ADP1、拟南芥(Arabidopsis thaliana，At)、纤细眼虫(Euglena gracilis，Eg)或希蒙得木的蜡合成酶(WS)。还显示了带有空载体pSP-GM2的酿酒酵母对照菌株。用I-X标记的灰色柱条突出显示的峰与NIST库标准物相比较，预测为：I，十六烷(内标准物)；II，棕榈油酸(C16：1)和棕榈酸(C16：0)；III，油酸(C18:1)和硬脂酸(C18:0)；IV，角鲨烯；V，麦角固醇；VI，十六醇(C16:0)；VII，十八醇(C18:1)和油醇(C18:1)。
图4.表示图3中描述的生产菌株中脂肪醇的定量。
图5.显示了蜡酯生物合成。在SD-URA+2％葡萄糖培养基中孵育48小时的摇瓶培养物的气相色谱图。图线代表酿酒酵母JV03菌株，表达意大利蜂(Am)或水油海杆菌VT8(MaFAldhR)脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，以及衍生自不动杆菌ADP1(Ab)、拟南芥(At)、纤细眼虫(Eg)或希蒙得木(Sc)的蜡合成酶(WS)。还显示了带有空载体pSP-GM2的酿酒酵母对照菌株。用I-II标记的灰色柱条突出显示的峰与NIST库标准物相比较，预测为：I，角鲨烯和II，麦角固醇。通过将质谱与Urbanova等人2012公开的质谱比较来鉴定峰III，被鉴定为硬脂酰棕榈酸酯(C18:0-C16:0)。
图6.显示了在内质网中脂肪酸延伸到C26。延伸过程的第一步是通过P-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)催化的。
图7.显示了蜡酯生物合成。在最小培养基+2％葡萄糖培养基中孵育48小时的摇瓶培养物的气相色谱图。图线代表酿酒酵母CEN.PK113-5D elo3 ΔACC1**菌株，表达意大利蜂(Am)脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，以及衍生自不动杆菌ADP1(Ab)、拟南芥(At)、纤细眼虫(Eg)或希蒙得木(Sc)的蜡合成酶(WS)。还显示了带有空载体pYX212的酿酒酵母对照菌株。用I-VII标记的灰色柱条突出显示的峰通过将质谱与Urbanova等人2012公开的质谱比较来鉴定，被鉴定为I，棕榈酰基豆蔻酸酯(C16:0-C14:0)；II，棕榈酰基棕榈酸酯(C16:0-C16:0)，硬脂酰基豆蔻酸酯(C18:0-C14:0)，棕榈酰基棕榈油酸酯(C16:0-C16:l)和硬脂酰基肉豆蔻脑酸酯(C18:0-C14:l)；III，硬脂酰基棕榈酸酯(C18:0-C16:0)；花生酰基豆蔻酸酯(C20:0-C14:0)，硬脂酰基棕榈油酸酯(C18:0-C16:l)，棕榈酰基油酸酯(C16:0-C18:l)和油酰基棕榈油酸酯(C18:l-C16:l)；IV，花生酰基棕榈酸酯(C20:0-C16:0)，山嵛酰基豆蔻酸酯(C22:0-C14:0)，棕榈酰基花生酸酯(C16:1-C20:0)，硬脂酰基硬脂酸酯(C18:0-C18:0)和花生酰基棕榈油酸酯(C20:0-C16:1)；V，山嵛酰基棕榈酸酯(C22:0-C16:0)，棕榈酰基山嵛酸酯(C16:0-C22:0)，花生酰基硬脂酸酯(C20:0-C18:0)，硬脂酰花生酸酯(C18:0-C20:0)，山嵛酰基棕榈油酸酯(C22:0-C16:1)和花生酰基油酸酯(C20:0-C18:l)；VI，山嵛酰基硬脂酸酯(C22:0-C18:0)，花生酰基花生酸酯(C20:0-C20:0)，硬脂酰基山嵛酸酯(C18:0-C22:0)和山嵛酰基油酸酯(C22:0-C18:l)；VII，花生酰基山嵛酸酯(C20:0-C22:0)和山嵛酰基花生酸酯(C22:0-C20:0)。
图8.显示了蜡酯生物合成。在最小培养基+2％葡萄糖培养基中孵育48小时的摇瓶培养物的气相色谱图。所述株系是图线代表酿酒酵母CEN.PK113-5D elo3 ΔACC1**菌株，表达水油海杆菌VT8(MaFAldhR)脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，以及衍生自拟南芥(At)、纤细眼虫(Eg)或希蒙得木(Sc)的蜡合成酶(WS)。还显示了带有空载体pYX212的酿酒酵母对照菌株。用I-VII标记的灰色柱条突出显示的峰通过将质谱与Urbanova等人2012公开的质谱比较来鉴定，被鉴定为I，棕榈基豆蔻酸酯(C16:0-C14:0)和棕榈油酰基豆蔻酸酯(C16:l-C14:0)；II，棕榈酰基棕榈酸酯(C16:0-C16:0)，硬脂酰基豆蔻酸酯(C18:0-C 14:0)，棕榈酰基棕榈油酸酯(C16:0-C16:1)，硬脂酰基肉豆蔻脑酸酯(C18:0-C14:l)和棕榈油酰基棕榈油酸酯(C16:l-C16:l)；III，硬脂酰基棕榈酸酯(C18:0-C 16:0)，棕榈酰基硬脂酸酯(C 16:0-C18:0)，花生酰基豆蔻酸酯(C20:0-C14:0)，硬脂酰基棕榈油酸酯(C18:0–C16:1)，棕榈酰基油酸酯(C16:0-C18:1)，油酰基棕榈油酸酯(C18:l-C16:l)和棕榈油酰基油酸酯(C16:l-C18:l)；IV，花生酰基棕榈酸酯(C20:0-C16:0)，山嵛酰基豆蔻酸酯(C22:0-C 14:0)，棕榈酰基花生酸酯(C16:0-C20:0)，硬脂酰基硬脂酸酯(C18:0–C18:0)和花生酰基棕榈油酸酯(C20:0–C16:1)；V，山嵛酰基棕榈酸酯(C22:0-C 16:0)，棕榈酰基山嵛酸酯(C16:0-C22:0)，花生酰基硬脂酸酯(C20:0–C18:0)，硬脂酰基花生酸酯(C18:0-C20:0)，山嵛酰基棕榈油酸酯(C22:0–C16:1)和花生酰基油酸酯(C20:0-C18:l)；VI，山嵛酰基硬脂酸酯(C22:0-C18:0)，花生酰基花生酸酯(C20:0-C20:0)，硬脂酰山嵛酸酯(C18:0-C22:0)和山嵛酰基油酸酯(C22:0-C18:l)；VII，花生酰基山嵛酸酯(C20:0-C22:0)和山嵛酰基花生酸酯(C22:0-C20:0)。
图9.表示图7和8中描述的生产菌株中脂肪醇的定量。
图10.表示图7和8中描述的生产菌株中蜡酯的定量。
图11.显示了菌株5Delo3 ΔACC1**(pYX12::MaFAldhR::SciWS::Elo2)中C38到C42蜡酯的浓度。
图12.显示了菌株5Delo3 ΔACC1**(pYX212::MaFAldhR::SciWS::Elo2)中C40蜡酯的具体的m/z峰。
图13.显示了菌株5Delo3 ΔACC1**(pYX212::MaFAldhR::SciWS::Elo2)中C42蜡酯的具体的m/z峰。
图14.显示了对照菌株(JV03 Δelo3 pELO2)和生产菌株(JV03 Δelo3 pELO2 pAt5FAR)的一个独立克隆的二十二醇生产。
图15.显示了整合ELO1、ELO2和At5FAR过量表达，同时删除ELO3的染色体组工程策略的示意图。
图16.显示了当比较两种菌株JV03(Δelo3 pELO2 pAt5FAR)和CEN.PK 113-5D(Δelo3 Δgal1 GAL7p–ACC1**GAL7p-At5FAR GAL7p-ELO1 GAL10p-ELO2)时的二十二醇生产(mg/L)。
图17.显示了通过在背景菌株CEN.PK 113-5D Δelo3 ACC1**中延伸酶基因ELO2、AtFAE1(拟南芥)、BnKCS(Brassica napus，芜菁甘蓝)、CaKCS(Crambe abyssinica，海甘蓝)、LaKCS(Lunaria annua，银扇草)、ScFAE(希蒙得木)、TmKCS(Tropaeolum majus，旱金莲)的过量表达，组合酿酒酵母衍生的脱饱和酶OLE1的过量表达，酿酒酵母中的VLC脂肪酸合成。
图18.显示了与ELO2组合的酿酒酵母基因OLE1过量表达，以及它对提高单不饱和脂肪酸水平的影响。使用背景菌株CEN.PK 113-5D Δelo3ACC1**。
图19.显示了VLC脂肪酸-辅酶A生物合成。在SD-LEU+2％葡萄糖培养基中孵育72小时的摇瓶培养物的气相色谱图。线条表示表达p415GPD::MvFAS::Acps的酿酒酵母TDY7005菌株。还显示了酿酒酵母TDY7005对照菌株。用I-X标记的灰色柱条突出显示的峰与NIST库标志物相比较，预测为：I，二十一酸(内标准物，C21:0)；II，二十二酸(C22:0)；III，二十四酸(C24:0)和IV，二十六酸(C26:0)。
图20.显示了两种不同系统的C22脂肪酸生产。JV03 Δelo3 pELO2和TDY7005 Δelo3 Δelo2 p415GPD::MvFAS::Acps中生产的比较。
图21.显示了酿酒酵母中芥子酸的生产。在菌株背景CEN.PK 113-5D Δelo3 ACC1**中酿酒酵母衍生的脱饱和酶OLE1和特定延伸酶的过量表达。延伸酶包括ELO2(酿酒酵母)、AtFAE1(拟南芥)、BnKCS(芜菁甘蓝)、CaKCS(海甘蓝)、LaKCS(银扇草)和ScFAE(希蒙得木)。
图22.显示了(i)直接从脂肪酰基-辅酶A，或(ii)通过游离脂肪酸和脂肪醛生产脂肪醇的代谢途径。
图23.显示了从(i)脂肪酰基-辅酶A，或(ii)通过游离脂肪酸和脂肪醛直接合成的脂肪醇的定量。如早先描述的(Buijs等人，2015)从葡萄糖最小培养基中的48h摇瓶培养物中提取脂肪醇。FaCoAR代表菌株YJZ01(MATa MAL2-8c SUC2 his3 Δl ura3-52hfdlΔ)(Buijs等人，2015)，表达来自水油海杆菌的FAR(Willis等人，2011)，CAR代表YJZ01，表达来自水油海杆菌的MmCAR(Akhtar等人，2013)。还过量表达来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的相应的辅助因子磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶NpgA(Mootz等人，2002)。
图24.显示了利用质粒pSP-GM2::AmFAR(SEQ ID NO：1，Partow等人2010)在酵母菌株CEN.PK 113-5D和JV03中内源酵母基因MPP6、ACP1、EPT1、FAA1、GEP4、GGA2、IDP3、INP54、LPP1、MCR1、ORM1、RTC3、SPO7、TGL1、YFT2的过量表达。与没有任何共表达、携带pSP-GM2::AmFAR的特定对照菌株相比，脂肪醇(C18:1)分布的相对定量。
图25.显示了解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)中的醇类生物合成。在SD-URA-LEU+2％葡萄糖培养基中孵育48小时的摇瓶培养物的气相色谱图。上部的图形显示了解脂耶氏酵母JMY195背景菌株，下部的菌株显示了表达意大利蜂(Am)脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和衍生自希蒙得木(Sc)的蜡合成酶(WS)的相同菌株。用I-II标记的灰色柱条突出显示的峰与NIST库标准物比较，预测为：I，十六醇(C16:0)和II，十八醇(C18:1)。
发明详细说明
现在将参考附图和实施例在下文中更完整地描述本发明，在其中显示了本发明的示范性的实施方式。这些说明不旨在成为可以实现本发明的所有不同方式的详细编目，或可以添加到本发明种的所有技术特征。例如，对于一个实施方式例举的特征可以整合到其他实施方式中，对特定实施方式例举的特征可以从该实施方式中删除。因而，本发明期待在本发明的某些实施方式中，本文阐述的任何特征或特征组合可以被包括或省略。另外，对本文提出的各种实施方式的多种变化和增加在当前公开内容的启示下对于本领域技术人员而言是显而易见的，不背离本发明。因此，以下的说明旨在例举本发明的某些特定实施方式，而不是穷尽地指定其所有排列、组合和变体。
定义
除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。因而，本发明中可以使用的延伸酶、还原酶、脱饱和酶、脂肪酸合成酶和蜡酯合成酶，多肽和编码它们的基因是本领域已知的任一种或其同源物或衍生物。
发明的说明中使用的术语的目的仅是描述特定的实施方式，而不是限制本发明。
本文引用的所有公开物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用将它们完全合并在此，用于参考文献中存在的句子和/或段落相关的教导。
除非上下文另外标明，这具体意味着本文描述的本发明的各种特征可以以任意组合使用。此外，本发明还期待在本发明的某些实施方式中，本文阐述的任何特征或特征组合可以被包括或省略。举例来说，如果说明书声称某一组合物包含组分A、B和C，这具体意味着A、B或C的任一个、或其组合可以单独地或以任意组合地省略或放弃。
为了便于理解本发明，下文定义了一些术语。
如在本发明的说明和附随的权利要求中使用的，单数形式“一个”和“所述”也包括复数形式，除非上下文明显地另外标明。
如本文使用的，术语“和/或”是指并且涵盖一种或更多种相关的列出项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选择(“或”)来解释时组合的缺省。
如本文使用的，术语“包含”是指声明的特征、整体、步骤、操作、元素和/或成分的存在，但是不排除存在或增加一种或更多种其他特征、整体、步骤、操作、元素、成分和/或其组合。
如本文使用的，过渡性用语“基本上由……组成”意思是权利要求的范围要被理解为涵盖权利要求中引述的指定材料或步骤，以及实质上不影响请求的发明的基础和新特征的那些。因而，术语“基本上由……组成”当在本发明的权利要求中使用时，不希望被解释为等同于“包含”。
如本文使用的，在使用术语“重组”时是指特定的核酸(DNA或RNA)是克隆、限制和/或连接步骤的各种组合的产物，产生与自然系统中存在的内源核酸可区分的、具有结构编码序列或非编码序列的构建体。
如本文使用的，术语“蛋白质”和“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，可互换地使用。
如本文使用的，术语“提高”、“提高的”、“增强”和“增强的”(以及其语法的变体)表示与对照相比提高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多、或其中的任何范围。
如本文使用的，术语“降低”、“降低的”、“减低”、“抑制”和“减少”和类似的术语是指与对照相比降低至少约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多，或其中的任何范围。
如本文使用的降低的基因表达涉及遗传修饰，其降低基因的转录、降低从基因转录的mRNA的翻译、和/或降低从mRNA翻译的蛋白质的翻译后加工。这样的遗传修饰包括施加于对照序列的插入、删除、提高或突变，例如，基因的启动子和增强子。例如，基因的启动子可以被较低活性的或可诱导的启动子替代，从而引起降低的基因转录。启动子的敲除也将产生降低的、一般为零的基因表达。
如本文使用的，术语“敲除”或“删除”或“破坏”是指不起作用或被敲除的基因、和/或无功能的基因产物，例如，基本上没有活性的多肽，例如与野生型多肽的活性相比低于约10％或甚至5％。
如本文使用的，术语本发明的核苷酸序列的“部分”或“片段”将被理解为是指相对于参考核酸或核苷酸序列降低长度的核苷酸序列，并包含、基本上由、和/或由相同或几乎相同(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％)于参考核酸或核苷酸序列的连续核苷酸的核苷酸序列组成。在适当时，根据本发明的这样的核酸片段或部分可以包括在更大的多核苷酸中作为其组分。
具有同源性的不同的核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源的序列，以及来自相同物种和其他物种的直系同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间就位置相同性百分比而言的相似性水平，即，序列相似性或同一性。同源性还指在不同的核酸或蛋白之间的相似功能性质的概念。因而，本发明的组合物和方法进一步包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文使用的，“直系同源”是指在物种形成期间起源于共同的祖先基因的、不同物种中的同源的核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物具有与所述核苷酸序列实质上的序列同一性，例如，至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％。
如本文使用的，术语“过量表达(overexpress)”是指与在天然细胞或对照，例如，没有用特定的过量表达的异源多肽或重组多肽转化的细胞中相比，更高水平的基因活性，例如，基因的转录；更高水平的mRNA向蛋白质的翻译；和/或更高水平的基因产物如多肽的生产。过量表达的基因的典型实例是与基因的天然启动子相比处在另一个启动子的转录控制下的基因。此外，或作为选择，基因的控制元件中的其他改变，例如，增强子，可以用于过量表达特定的基因。此外，影响，即，提高从基因转录的mRNA的翻译的修饰，做为选择或另外地，可以用于实现本文使用的过量表达。这些术语还可以指细胞中基因的拷贝数的提高，和/或mRNA或基因产物的数量的提高。过量表达可以产生与对照水平相比在细胞中25％、50％、100％、200％、500％、1000％、2000％或更高的水平。
“外源的”“异源的”或“重组的”核苷酸序列是与导入它的宿主细胞天然地不相关的核苷酸序列，包括天然发生的核苷酸序列的非天然发生的多个拷贝。这样的外源基因可以是来自另一个物种或菌株的基因，宿主细胞中天然发生的基因的修饰的、突变的或进化的版本，或宿主细胞中天然发生的基因的嵌合版本或融合基因。在前者的情况下，修饰、突变或进化导致基因的核苷酸序列改变，从而获得与宿主细胞中天然发生的基因相比具有另一种核苷酸序列的修饰的、突变的或进化的基因。进化的基因是指编码进化的基因、以及通过遗传修饰获得的基因，例如，突变或暴露于进化压力，来得到具有与野生型或天然基因相比具有不同核苷酸序列的新基因。嵌合基因是通过组合一种或更多种编码序列的部分来产生新基因而形成的。这些修饰不同于融合基因，融合基因将完整的基因序列合并到单个阅读框中并常常保持了它们的原始功能。
“内源的”、“天然的”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然发生的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因而，例如，“野生型mRNA”是在生物体中天然发生的、或对于生物体是内源的mRNA。“同源的”核酸序列是与导入它的宿主细胞天然地相关的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”是指线性的或分枝的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交物。该术语还涵盖RNA/DNA杂交物。
如本文使用的，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物，或这些核苷酸从核酸分子的5'到3'端的序列，包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成的DNA，例如化学合成的DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其任何一种可以是单链的或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在此也可互换地使用，是指核苷酸的杂聚物。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在此从左至右以5'到3'方向呈现，使用美国序列细则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中列出的代表核苷酸特征的标准代码呈现。
如本文使用的，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA、反义-microRNA、反义寡脱氧核苷酸(AMD)等的核酸分子。基因可能或可能不能用于生产功能蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区，例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区。基因可以是“分离的”，这是指核酸实质上或基本上没有在其天然状态与所述核酸相关联存在的成分。这样的成分包括其他细胞材料、来自重组生产的培养基、和/或化学合成核酸中使用的各种化学品。
基因的密码子优化的版本是指导入真菌细胞的外源基因，其中基因的密码子已经针对特定的真菌细胞优化。一般地，在物种之间不是所有的tRNA都被同样地表达或在同一水平表达。因而基因序列的密码子优化涉及改变密码子来匹配最普遍的tRNAs，即将低普遍性tRNA识别的密码子改变为给定真菌细胞中相对更普遍的tRNA识别的同义密码子。这样，来自密码子优化的基因的mRNA将被更有效地翻译。密码子和同义密码子优选地编码相同的氨基酸。
在酵母细胞的上下文中“导入”意思是以一定方式使核酸分子与细胞接触，从而所述核酸分子进入细胞的内部。因而，多核苷酸和/或核酸分子可以在单个转化事件中、在独立的转化事件中被导入酵母细胞。因而，本文使用的术语“转化”是指异源核酸导入到细胞中。酵母细胞的转化可以是稳定的或是短暂的。
在多核苷酸的上下文中“短暂的转化”是指多核苷酸被导入细胞中，并且不整合到细胞的基因组中。
在被导入细胞的多核苷酸的上下文中，“稳定导入”或“稳定导入的”是指，导入的多核苷酸被稳定地掺入细胞的基因组中，因而所述细胞用所述多核苷酸稳定转化。
本文使用的“稳定转化”或“稳定转化的”是指核酸分子被导入细胞并整合到细胞的基因组中。因而，整合的核酸分子能够被其子代遗传，更特别地，被多个连续世代的子代遗传。本文使用的“基因组”包括核基因组。本文使用的稳定转化还可以指染色体外维持的核酸分子，例如，质粒。
通过例如酶联免疫吸附分析(ELISA)或蛋白质印迹可以检测短暂转化，其可以检测被导入生物体的一种或更多种核酸分子编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组DNA与核酸序列的Southern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与被导入生物体例如酵母的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的Northern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与被导入酵母或其他生物体的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他扩增反应来检测，采用与核酸分子的目标序列杂交的特异性引物序列，引起目标序列的扩增，目标序列可以根据标准方法检测。转化还可以通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案来检测。
本文使用的“遗传修饰”或“遗传修饰的”涉及对真菌细胞如酵母的基因组的这样的遗传学修饰，和/或向真菌细胞如酵母中导入外源核苷酸序列，例如，以一个或更多个质粒的形式。
本文使用的术语“脂肪醇”意图是指包含一个或更多个羟基基团的脂肪族化合物。脂肪醇拥有基团-CH2OH，其可以被氧化以形成具有相同碳原子数量的相应的醛或酸。脂肪醇可以是饱和脂肪醇或不饱和脂肪醇。
本文使用的术语“脂肪醛”意图是指包含醛(CHO)基团的脂肪族化合物。脂肪醛可以被还原形成相应的醇，或被氧化形成具有相同碳原子数量的羧酸。脂肪醛可以是饱和脂肪醛或不饱和脂肪醛。
本文使用的术语“脂肪酸”意图是指包含至少一个羧酸基团(COOH)的脂肪族化合物。脂肪酸可以被还原形成具有相同碳原子数量的相应的醇或醛。脂肪酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。
术语“脂肪酸产品”或“脂肪酸衍生物”在本文中可互换地使用，包括脂肪酸或脂肪酸衍生物；例如，脂肪醛、脂肪醇、ω羟基脂肪酸、脂肪酯，包括蜡酯、甘油三酯、脂肪-酰基-辅酶A、脂肪酰基-ACP或任何其他脂肪酸衍生物。在特定的实施方式中，脂肪酸产品或衍生物在由脂肪酸、脂肪醇和蜡酯构成的组中选择。
本文使用的术语“长链”脂肪酸(LCFA)或长链脂肪酸衍生物是具有16到18个碳的酰基链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。
本文使用的术语“非常长链”脂肪酸(VLCFA)或非常长链脂肪酸衍生物是具有大于18个碳的酰基链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在特定的实施方式中，VLCFA产品或衍生物是C19-C28产品或衍生物，即，优选地具有19到26个碳或19到24个碳的酰基或烃基长度。
VLCFA产品或衍生物优选地选自由非常长链脂肪酸、非常长链脂肪醇或蜡酯构成的组，所述蜡酯是i)非常长链脂肪酸和脂肪醇，ii)脂肪酸和非常长链脂肪醇，iii)非常长链脂肪酸和非常长链脂肪醇，或iv)脂肪酸(B-侧)和脂肪醇(A-侧)的酯，其中碳链的总长度，即A-侧+B-侧，大于18个碳。在特定的实施方式中，蜡酯的A-侧具有C16-C28的碳链长度，蜡酯的B-侧具有C16-C28的碳链长度。在这样的特定实施方式中，蜡酯是i)长链或非常长链脂肪酸与ii)长链或非常长链脂肪醇的酯。
本文使用的术语“延伸酶”以及可用缩写(ELO)指代的，是利用丙二酰基-辅酶A来向生长的酰基-辅酶A链添加C2单位的酶。这个过程还涉及脱羧基作用，因而很大程度上是不可逆的。延伸酶在几种区室中存在，包括线粒体、内质网和过氧化物酶体。内质网还具有延伸酶系统，用于从不同长度的酰基-辅酶A底物合成非常长链脂肪酸(C18+)。延伸酶系统中涉及的基因包括YBR159W、PHS1、TSC13、CER10、KCR1、PAS2、ELO1、ELO2和ELO3。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，所述至少一个编码延伸酶的基因包含编码来自延伸酶系统的酶的过量表达的内源基因，所述酶选自由β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)(Elo1和/或Elo2)、β-酮脂酰-辅酶A还原酶(YBR159W)、β-羟基酰基-辅酶A脱水酶(Phs1)和烯酰基-辅酶A还原酶(Tsc13)构成的组。这个实施方式可以与上文描述的、涉及编码延伸酶的外源基因的实施方式组合。在这样的情况下，酿酒酵母细胞包含至少一个编码延伸酶的外源基因以及至少一个编码来自所述延伸酶系统的酶的内源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含编码来自延伸酶系统的酶的外源基因，所述酶选自由拟南芥还原酶(CER10，KCR1)和脱水酶构成的组，以及其密码子优化的版本。
本文使用的术语“脂肪酰-辅酶A还原酶”或“脂肪酰基还原酶”、“非常长链脂肪酸还原酶”或“成脂肪醇酰基-辅酶A还原酶”，以及缩写“FAR”指代的，产生醇类作为还原反应的产物。在与NAD(P)H向NAD(P)+氧化关联的反应中，FAR催化脂肪酰基-辅酶A、脂肪酰基-ACP或其他脂肪酰基硫酯复合物还原为脂肪醇。FAR通过两个步骤催化这一反应，第一个步骤产生醛，第二个步骤产生相应的醇。因而，这些酶还采用醛作为底物。已经从几种植物克隆了FAR，包括希蒙得木、拟南芥、水稻和小麦，以及昆虫、哺乳动物、鸟类、鞭毛藻原生生物、浮游甲壳类生物和原核生物如水油海杆菌。
本文使用的术语“脱饱和酶”是指可以将脂肪酸脱饱和来产生目标单-或多-不饱和脂肪酸或其前体的酶。脂肪酸脱饱和酶以严格的区域选择性和立体选择性催化双键引入酰基链中。膜结合的脂肪酸脱饱和酶在真核生物和细菌中表达。这是个多样的家族，包括至少10种不同类型的区域选择性和链长度特异性，例如Δ4-Δ6，Δ8-Δ13和Δ15，包括Δ9。脱饱和酶基因包括来自酿酒酵母的OLE1，来自极北哲水蚤(Calanus hyperboreus)的ChDes9-1和ChDes9-2，以及来自希蒙得木的脱饱和酶。
本文使用的术语“蜡合成酶”或“蜡酯合成酶”可互换地使用，是指能够催化酰基-硫酯与脂肪醇组合成脂肪酸烃基酯(FAAE)的酶。野生型酵母不具有产生非常长链脂肪酸烃基酯(FAAE)的代谢机制。蜡合成酶催化前一反应，是生物体如不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、希蒙得木、水油海杆菌的特征。
本文使用的术语“FAS”或“脂肪酸合成酶”是酶系统，其催化酰基链的起始和延伸，因而在从乙酰-辅酶A和丙二酰基-辅酶A开始的脂肪酸合成中起到关键作用。在酵母酿酒酵母中，脂肪酸通过2.4Mba多功能酶复合物合成，其具有由两个不连锁的基因FAS1和FAS2编码的两个亚基。产生非常长链(达到C26)脂肪酸的可选择的FAS系统包括，例如，来自分枝杆菌(Mycobacteria)的FAS。
在一般的方面，本发明涉及能产生VLCFA和/或VLCFA的遗传修饰的真菌细胞。在特定的实施方式中，所述真菌细胞是酵母细胞或霉菌细胞。
在某些实施方式中，酿酒酵母可以是进行本发明的宿主，因为它是基础和应用研究中流行的宿主，也是很好的乙醇生产者，而乙醇是酯、特别是脂肪酸乙酯的前体。另外，本发明中有用的其他酵母细胞包括但不限于其他酵母菌属(Saccharomyces)物种，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)物种、毕赤氏酵母属(Pichia)物种、念珠菌属(Candida)物种、木霉属(Trichoderma)物种、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、油质毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、串珠红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，等。
在工业上对于使用有限数量的平台细胞工厂生产广泛的燃料和化学品十分感兴趣，因为这容许柔性使用生产设备，是非常资本密集的。这些平台细胞工厂之一是酵母酿酒酵母，其被广泛用于啤酒、面包、葡萄酒、生物乙醇、营养物、化学品和药物的生产。这些平台细胞工厂可以有效地转化原料，当今一般是从淀粉或蔗糖得到葡萄糖/果糖，但将来还可从木质纤维素得到戊糖，成为所谓的前体代谢物，然后可以进一步转变为目标产物。
在本发明中，我们产生了酵母平台细胞工厂，其可以将脂肪酰基-辅酶A转化成非常长链脂肪酸衍生物。酵母酿酒酵母不会天然积累非常长链脂肪酸，同时难以引入从脂肪酰基-辅酶A到非常长链脂肪酸衍生物的高效率的途径，本发明的发明人鉴定了这种引入的可能的路线。下文描述了重建这种从脂肪酰基-辅酶A到非常长链脂肪酸衍生物的合成途径的策略，产生了用于生产非常长链脂肪酸衍生物，例如，脂肪酸，如芥子酸，神经酸，脂肪醇，如二十二醇和蜡质，如希蒙得木油，更正确地说希蒙得木酯或西蒙得木蜡酯的细胞工厂。
本发明的遗传修饰的真菌细胞，优选的酵母，包含一个或更多个遗传修饰来改善期望的非常长链脂肪酸衍生物的生产。这样的修饰可以包括，但不限于，导入新的酶，和/或生物合成和/或代谢途径，和/或异源表达一种或更多种基因(参见图1)。另外，改善非常长链脂肪酸衍生物生产的这些修饰还包括消除或降低非必要的途径，或与非常长链脂肪酸衍生物生产竞争的途径。
因而，实施方式的一个方面涉及能够生产非常长链脂肪酸(VLCFA)和/或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。在这个方面，遗传修饰的真菌细胞包含至少一个编码脂肪酰-辅酶A还原酶的外源基因。在这个方面，所述遗传修饰的真菌细胞还包含i)至少一个编码延伸酶的基因，和/或至少一个编码脂肪酸合成酶的基因。
所述至少一个编码延伸酶的基因是编码延伸酶的过量表达的内源基因和/或编码延伸酶的外源基因。相应地，所述至少一个编码脂肪酸合成酶的基因是编码脂肪酸合成酶的过量表达的内源基因和/或编码脂肪酸合成酶的外源基因。
在一个实施方式中，所述至少一个编码脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)的外源基因选自由来自意大利蜂的FAR(AmFAR)、来自水油海杆菌VT8的FAR(MaFAldhR)、来自希蒙得木的FAR(SciFAR)、来自小麦(Triticum aestivum)的FAR(TaFAR)、来自拟南芥的FAR(At5FAR)、来自栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)DG893的FAR、来自附着海杆菌(Marinobacter adhaerens)HP 15的FAR、来自浆果紫杉(Taxus baccata)的FAR、来自纤细眼虫的FAR、来自稻(Oryza sativa)的FAR、来自原鸡(Gallus gallus)的FAR、来自稠李巢蛾(Yponomeuta evonymellus)的FAR、来自小家鼠(Mus musculus)的FAR，以及其密码子优化版本构成的组。
在一个实施方式中，所述至少一个编码延伸酶的基因包含编码选自由来自拟南芥的延伸酶(Fael)、来自芜菁甘蓝的β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)、来自海甘蓝的KCS(CaKCS)、来自希腊碎米芥(Cardamine graeca)的KCS(CgKCS)、来自银扇草的KCS(LaKCS)、来自希蒙得木的KCS(SciKCS)、来自旱金莲的KCS(TmKCS)和其密码子优化的版本构成的组的延伸酶的外源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，以及所述至少一个编码延伸酶的基因包含过量表达的内源基因，所述内源基因编码选自以下构成的组的来自延伸酶系统的酶：β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)(Elo1和/或Elo2)、β-酮脂酰-辅酶A还原酶(YBR159W)、β-羟基酰基-辅酶A脱水酶(Phs1)和烯酰基-辅酶A还原酶(Tsc13)。这个实施方式可以与上文描述的、涉及编码延伸酶的外源基因的实施方式组合。在这样的情况下，酿酒酵母细胞包含至少一个编码延伸酶的外源基因以及至少一个编码来自所述延伸酶系统的酶的内源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含外源基因，所述外源基因编码选自以下构成的组的来自延伸酶系统的酶：拟南芥还原酶(CER10，KCR1)和脱水酶，以及其密码子优化的版本。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是被遗传修饰以降低编码Elo3的基因的表达和/或敲除编码Elo3的基因的酿酒酵母细胞。
在一个实施方式中，所述至少一个编码脂肪酸合成酶的基因包含外源基因，所述外源基因编码选自以下构成的组的脂肪酸合成酶(FAS)：来自母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)的FAS、来自迪尔诺弗分枝杆菌(Mycobacterium diernhoferi)41002的FAS、来自新金分支杆菌(Mycobacterium neoaurum)的FAS、来自副偶发分支杆菌(Mycobacterium parafortuitum)PA-1的FAS、来自细胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellular)的FAS、来自串珠红冬孢酵母的FAS，以及其密码子优化的版本。在一个实施方式中，所述外源基因是编码脂肪酸合成酶1(Fas1)的基因的进化版本和/或编码脂肪酸合成酶2(Fas2)的基因的进化版本。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，以及所述至少一个编码脂肪酸合成酶的基因包含编码脂肪酸合成酶1(Fas1)和/或脂肪酸合成酶2(Fas2)或其进化版本的过量表达的内源基因。这个实施方式可以与上文描述的、涉及编码脂肪酸合成酶的外源基因的实施方式组合。在这样的情况下，所述酿酒酵母细胞包含至少一个编码脂肪酸合成酶的外源基因和至少一个编码脂肪酸合成酶的内源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞包含至少一个编码脂肪酸合成酶的基因和编码酰基-载体蛋白的基因，例如母牛分枝杆菌酰基-载体蛋白合成酶。
在具体的实施方式中，所述真菌细胞包含编码来自拟南芥的脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)(At5FAR)的外源基因，和编码β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)的过量表达的Elo2基因。此外所述真菌细胞优选地是被遗传修饰以降低编码Elo3的基因的表达和/或敲除编码Elo3的基因的酿酒酵母细胞。
在另一个特定的实施方式中，所述酿酒酵母细胞进一步包含编码乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)的外源基因或过量表达的内源基因，以及编码KCS的过量表达的Elo1基因。所述酿酒酵母细胞优选地被遗传修饰以敲除编码半乳糖激酶的gal1基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码蜡合成酶的外源基因。
在一个实施方式中，所述至少一个编码所述蜡合成酶(WS)的基因选自以下构成的组：来自不动杆菌ADP1的蜡合成酶(AbWS)、来自拟南芥的蜡合成酶(AtWS)、来自纤细眼虫的蜡合成酶(EgWS)、来自除烃海杆菌DSM 8798的蜡合成酶(MhWS)、来自希蒙得木的蜡合成酶(SciWS)、来自水油海杆菌VT8的蜡合成酶，以及其密码子优化的版本。
在具体实施方式中，所述真菌细胞包含编码来自水油海杆菌VT8的脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)(MaFAldhR)的外源基因，或其密码子优化的版本，编码选自以下构成的组的蜡合成酶(WS)的外源基因：来自拟南芥的蜡合成酶(AtWS)、来自纤细眼虫的蜡合成酶(EgWS)、来自希蒙得木的蜡合成酶(SciWS)，或其密码子优化的版本；以及编码β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)的过量表达的Elo2基因。
所述真菌细胞优选地是酿酒酵母细胞。所述酿酒酵母细胞优选地进一步包含编码乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)的外源基因或过量表达的内源基因，并且被遗传修饰以降低编码Elo3的基因的表达和/或敲除编码Elo3的基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码脱饱和酶的基因。所述至少一个编码脱饱和酶的基因是过量表达脱饱和酶的内源基因和/或编码脱饱和酶的外源基因。
在一个实施方式中，所述至少一个编码脱饱和酶的基因包含编码选自以下构成的组的脱饱和酶的外源基因：来自希蒙得木的脱饱和酶(SciFAD)、来自极北哲水蚤的脱饱和酶(ChDes9-1和/或ChDes9-2)，以及其密码子优化的版本。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，以及所述至少一个编码脱饱和酶的基因包含编码Δ9-脱饱和酶(Ole1)的过量表达的内源基因。这个实施方式可以与上文描述的、涉及编码脱饱和酶的外源基因的实施方式组合。在这样的情况下，所述酿酒酵母细胞包含至少一个编码脱饱和酶的外源基因和至少一个编码脱饱和酶的内源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含编码乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)的过量表达的内源编码，优选的ACC1或具有乙酰-辅酶A羧化酶活性的其突变形式或进化版本。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码长链脂肪酰基-辅酶A合成酶的外源基因，优选地选自由拟南芥LACS1、LACS2、LACS3以及其密码子优化的版本构成的组。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码非磷酸化NADP+依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPN)，优选的来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的GAPN的外源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码磷酸酮酶，优选的来自构巢曲霉的磷酸酮酶(xpkA和/或ack)的外源基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，其被遗传修饰以降低编码NADP-依赖性谷氨酸脱氢酶的基因GDH1的表达和/或敲除该基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞是酿酒酵母细胞，其被遗传修饰以过量表达编码NAD-依赖性谷氨酸脱氢酶的内源GDH2基因。
在一个实施方式中，所述真菌细胞被遗传修饰以降低选自以下构成的组的非必需途径基因的表达和/或敲除：酰基-辅酶A:固醇酰基转移酶(ARE1，ARE2)、甘油二酯酰基转移酶(DGA1)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LRO1)、脂肪酰基-辅酶A氧化酶(POX1)、Elo3、Fat1、Faa1和Faa4。
在一个实施方式中，所述真菌细胞进一步包含至少一个编码选自以下构成的组的转运蛋白的外源基因：ATP-结合盒(ABC)蛋白、脂质传递蛋白(LTP)、脂肪酸转运体(FATP)和植物蜡酯转运蛋白，优选地选自由ABCG11、ABCG12、LTPG1和/或LTPG2构成的组。
实施方式的另一个方面涉及能够生产VLCFA或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。所述遗传的真菌细胞包含至少一个编码分支杆菌属脂肪酸合成酶的基因。
在一个实施方式中，所述至少一个编码所述分支杆菌属脂肪酸合成酶(FAS)的基因选自由编码来自牡牛分枝杆菌的FAS的基因、编码来自迪尔诺弗分枝杆菌41002的FAS的基因、编码来自新金分支杆菌的FAS的基因、编码来自副偶发分支杆菌PA-1的FAS的基因、编码来自胞内分枝杆菌的基因，以及其密码子优化的版本构成的组。
在具体实施方式中，所述真菌细胞是被遗传修饰以降低编码Elo2和Elo3的基因的表达和/或敲除编码Elo2和Elo3的基因的酿酒酵母细胞。所述酿酒酵母细胞还包含编码母牛分枝杆菌脂肪酸合成酶的基因，和编码母牛分枝杆菌酰基-载体蛋白合成酶的基因。
在另一个或另外的具体实施方式中，所述真菌细胞或酿酒酵母细胞还包含至少一个编码脱饱和酶的基因。所述至少一个编码脱饱和酶的基因是过量表达脱饱和酶的内源基因和/或编码脱饱和酶的外源基因。编码脱饱和酶的外源基因(SciFAD、ChDes9-1、ChDes9-2)和内源基因(Ole1)的早先描述的优选实例也可以应用于当前的具体实施方式。
在一个实施方式中，各种实施方式的真菌细胞优选地是遗传修饰的酵母细胞，更优选的遗传修饰的酿酒酵母细胞或遗传修饰的解脂耶氏酵母细胞。
实施方式的又一个方面涉及能够生产非常长链脂肪酸(VLCFA)和/或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。在这个方面，所述遗传修饰的真菌细胞包含至少一个编码延伸酶的基因和至少一个编码脱饱和酶的基因。所述至少一个编码延伸酶的基因是编码延伸酶的过量表达的内源基因和/或编码延伸酶的外源基因。相应地，所述至少一个编码脱饱和酶的基因是过量表达脱饱和酶的内源基因和/或编码脱饱和酶的外源基因。
这样的延伸酶和脱饱和酶的优选的实例可以选自本文描述的实施方式。
实施方式的再一个方面涉及能够生产非常长链脂肪酸(VLCFA)和/或VLCFA衍生物的遗传修饰的真菌细胞。在这个方面，所述遗传修饰的真菌细胞包含至少一个编码脂肪酸合成酶的基因和至少一个编码脱饱和酶的基因。所述至少一个编码脂肪酸合成酶的基因是编码脂肪酸合成酶的过量表达的内源基因和/或编码脂肪酸合成酶的外源基因。相应地，所述至少一个编码脱饱和酶的基因是过量表达脱饱和酶的内源基因和/或编码脱饱和酶的外源基因。
这样的脂肪酸合成酶和脱饱和酶的优选的实例可以选自本文描述的实施方式。实施方式的进一步的方面涉及生产VLCFA和/或VLCFA衍生物的方法。所述方法包括在培养基中培养根据任一实施方式的遗传修饰的真菌细胞。所述方法还包括从所述遗传修饰的真菌细胞和/或从所述培养基分离所述VLCFA和/或VLCFA衍生物。
在一个实施方式中，培养所述遗传修饰的真菌细胞包括在培养基中培养遗传修饰的真菌细胞，所述遗传修饰的真菌细胞包含本文描述的脂肪酰-辅酶A还原酶、延伸酶和/或脂肪酸合成酶。在这个实施方式中，分离所述VLCFA和/或VLCFA衍生物包括从所述遗传修饰的真菌细胞和/或从所述培养基分离非常长链脂肪醇，优选的二十二醇，更优选的N-二十二醇C22:0。
在一个实施方式中，培养所述遗传修饰的真菌细胞包括在培养基中培养遗传修饰的真菌细胞，所述遗传修饰的真菌细胞包含本文描述的脂肪酰-辅酶A还原酶、蜡合成酶、延伸酶和/或脂肪酸合成酶。在这个实施方式中，分离所述VLCFA和/或VLCFA衍生物包括从所述遗传修饰的真菌细胞和/或从所述培养基分离蜡酯。所述蜡酯优选地是C16:0或C16:1直到C28:0或C28:1脂肪醇和C16:0或C16:1直到C28:0或C28:1脂肪酸的蜡酯。
在一个实施方式中，培养所述遗传修饰的真菌细胞包括在培养基中培养遗传修饰的真菌细胞，所述遗传修饰的真菌细胞包含本文描述的分支杆菌属脂肪酸合成酶。在这个实施方式中，分离所述VLCFA和/或VLCFA衍生物包括从所述遗传修饰的真菌细胞和/或从所述培养基分离非常长链脂肪酸，优选的芥子酸和/或神经酸。
本发明的一个目标是生产非常长链脂肪酸衍生物如非常长链脂肪醇或蜡酯。在第一个步骤中，通过酵母内在的或异源的延伸酶系统，或异源或进化的FAS系统，脂肪-酰基-辅酶A(C16:0，C18:0)被延长成非常长链脂肪-酰基-辅酶A，例如，C22:0。在第二个步骤中，这些非常长链脂肪-酰基-辅酶A通过异源表达的FAR酶还原成相应的非常长链脂肪醇。所述非常长链脂肪酸和产生的非常长链脂肪醇通过表达异源蜡酯合成酶组成成相应的非常长链蜡酯。
在一个实施方式中，本发明提供了遗传修饰的酵母，其包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自酿酒酵母、拟南芥、希蒙得木、芜菁甘蓝、海甘蓝、浆果紫杉等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，其中所述酵母产生至少一种脂肪醇，例如，二十二醇，优选的N-二十二醇C22:0。
在具体实施方式中，所述延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，是酵母、植物、昆虫或原核的延伸酶。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码酵母延伸酶Elo1和/或Elo2的基因，包括但不限于来自酿酒酵母的。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Fas1或Fas2和/或其突变体的基因。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个或更多个编码酿酒酵母延伸酶系统的不同部件的基因，包括但不限于延伸酶，例如，KCS、3-酮酰基-辅酶A还原酶、烯酰基-辅酶A还原酶、3-羟基酰基-辅酶A脱水酶。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个或更多个编码来自植物的部分或完整延伸酶系统的外源基因，包括相应的延伸酶、还原酶和脱水酶。
在具体实施方式中，衍生自意大利蜂、拟南芥、水油海杆菌的脂肪还原酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自分支杆菌属的FAS和/或酵母进化的FAS是优选的。
在具体实施方式中，来自酿酒酵母、拟南芥、芜菁甘蓝、海甘蓝、银扇草(LaKCS)、希蒙得木的延伸酶是优选的。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产重组微生物的方法，所述重组微生物包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、希蒙得木、芜菁甘蓝、海甘蓝、浆果紫杉等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，其中所述酵母产生至少一种脂肪醇，例如，二十二醇，优选的N-二十二醇C22:0。
本发明的另一个目标是生产非常长链脂肪酸衍生物如非常长链脂肪酸。在第一个步骤中，脂肪-酰基-辅酶A(C16:0，C18:0)被脱饱和成优选的C18:1，并延长成非常长链脂肪-酰基-辅酶A，例如，C22:1，通过酵母内在的或异源的延伸酶系统，或异源或进化的FAS系统。在第二个步骤中，通过内在的硫酯酶或通过异源磷脂酶的过量表达，VLCF酰基-辅酶A被修饰成游离VLCFA，所述异源硫酯酶例如哺乳动物ACOT基因，例如，智人(Homo sapiens)ACOT2(基因库：NP006812.3)、智人ACOT9(基因库：NP_001028755.2)、褐家鼠(Rattus norvegicus)ACOT2(基因库：NP_620262.2)或褐家鼠ACOT1(基因库：NP_112605.1)
在一个实施方式中，本发明提供了遗传修饰的酵母，其包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)脱饱和酶，例如来自酿酒酵母、希蒙得木、极北哲水蚤等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，芥子酸，优选的C22:1或神经酸，C24:1。
在具体实施方式中，所述延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，是酵母、植物、昆虫或原核的延伸酶。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码酵母延伸酶Elo1和/或Elo2的基因，包括但不限于来自酿酒酵母的。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Fas1或Fas2和/或其突变体的基因。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个或更多个编码酿酒酵母延伸酶系统的不同部件的基因，包括但不限于延伸酶，例如，KCS、3-酮酰基-辅酶A还原酶、烯酰基-辅酶A还原酶、3-羟基酰基-辅酶A脱水酶。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个或更多个编码来自植物的部分或完整延伸酶系统的外源基因，包括相应的延伸酶、还原酶和脱水酶。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Ole1、ChDes9_2或其他脱饱和酶的脱饱和酶基因。
在具体实施方式中，衍生自分支杆菌属的FAS和/或酵母进化的FAS是优选的。
在具体实施方式中，来自酿酒酵母、拟南芥、芜菁甘蓝、海甘蓝、银扇草(LaKCS)、希蒙得木的延伸酶是优选的。
在具体实施方式中，来自酿酒酵母的脱饱和酶是优选的。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产重组微生物的方法，所述重组微生物包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)脱饱和酶，例如来自酿酒酵母、希蒙得木、极极北哲哲水蚤等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，芥子酸，优选的C22:1或神经酸，C24:1。
本发明的又一个目标是生产非常长链脂肪酸衍生物如蜡酯。
在一个实施方式中，本发明提供了遗传修饰的酵母，其包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、埃氏海杆菌(Marinobacter aquaeoli)、栖藻海杆菌、附着海杆菌、希蒙得木、小麦、拟南芥、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(b)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌DSM 8798、希蒙得木和水油海杆菌VT8.、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、分枝杆菌、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，蜡酯，优选的具有C16(C16):1直到C28(C28):1作为脂肪醇(A侧)和C16(C16):1直到C28(C28):1作为脂肪酸(B侧)。
在具体实施方式中，衍生自意大利蜂、拟南芥、水油海杆菌的脂肪还原酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自拟南芥、希蒙得木、纤细眼虫的蜡酯合成酶是优选的。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产重组微生物的方法，所述重组微生物包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、埃氏海杆菌、栖藻海杆菌、附着海杆菌、希蒙得木、小麦、拟南芥、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(b)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌、希蒙得木、水油海杆菌、醋酸钙不动杆菌、分枝杆菌、天蓝色链霉菌等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，蜡酯，优选的具有C16(C16):1直到C28(C28):1作为脂肪醇(A侧)和C16(C16):1直到C28(C28):1作为脂肪酸(B侧)。
在进一步的实施方式中，本发明提供了遗传修饰的酵母，其包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、或海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP 15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(c)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌DSM 8798、希蒙得木和水油海杆菌VT8、醋酸钙不动杆菌、分枝杆菌、天蓝色链霉菌等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，优选的以C22(C20):1作为脂肪醇(A侧)和C20(C22):1作为脂肪酸(B侧)。
在具体实施方式中，衍生自意大利蜂、拟南芥、水油海杆菌的脂肪还原酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自拟南芥、希蒙得木、纤细眼虫的蜡酯合成酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自分支杆菌属的FAS和/或酵母进化的FAS是优选的。
在具体实施方式中，衍生自酿酒酵母、拟南芥、芜菁甘蓝、海甘蓝、银扇草(LaKCS)、希蒙得木的延伸酶是优选的。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产重组微生物的方法，所述重组微生物包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、或海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP 15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(c)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌DSM 8798、希蒙得木和水油海杆菌VT8、醋酸钙不动杆菌、分枝杆菌、天蓝色链霉菌等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，优选的以C22(C20):1作为脂肪醇(A侧)和C20(C22):1作为脂肪酸(B侧)。
在又一个实施方式中，本发明提供了遗传修饰的酵母，其包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP 15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(c)脱饱和酶，例如，来自酿酒酵母、希蒙得木、北极极北哲水蚤等，以及(d)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌DSM 8798、希蒙得木和水油海杆菌VT8、醋酸钙不动杆菌、分枝杆菌、天蓝色链霉菌等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，希蒙得木油，优选的以C22(C20):1作为脂肪醇(A侧)和C20(C22):1作为脂肪酸(B侧)。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码来自希蒙得木的植物脱饱和酶的外源基因。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码来自酿酒酵母的脱饱和酶的基因。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码来自极北哲水蚤的ChDes9-1脱饱和酶的基因。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括延伸酶、FAS和/或FAR，如早先与非常长链脂肪醇和非常长链脂肪酸的生产相关联举例说明的。
在具体实施方式中，衍生自意大利蜂、拟南芥、水油海杆菌的脂肪还原酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自拟南芥、希蒙得木、纤细眼虫的蜡酯合成酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自分支杆菌属的FAS和/或酵母进化的FAS是优选的。
在具体实施方式中，衍生自酿酒酵母、拟南芥、芜菁甘蓝、海甘蓝、银扇草(LaKCS)、希蒙得木的延伸酶是优选的。
在具体实施方式中，衍生自酿酒酵母的脱饱和酶是优选的。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产重组微生物的方法，所述重组微生物包括一个或更多个外源基因，所述外源基因编码：(a)延伸酶，或延伸酶系统的不同组件，例如，来自拟南芥、或希蒙得木、浆果紫杉、芜菁甘蓝、海甘蓝等，和/或脂肪酸合成酶(FAS)系统，例如，来自串珠红冬孢酵母、酿酒酵母、分枝杆菌等，以及(b)非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，例如，来自意大利蜂、水油海杆菌VT8、希蒙得木、小麦、拟南芥、栖藻海杆菌DG893、附着海杆菌HP 15、浆果紫杉、纤细眼虫、稻、原鸡、稠李巢蛾、小家鼠等，以及(c)脱饱和酶，例如，来自酿酒酵母、希蒙得木、北极极北哲水蚤等，以及(d)蜡合成酶，例如，来自不动杆菌、拟南芥、纤细眼虫、除烃海杆菌DSM 8798、希蒙得木和水油海杆菌VT8、醋酸钙不动杆菌、分枝杆菌、天蓝色链霉菌等，其中所述酵母产生至少一种脂肪酸衍生物，例如，希蒙得木油，优选的以C22(C20):1作为脂肪醇(A侧)和C20(C22):1作为脂肪酸(B侧)。
在本发明的其他方面，本发明的遗传修饰的酵母可以被进一步修饰以表达异源脂肪酸生物合成多肽，用于提高脂肪酸衍生物的产量。编码这样的异源多肽的基因的非限制性实例包括ACC1、gapN，例如衍生自变异链球菌(Streptococcus mutans)，OLE1，和衍生自拟南芥的LACS1、LACS2、LACS3。
NADPH是脂肪酸合成中的辅助因子。为了提高NADPH用于脂肪酸生物合成的可用性，本发明的遗传修饰的酵母可以被进一步修饰以异源表达非磷酸化NADP+-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPN)，例如，来自变异链球菌的，或磷酸酮酶途径。在其他方面，酵母可以被修饰以破坏编码NADP依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH1。在再其他的实施方式中，本发明的酵母可以被进一步修饰以过量表达编码NAD依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH2。这些实施方式的组合也是可能的，即，所述酵母被修饰以i)异源表达非磷酸化NADP+依赖性GAPN，ii)破坏编码NADP依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH1，和/或iii)过量表达编码NAD依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH2。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括表达至少一个编码乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)的基因，包括但不限于ACC1以及早先描述的(Shi等人，2014)其突变形式，以提高丙二酰基-辅酶A的前体供应，用于非常长链脂肪酸的生产。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括异源表达至少一个编码系统的基因，以提高用于延伸和还原反应的NADPH供应，包括但不限于表达GAPN，或磷酸酮酶途径，例如来自构巢曲霉的(异源表达xpkA和ack)。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括异源表达至少一个编码脱饱和酶的基因，以提高Δ9不饱和非常长链脂肪酸的生产，包括芥子酸、神经酸和希蒙得木油的前体。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括异源表达一个或更多个衍生自拟南芥的LACS1、LACS2、LACS3的基因，以促进-辅酶A对长链脂肪酸的活化。在产生非常长链脂肪醇和蜡酯方面，这对于随后由还原酶和蜡酯合成酶催化的反应是重要的。
这些特定实施方式的组合也是可能的，处于实施方式的范围之内。
在本发明的进一步的方面，本发明的酵母菌株可以另外地或作为选择地包含取消或降低非必需途径的遗传修饰。这样的修饰可以取消或降低重组酵母菌株中与脂肪酸衍生物如脂肪醇、脂肪酸烃基酯等的生产相竞争的酶或途径对脂肪酸的利用或消耗。这样的非必需途径的示范性的实施方式可以包括但不限于存储脂质(三酰基甘油，TAGs；固醇酯，SEs)形成，β-氧化。在特定的实施方式中，存储脂质形成可以通过破坏编码例如酰基-辅酶A:固醇酰基转移酶(ARE1，ARE2)、甘油二酯酰基转移酶(DGA1)和/或卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LRO1)的基因来消除或降低。在其他实施方式中，β-氧化可以通过破坏编码例如脂肪酰基-辅酶A氧化酶(POX1)的基因来消除或降低。在又一个实施方式中，本发明的重组酵母菌株可以具有一种或更多种其他酶的降低的表达或活性，所述酶降低期望的脂肪酸衍生产物的生物合成，包括但不限于编码Ole1、Elo3、Fat1、Faa1和Faa4的基因。
因此，在具体实施方式中，所述重组酵母包括来自竞争途径的至少一个基因的降低表达和/或敲除，包括但不限于TAGs、SEs、β-氧化。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Ole1的基因的降低表达和/或敲除，以提高饱和脂肪酸和非常长链脂肪酸如二十二醇的生产。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Fas1的基因的降低表达和/或敲除，例如，通过将酵母FAS1基因置于启动子如pHXTl之下。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Elo3的基因的降低表达和/或敲除，以容许积累C22。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Fat1的基因的降低表达和/或敲除，以容许积累C24的非常长链脂肪酸。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括至少一个编码Faa1和/或Faa4的基因的降低表达和/或敲除。
上述例举的基因敲除或表达降低的组合是可能的，处于实施方式的范围之内。
在具体实施方式中，所述重组酵母是JV03菌株(MATa MAL2-8C SUC2 ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δ pox1Δ)。
上文例举的异源基因表达和基因敲除的组合也是可能的，处于实施方式的范围之内。
在具体实施方式中，所述重组酵母包括表达编码乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)的基因，包括但不限于ACC1和(Shi等人，2014)早先描述的其突变形式，与Elo3的敲除组合。
转运体蛋白，例如，ATP-结合盒(ABC)蛋白可以导入包括外源脂肪酰-辅酶A还原酶基因、脂肪醛还原酶基因或羧酸还原酶基因的宿主中。例如，拟南芥属的ABC转运体如ABCG11和/或ABCG12，以及脂质传递蛋白(LTP)如LTPG1和LTPG2可以导入宿主细胞中。在某些实施方式中，来自包括果蝇(Saccharomyces、Drosophila)、分枝杆菌或哺乳动物物种的物种的脂肪酸转运体(FATP)基因可以导入宿主细胞中。在某些实施方式中，转运体蛋白提高释放到微生物生长培养基中的脂肪醇或脂肪醇衍生物的数量。在某些实施方式中转运体蛋白的表达还可以提高宿主菌株的脂肪醇或脂肪醇衍生物生产。本发明的一个实施方式利用植物蜡酯转运体。例如，拟南芥属的ABCG12/CER5促进非常长链醛、酮、醇、烷烃、酯和其他可能的脂肪酸衍生物的输出。
因此，在具体实施方式中，所述重组酵母包括异源表达至少一个编码ABCG11、ABCG12、LTPG1和/或LTPG2的基因。
同时，编码内在的酵母转运体，包括ABC转运体如ABCG11和ABCG12的基因可以被删除，以避免特定目标产物的分泌和提高细胞内积累。
本发明的其他方面提供了在遗传修饰的酵母中生产VLCFA衍生物的方法，包括培养本发明的遗传修饰的酵母和从微生物或生长培养基分离至少一种VLCFA衍生物，例如非常长链脂肪酸、非常长链脂肪醇和/或蜡酯。
因此，在一个实施方式中，所述方法包括培养包括至少一个外源基因的微生物，所述外源基因编码延伸酶或脂肪酸合成酶(FAS)系统和非常长链脂肪酸还原酶，例如脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)，其提高释放到培养基中的非常长链脂肪醇产物的数量，以及从所述微生物或生长培养基分离至少一种非常长链脂肪醇。
在具体实施方式中，所述脂肪醇是二十二醇，优选的N-二十二醇C22:0。
在另一个实施方式中，所述方法包括培养包括至少一个外源基因的微生物，所述外源基因编码延伸酶或脂肪酸合成酶(FAS)系统和脱饱和酶，其提高释放到培养基中的非常长链脂肪酸的数量，以及从所述微生物或生长培养基分离至少一种非常长链脂肪酸。
在具体实施方式中，所述脂肪酸是芥子酸，优选的C22:1，或神经酸，C24:1。
在又一个实施方式中，所述方法包括培养包括至少一个外源基因的微生物，所述外源基因编码非常长链脂肪酸还原酶，例如，脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和蜡合成酶，其提高释放到培养基中的蜡酯的数量，以及从所述微生物或生长培养基分离至少一种蜡酯。
在又一个实施方式中，所述方法包括培养包括至少一个外源基因的微生物，所述外源基因编码延伸酶或脂肪酸合成酶(FAS)系统、非常长链脂肪酸还原酶，例如脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和蜡合成酶，其提高释放到培养基中的蜡酯的数量，以及从所述微生物或生长培养基分离至少一种蜡酯。
在又一个实施方式中，所述方法包括培养包括至少一个外源基因的微生物，所述外源基因编码延伸酶或脂肪酸合成酶(FAS)系统、非常长链脂肪酸还原酶，例如脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)、脱饱和酶和蜡合成酶，其提高释放到培养基中的蜡酯的数量，以及从所述微生物或生长培养基分离至少一种蜡酯。
在具体实施方式中，所述蜡酯是希蒙得木油，优选地包含C22(C20):1作为脂肪醇(A侧)和C20(C22):1作为脂肪酸(B侧)。
现在将参考以下的实施例描述本发明。应该理解的是，这些实施例不意图限制本发明的权利要求的范围，而是某些实施方式的示范。熟练的技术人员想到的所述例举的方法中的任何改变都将落入本发明的范围。
实施例
在下文的实施例中将引述一些引物、核苷酸和/或蛋白质序列，这些引物、核苷酸和/或蛋白质序列位于表4中。
实施例1
酿酒酵母中组合了异源还原酶(AmFAR、MaFAldhR、SciFAR或TaFAR)和蜡酯合成酶(AbWS、AtWS、EgWS或SciWS)的蜡酯生物合成途径的表达
这个实施例包括通过异源表达脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和蜡酯合成酶(WS)的不同组合在酿酒酵母的菌株中形成蜡酯。FAR负责基于脂肪酰基-辅酶A形成脂肪醇，WS催化所形成的醇与第二个脂肪酰基-辅酶A分子的酯化作用(参见图2)。将两种酶的不同组合克隆到表达载体pSP-GM2(SEQ ID NO：1，质粒ID 1)(Partow等人，2010)中，转化入酵母菌株CEN.PK 113-5D(MATa MAL2-8c SUC2ura3-52)、CEN.PK113-11C(MATa MAL2-8c SUC2his3Δ1ura 3-52)pox1Δ和JV03(MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δ pox1Δ)。还构建了带有空质粒pSP-GM2的对照菌株。
这项研究中测试的FAR包括来自意大利蜂(AmFAR)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：2；登记号ADJ56408)，水油海杆菌VT8(MaFAldhR)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：3；登记号YP959486)、希蒙得木(SciFAR)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：4；登记号AAD38039)、小麦(TaFAR)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：5；登记号CAD30692)、拟南芥(At5FAR)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：42)
另外，测试了来自拟南芥(At)的FAR1和FAR4(SEQ ID NO：6；登记号NP_197642.1和SEQ ID NO：7；登记号NP_190040.3)。此外，，来自栖藻海杆菌DG893(SEQ ID NO：8，登记号ZP01892457.1)和附着海杆菌HP15(SEQ ID NO：9；登记号ADP96574)的推定的还原酶，与水油海杆菌VT8蛋白(登记号YP959486)都有78％的同一性，也被包括在这项研究中。
这项研究中的WS包括来自不动杆菌ADP1(AbWS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：10；登记号ENV55676)、拟南芥(AtWS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：11；登记号NP_568547)、纤细眼虫(EgWS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：12；登记号ADI60058)、除烃海杆菌DSM 8798(MhWS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：13；登记号ABO21021)、希蒙得木(SciWS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：14；登记号AF149919)和水油海杆菌VT8(SEQ ID NO：15；登记号YP_957462)。
基因AmFAR、MaFAldhR、SciFAR、TaFAR、AtWS、EgWS和SciWS的密码子优化的序列获自金斯瑞(GenScript)(860Centennial Ave.，Piscataway，NJ 08854，U.S.)，在起始密码子ATG之前含有Kozak序列AAAAAA和基因两端有限制位点(FAR为NotI&SpeI，WS为BamHI&SalI)，克隆到pUC57载体(质粒ID 2)中。
在第一种方式中，编码AmFAR、MaFAldhR、SciFAR和TaFAR的基因通过限制酶NotI&SpeI克隆到pSP-GM2中，产生质粒pSV-GM2::AmFAR、pSV-GM2::MaFAldhR、pSV-GM2::SciFAR和pSP-GM2::TaFAR(质粒ID 3-6)。
编码WS AtWS、EgWS和SciWS的基因使用限制酶BamHI&SaiI从pUC57载体上切下，连接到用相应的限制酶切割的质粒pSPGM2::SciFAR和pSPGM2::TaFAR中。这产生质粒pSPGM2::SciFAR:AtWS，pSPGM2::SciFAR::EgWS，pSPGM2::SciFAR::SciWS，pSPGM2::TaFAR:AtWS，pSPGM2::TaFAR:EgWS和pSPGM2::TaFAR::SciWS(质粒ID7-12)。根据质粒pSPBl(密码子优化的AbWS基因克隆到pSP-GM2的HindIII&BamHI限制位点中)(质粒ID 13)和pSPB2N(密码子优化的MhWS基因克隆到pSP-GM2的NotI&SacI限制位点中)(质粒ID14)，基因AbWS和MhWS用特异性引物(SEQ ID NO：43-SEQ ID NO：46)扩增。
Gibson组装方法(Gibson等人，2009)(SEQ ID NO:47-SEQ ID NO:56)用于构建质粒pSPGM2::AmFAR::AbWS、pSPGM2::AmFAR::AtWS、pSPGM2:AmFAR::EgWS、pSPGM2::AmFAR::MhWS、pSPGM2::AmFAR::SciWS、pSPGM2::MaFAldhR::AbWS、pSPGM2::MaFAldhR::AtWS、pSPGM2::MaFAldhR::EgWS、pSPGM2::MaFAldhR::MhWS和pSPGM2::MaFAldhR::SciWS(质粒ID 15-24)。
所有质粒通过化学转化转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中。带有期望质粒的菌落通过菌落PCR(SEQ ID NO：57-SEQ ID NO：60)来验证。
在分离质粒和通过测序验证每个基因(SEQ ID NO：61-SEQ ID NO：76)(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)之后，通过化学转化(Gietz and Woods，2002)将它们转移到酵母菌株CEN.PK 113-5D(MATa MAL2-8C SUC2ura3-52)，CEN.PK113-11C(MATa MAL2-8c SUC2his3Δ1ura 3-52)pox1Δ和JV03(MATa MAL2-8C SUC2ura3-52are1Δdga1Δare2Δlro1Δpox1Δ)。
通过在新鲜的SD-Ura 2％葡萄糖平板上划线纯化，从每个生产者和对照菌株分离三个独立的克隆。通过菌落PCR(SEQ ID NO：51-SEQ ID NO：66)验证生产者的成功转化。每个克隆在SD-URA+2％葡萄糖培养基中5mL的前培养中生长2天，以0.05-0.1的OD600接种到250mL摇瓶中的25ml新鲜SD-URA+2％葡萄糖培养基中。培养物在30℃和200rpm下孵育。48h之后，通过在1000rcf下离心5分钟收集细胞团，用5mL磷酸盐缓冲液(10mM KH2PO4，pH 7.5)洗涤两次。脂质的提取如之前描述的进行，例外是最终样品溶解在己烷中(而不是氯仿/甲醇)(Khoomrung等人，2013)。随后，使用装备有ZB-5MS Guardian(L＝30m，ID 0.25mm，df＝0.25μm，Phenomenex)柱的气相色谱(Focus GC，ThermoScientific)质谱仪(DSQII ThermoScientific)分析2μl注射物。入口温度设置在280℃，氦(载体)气流为1ml/分钟不分流。起始烘箱温度设置到50℃，保持1分钟。然后温度以25℃/分钟升高到280℃。在第二个步骤中，温度以10℃/分钟提高到350℃，保持5分钟。物质传递线温度设置在250℃，离子源温度设置在250℃，进行50到650m/z的全扫描。
对照菌株(JV03pSP-GM2)和五个生产菌株(JV03pSP-GM2::AmFAR、JV03pSP-GM2::AmFAR::AbWS、JV03pSP-GM2::AmFAR::AtWS、JV03pSP-GM2::AmFAR::EgWS、JV03pSP-GM2::AmFAR::SciWS、JV03pSP-GM2::MaFAldhR::SciWS)的一个独立克隆的示范性的气相色谱图显示在图3和图5中。长链脂肪醇的生产(JV03pSP-GM2::AmFAR)和它们朝向蜡酯的消耗(JV03pSP-GM2::AmFAR::AtWS、JV03pSP-GM2::AmFAR::SciWS，JV03pSV-GM2::MaFAldhR::SciWS)在附图的图例中标出。图4显示了这些菌株中产生的脂肪醇的相对数量。
在这个实施例中，我们显示了通过不同组合的脂肪酰-辅酶A还原酶(FAR)和蜡酯合成酶(WS)的异源表达在酿酒酵母的菌株中蜡酯和脂肪醇的形成。显示了成功地产生一系列的蜡酯例如C16:0-C18:0和脂肪醇例如C16:0、C18:0、C18:1。
实施例2
酿酒酵母中各种β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)的异源表达来增强VLCFA合成和允许VLC脂肪醇和蜡酯的合成
在这个实施例中，异源表达的β-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS，FAE)基因被导入酿酒酵母中。它们的基因产物催化长链脂肪酸(LCFA)向VLCFA的延伸的第一个步骤(图6)。酿酒酵母拥有三种不同的内在的KCS酶：Elo1、Elo2和Elo3。Elo1负责C14:0到C16:0的延伸，Elo2负责延伸到C24，Elo3负责从C24到C26的延伸。由于酿酒酵母中检测到的主要脂肪酸是C14:1、C16:1和C18:1，可能的是假定Elo2和Elo3在酿酒酵母中是较低活性的。
为了增加VLCFA的池，都能产生VLCFA的来自酿酒酵母的内在的KCS Elo2(登记号NP009963.1)、来自希蒙得木的KCS(登记号AAC49186.1)或来自拟南芥的FAE1(登记号AAA70154.1)(Trenkamp等人，2004)、来自芜菁甘蓝的KCS(BnKCS)(登记号AF490459)、来自海甘蓝的KCS(CaKCS)(登记号AY793549)、来自希腊碎米芥的KCS(CgKCS)(登记号ACJ61778.1)、来自银扇草的KCS(LaKCS)(登记号EU871787)或来自旱金莲的KCS(TmKCS)(登记号AAL99199.1)在酿酒酵母中过量表达。同时，删除ELO3。通过使用自切割删除盒，含有KanMX作为标志物、侧翼为loxP位点，cre重组酶克隆在半乳糖可诱导启动子Vgali之后(Pan等人，2011)，产生CEN.PK 113-5D elo3Δ、CEN.PK113-11Cpox1Δ elo3Δ和JV03(MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1i8 poxΔ)elo3Δ的背景菌株。对于ELO3的基因特异性删除，扩增ELO3上游(SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：112)和下游(SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114)的500bp片段，通过Gibson克隆融合到删除盒的特定部分。
特别地，对于elo3基因的删除，方式类似于Agaphonov&Alexandrov 2014描述的。第一线性片段含有处在TEF启动子控制下的elo3区域上游502bp和KanMX标志物的部分(删除盒1)。第二线性片段含有KanMX标志物的部分、处在GAL启动子控制下的Cre重组酶和elo3区域下游的500bp(删除盒2)。KanMX标志物和Cre重组酶的侧翼是loxP位点。在通过同源重组在elo3基因座将两个片段整合到酿酒酵母的基因组中之后，在半乳糖培养基上诱导Cre重组酶，引起它自身的切除和KanMX标志物的切除，仅留下一个loxP序列在后方。用于扩增elo3的上游和下游区域和扩增删除盒的寡核苷酸在表1中示出(SEQ ID NO：111-SEQ ID NO：120)。elo3删除盒被用于构建菌株CEN.PK 113-5D elo3Δ，CEN.PK113-11C pox1Δ elo3Δ和JV03 elo3Δ。
除了删除elo3之外，编码酿酒酵母的突变的ACC1p**的基因，其包括位置659和1157的两个氨基酸取代S659A和S1157A(SEQ ID NO：27；登记号NP_014413.1)(Shi等人，2014)整合到CEN.PK 113-5D elo3Δ、CEN.PK113-11C pox1Δ elo3Δ和JV03 elo3Δ的基因组中，产生CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1**，CEN.PK113-11C pox1Δ elo3ΔACC1**和JV03 elo3Δ ACC1**。
对于这个整合，基于Jensen等人，2014中描述的质粒pCfB353，构建含有处在TEF启动子的控制下的AAC1**基因和用于选择的KanMX标志物的质粒(pCfB353::ACC1**)。在这个质粒中，ACC1**基因的侧翼是指导片段整合到染色体X的区域194944-195980中的区域。质粒通过NotI消化线性化，凝胶纯化期望的片段，通过化学转化转化到期望的酵母菌株中。用于验证ACC1**基因向酿酒酵母基因组整合的寡核苷酸在表1中列出(SEQ ID NO：121-SEQ ID NO：126)。
此外，通过在CEN.PK 113-5D elo3Δ和JV03elo3Δ的基因组中交换天然启动子和组成型活性TEF1启动子，产生菌株CEN.PK 113-5D elo3Δ::TEF-ELO2和JV03elo3Δ::TEF-ELO2，还构建了过量表达ELO2的背景菌株。通过使用(Jakociunas等人，2015)中描述的CRISPR/Cas9系统进行。
通过排序具体的酵母密码子优化基因，将这些组合通过Gibson克隆来克隆在pSP-GM2的组成型活性启动子和终止子控制之下，分别与实施例1和实施例3中描述的相应还原酶/蜡酯合成酶和脱饱和酶组合，产生过量表达KCS基因的候选者。
筛选与脱饱和酶组合的不同延伸酶
为了增加VLCFA的池，都能够产生VLCFA的、来自酿酒酵母的内在的KCS Elo2p(SEQ ID NO：16；登记号NP009963.1)、来自拟南芥的Fae1p(AtFae1p)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：17；登记号AAA70154.1)，来自芜菁甘蓝的KCS(BnKCS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：18；登记号AF490459)、来自海甘蓝的KCS(CaKCS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：19；登记号AY793549)、来自希腊碎米芥的KCS(CgKCS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：20；登记号ACJ61778.1)、来自银扇草的KCS(LaKCS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：21；登记号EU871787)、来自希蒙得木的KCS(SciKCS)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：22；登记号AAC49186.1)或来自旱金莲的KCS(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：23；登记号登记号AAL99199.1)在酿酒酵母中过量表达。KCS酶与酿酒酵母的内在的Δ9-脱饱和酶Ole1p(SEQ ID NO：24；登记号EIW10301.1)组合，来提高单不饱和的VLCFA的数量。来自酿酒酵母的内在的KCS Elo2另外与来自希蒙得木的截短的Δ9-脱饱和酶(SciFAD)(为酿酒酵母密码子优化：SEQ ID NO：25；登记号AAA33932.1)组合。
使用引物扩增编码Ole1p、SciFAD和不同KCS酶的基因，所述引物在ATG起始密码子前引入kozak序列和每个基因5'和3'的不同突出以分别与启动子和终止子序列相容(SEQ ID NO：77-SEQ ID NO：90)。用于扩增启动子pTPI、pTDH3、pHXT7、pPGK1和pTEF1，以及终止子pYX212t、FBA1t、CYC1t、TDH2t和ADH1t的引物在表4中列出(SEQ ID NO：91-SEQ ID NO：110)。
通过使用质粒主干pYX212(SEQ ID NO：26，质粒ID 25)和涉及感受态酵母细胞的电穿孔的模块途径工程化策略(Zhou等人，2012)，构建含有期望基因的质粒。所有质粒首先组装到酿酒酵母CEN.PK 113-5D中，然后通过使用Zymoprep酵母质粒小量制备II试剂盒(Nordic Biolabs)提取，转化到大肠杆菌DH5oli 113-5D中。在纯化质粒之后，通过限制分析和测序验证质粒。
产生的质粒是：pYX212::Ole1p、pYX212:Elo2、pYX212::Ole1p::Elo2、pYX212::SciFAD::Elo2、pYX212::AtFae1::Ole1、pYX212::BnKCS::Ole1、pYX212::CaKCS::Ole1、pYX212::CgKCS::Ole1、pYX212::LaKCS::Ole1、pYX212::SciKCS::Ole1和pYX212::TmKCS::Ole1(质粒ID 26-36)。最后，质粒转化到期望的酵母菌株中。制备酵母感受态细胞，根据醋酸锂/单链携带DNA/聚乙二醇方法(Gietz and Woods，2002)用1μg的质粒DNA转化。
在培养之后，使用实施例1中描述的相同条件分析样品。结果在图17中显示，比较了特定的对照，和在菌株背景CEN.PK 113-5D Δelo3 ACC1**中与酿酒酵母衍生的脱饱和酶OLE1的过量表达相组合的、过量表达ELO2、AtFAE1(拟南芥)、BnKCS(芜菁甘蓝)、CaKCS(海甘蓝)、LaKCS(银扇草)、ScFAE(希蒙得木)、TmKCS(旱金莲)的菌株。
我们显示了，通过延伸酶(KCS)与酿酒酵母衍生的脱饱和酶OLE1过量表达的不同组合，在酿酒酵母菌株中形成非常长链脂肪酸。当比较特定的对照菌株(CEN.PK113-11C、CEN.PK 113-5D Δelo3 ACC1**)时，清楚的是，C20:0、C20:1、C22:0、C22:1、C24:0、C24:1、的非常长链脂肪酸的水平变为可检测，并且实质性提高(图17)。
At5FAR的二十二醇生产
这项研究中测试的FAR包括来自拟南芥的FAR1(为酵母密码子优化：SEQ ID NO：42)。
基因At5FAR的密码子优化的序列获自金斯瑞(860Centennial Ave.，Piscataway，NJ08854，U.S.)，含有紧挨起始密码子ATG之前的Kozak序列AAAAAA，每个侧面含有30bp突出，用于使用引物(SEQ ID NO：179-SEQ ID NO：180)通过Gibson克隆亚克隆至pSPGM2-ELO2的TEF1启动子和CYC1终止子之间，产生pSPGM2:At5FAR:ELO2。质粒pSPGM2:At5FAR:ELO2转化到以下酵母菌株中：JV03 Δelo3菌株。转化酵母菌株，使用实施例1中描述的相同条件通过GC-MS进行分析。对照菌株(JV03 Δelo3 pELO2)和生产菌株(JV03 Δelo3 pELO2 pAt5FAR)的一个独立克隆的二十二醇生产在图14中示出。在此我们显示了在酵母菌株JV03 Δelo3 pELO2 pAt5FAR中达到1.2mg/L滴度的成功的二十二醇生产。
二十二醇的高水平生产
通过使用引物(SEQ ID NO：204-205)在IMX581菌株中向染色体中整合来替换酵母的基因gal1，进行ACC1**的过量表达，产生菌株IMX581pACC1**。通过使用(Jakociunas等人，2015)中描述的CRISPR/Cas9系统进行。
利用早先描述的模块式途径工程化策略(Zhou等人，2012)将高水平生产二十二醇的途径组装到酵母染色体中。整个途径分成DS1，2的三个模块。更详细地，通过融合ELO3-up、TDH2t、ELO1、GAL7p、CYC1t和ELO2的DNA部分，来组装ELO3(up)+(TDH2t-ELO1-GAL7p)+CYC1t+ELO2的DS1模块。使用引物对(SEQ ID NO：184-SEQ ID NO：185)从CEN.PK113-11C基因组DNA扩增上游同源壁ELO3-up(从位置-382到+3)。通过使用引物对(SEQ ID NO：186-SEQ ID NO：187)从酵母基因组DNA扩增TDH2t。通过使用引物对(SEQ ID NO：188-SEQ ID NO：189)从酵母基因组DNA扩增ELO1。通过使用引物对(SEQ ID NO：190-SEQ ID NO：191)从酵母基因组DNA扩增GAL7p。通过使用引物对(SEQ ID NO：192-SEQ ID NO：193)从酵母基因组DNA扩增CYC1t。通过使用引物对(SEQ ID NO：194-SEQ ID NO：195)从酵母基因组DNA扩增ELO2。通过融合ELO2、GAL10p-GAL1p、At5FAR、FBA1和ELO3dw的DNA部分来组装ELO2+GAL10p-GAL1p+At5FAR+FBA1+ELO3dw的DS2模块。通过使用引物对(SEQ ID NO：204-SEQ ID NO：205)从酵母基因组DNA扩增ELO2。通过使用引物对(SEQ ID NO：196-SEQ ID NO：197)从酵母基因组DNA扩增GAL10p-GAL1p。通过使用引物对(SEQ ID NO：198-SEQ ID NO：199)从质粒pSPGM2-At5FAR扩增At5FAR。通过使用引物对(SEQ ID NO：200-SEQ ID NO：201)从酵母基因组DNA扩增FBA1t。通过使用引物对(SEQ ID NO：202-SEQ ID NO：203)从酵母基因组DNA扩增ELO3dw。使用引物(SEQ ID NO：183)通过质粒pROS10-Elo3产生双断裂(DSB)。
高水平二十二醇生产的途径整合到菌株IMX581 pACC1**中，来得到菌株IMX581pACC1**pELO1pELO2pAt5FAR。
上文描述的所有途径根据图15中显示的遗传排列进行整合。
对照菌株(JV03 Δelo3 pELO2 pAt5FAR)和生产菌株(IMX581 pACC1**pELO1pELO2pAt5FAR)的生产滴度在图16中显示。通过所描述的策略，我们实现了达到45mg/L的二十二醇高水平生产。
通过组合还原酶、蜡酯合成酶和延伸酶生产蜡酯
接下来，测试内在的elo2基因与实施例1中描述的还原酶/蜡酯合成酶组合。为此，使用引物扩增基因，所述引物在ATG起始密码子之前引入kozak序列，在每个基因的5'和3'末端引入不同的突出，分别与组成型活性启动子和终止子相容(SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：144)。如早先描述的用pYX212质粒主干组装基因。产生的质粒是：
pYX212::AmFAR::Elo2、pYX212::MaFAldhR::Elo2、pYX212::SciFAR::Elo2、pYX212::TaFAR::Elo2、pYX212::AmFAR::AbWS::Elo2、pYX212::AmFAR::AtWS::Elo2、pYX212::AmFAR::EgWS::Elo2、pYX212::AmFAR::SciWS::Elo2、pYX212::MaFAldhR::AbWS::Elo2、pYX212::MaFAldhR::AtWS::Elo2、pYX212::MaFAldhR::EgWS::Elo2、pYX212::MaFAldhR::SciWS::Elo2、pYX212::SciFAR::AbWS::Elo2、pYX212::SciFAR::AtWS::Elo2、pYX212::SciFAR::EgWS::Elo2、pYX212::SciFAR::SciWS::Elo2、pYX212::TaFAR::AbWS::Elo2、pYX212::TaFAR::AtWS::Elo2、pYX212::TaFAR::EgWS::Elo2、pYX212::TaFAR::SciWS::Elo2(质粒ID 38-61)。
质粒转化到CEN.PK 113-5D elo3 ΔACC1**中。制备酵母感受态细胞，根据醋酸锂/单链携带DNA/聚乙二醇方法(Gietz and Woods，2002)用1μg的质粒DNA转化。
通过在新鲜的SD-Ura 2％葡萄糖平板上划线纯化，从每个生产者和对照菌株分离三个独立的克隆。每个克隆在5mL葡萄糖最小培养基(Verduyn等人，1992)中生长2天，以0.05-0.1的OD600接种到250mL摇瓶中的25ml新鲜葡萄糖最小培养基中。培养物在30℃和200rpm下孵育。48h之后，通过在1000rcf下离心5分钟收集细胞团，用5mL磷酸盐缓冲液(10mM KH2PO4，pH 7.5)洗涤两次。
为了分析表达不同的KCS基因或表达与脱饱和酶组合的KCS基因的菌株中的脂肪酸谱，根据Khoomrung等人，2012制备并分析脂肪酸甲基酯(FAME)。与特定的对照菌株(CEN.PK 113-11C和CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1**pYX212)相比，这些菌株的生产数据在图17中显示。
为了分析脂肪醇和蜡酯谱，如早先描述的进行脂质的提取，例外是最终的样品溶于己烷中(而不是氯仿/甲醇)，以及十七碳酸十七烷醇酯(蜡酯)和十七醇(脂肪醇)用作内标准物(Khoomrung等人，2013)。随后，使用ZB-50柱(L＝30m，ID 0.32mm，df＝0.5μm)(Vsertese，Denmark)通过气相色谱-质谱(Focus GC ISQTM single quadrupole GC；Thermo Fisher Scientific)分析2μl注射物。入口温度设置为375℃，氦(载气)气流为1ml/分钟不分流。起始烘箱温度设置为150℃，保持10分钟。然后温度以7.5℃/分钟提高到350℃，保持10分钟。物质传递线温度设置为250℃，离子源温度设置为250℃，进行50到650m/z的全扫描。醇和蜡酯的分析标准物以精确的重量购自Nu-Check制药公司(Nu-Check Prep，Inc.，Elysian，MN，USA)。将它们溶于己烷中，使用与样品相同的方案和柱进行分析。
对照菌株(CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1**pYX212)和7种生产菌株的一个独立克隆的示范性的气相色谱图在图7中显示，而图8、图9、图10和图11分别描述了生产菌株中的脂肪酸、脂肪醇和蜡酯生产谱。图12和13显示了生产菌株CEN.PK 113-5D elo3ΔACC1**(pYX212:MaFAldhR::SciWS::Elo2)中检测的C40和C42蜡酯的特异m/z峰，表1列出了这个菌株中可检出的所有蜡酯种类。
我们显示了，通过异源表达延伸酶、还原酶和蜡酯合成酶的不同组合，在酿酒酵母的菌株中形成非常长链脂肪醇和非常长链蜡酯。当与特定的对照菌株(CEN.PK 113-5D Δelo3 ACC1**)比较时，清楚的是，C16、C18、C20、C22的长链和非常长链脂肪醇以及C30、C32、C34、C36、C38、C40、C42的非常长链蜡酯变为可检测的，并且实质上地提高(图9、图10、图11)。
实施例3
通过在酿酒酵母中过量表达各种Δ9-脱饱和酶来增强单不饱和脂肪酸合成
在这个实施例中，过量表达脱饱和酶来提高酿酒酵母中的单不饱和脂肪酸生产。过量表达酿酒酵母的内在的脱饱和酶(参见实施例2)(登记号EIW10301.1)或来自希蒙得木的异源表达的脱饱和酶(参见实施例2)(登记号1905423A)。希蒙得木的脱饱和酶是定位于它的天然宿主的质体中的可溶蛋白质。排序该蛋白质的密码子优化的序列，其没有蛋白质的预测的信号肽，所述信号肽包括前30个氨基酸。除了这些脱饱和酶之外，测试了来自极北哲水蚤的ChDes9-1(SEQ ID NO：28)(登记号AHL21604.1)，其具有被报道的C20-C26的底物范围。排序这些基因的酵母密码子优化版本，通过Gibson克隆(Gibson等人，2009)克隆到pSP-GM2中处于组成型活性启动子和终止子控制之下，与实施例1和实施例2中描述的相应的还原酶/蜡酯合成酶/延伸酶组合相组合。
特别地，与实施例1和实施例2中描述的还原酶/蜡酯合成酶/延伸酶基因组合地测试脱饱和酶基因。为此，使用引物扩增基因，所述引物在ATG起始密码子之前引入kozak序列，在每个基因的5'和3'末端引入不同的突出，分别与组成型活性启动子和终止子相容。如实施例2中描述的用pYX212质粒主干组装基因。产生的质粒是pYX212::Ole1(质粒ID 26)、pYX212::SciFAD(质粒ID 63)和pYX212::ChDes9-1(质粒ID 64)。
然后使用相同的条件转化和分析如实施例2中描述的酵母菌株。为了分析表达不同的脱饱和酶或表达与KCS和还原酶组合的脱饱和酶的菌株中的脂肪酸谱，根据Khoomrung等人，2012制备并分析脂肪酸甲基酯(FAME)。用于FAME的分析标准物购自Sigma Aldrich(Sigma Aldrich，Stockholm，Sweden)。将它们溶于己烷中，使用与样品相同的方案和柱进行分析。
为了分析与KCS、还原酶和蜡酯合成酶组合地表达不同还原酶的菌株中的脂肪醇和蜡酯谱，如实施例2中描述的进行脂质提取。
过量表达内在的脱饱和酶Ole1p的示范性的数据，以及它对提高单不饱和脂肪酸含量的作用在图18中显示。
我们显示了当在酿酒酵母中过量表达OLE1基因时，形成数量增加的不饱和脂肪酸。与延伸酶基因ELO2的过量表达组合，饱和的长链和非常长链脂肪酸水平显示降低，C16:1、C18:1、C20:1、C22:1的不饱和脂肪酸水平提高(图18)。
实施例4
通过过量表达脂肪酰基-辅酶A合成酶(FAA1)提高脂肪酰基-辅酶A分子
这个实施例包括内源过量表达来自酿酒酵母的脂肪酰基-辅酶A合成酶(Faa1)(登记号NPO14962.3)，基于游离脂肪酸催化脂肪酰基-辅酶A的形成。通过根据Gibson克隆方法从酵母基因组DNA带有相应30bp突出进行扩增，随后克隆到pSP-GM2上处于强组成型启动子和终止子控制之下，与实施例1和实施例2中描述的特定还原酶/蜡酯合成酶/延伸酶组合相组合，进行这个基因的过量表达。在相同条件下转化和分析实施例1中描述的酵母菌株。
实施例5
内源酵母基因YBR159W、PHS1和TSC13的过量表达以提高VLCFA合成
酵母VLCFA延伸系统由4种酶组成：3-酮酰-辅酶A合成酶(Elo1、Elo2、Elo3)、3-酮酰-辅酶A还原酶(YBR159Wp)、3-羟基酰基-辅酶A脱水酶(Phs1)和烯酰基-辅酶A还原酶(Tsc13)，参见图6(Denic and Weissman，2007)。通过用组成型活性强TEF1启动子交换它们的天然启动子来在酵母中过量表达这些酶。通过使用早先描述的(Jakociunas等人，2015)CRISPR/Cas9系统进行。
实施例6
通过共表达植物衍生的延伸酶系统来增强VLCFA合成
如实施例2中描述的，来自植物如希蒙得木的延伸酶(登记号AAC49186.1)或来自拟南芥的FAE1(登记号AAA70154.1)在酿酒酵母中过量表达。为了改善这些植物衍生的酶的延伸周期，特定的植物衍生的还原酶和脱水酶在酿酒酵母中共表达。这里例举了拟南芥基因CER10(还原酶1，Tsc13直系同源体)、KCR1(还原酶2，YBR159Wp直系同源体)、PAS2(脱水酶，PI直系同源体)它们是为酵母表达而密码子优化的，并如其他地方描述的(Jensen等人，2014)整合到基因组中处于组成型活性启动子和终止子控制之下。
实施例7
在酵母中表达拟南芥基因LACS1、LACS2和LACS3以改善向辅酶A形式的VLCFA活化
编码衍生自拟南芥的长链酰基-辅酶A合成酶LACS1、LACS2和LACS3的遗传序列进行密码子优化，在酵母中异源表达(Pulsifer等人，2012)。这些促进了长链脂肪酸与辅酶A的活化，这对于还原酶和蜡酯合成酶催化的后续反应是重要的。排序这些基因的酵母密码子优化版本，通过Gibson克隆(Gibson等人，2009)克隆到pSP-GM2中处于组成型活性启动子和终止子控制之下，与实施例1和实施例2中描述的相应的还原酶/蜡酯合成酶/延伸酶组合相组合并在特定菌株中测试。
实施例8
通过进化内源的酵母脂肪酸合成酶来增强VLCFA合成
对于这种筛选系统，构建了适当的质粒系统。它基于带有TEF1启动子和CYC1终止子的p413TEF的载体主干(Mumberg等人，1995).从基因组扩增带有30bp突出的PKEX2，通过Gibson克隆克隆到p413TEF中，替换TEF1启动子，产生p413KEX2。
对于文库产生，来自酿酒酵母的FAS1或FAS2基因通过由酿酒酵母基因组DNA扩增的差错PCR方法进行突变。引物包括相应于p413KEX2的质粒主干的30bp突出，便于克隆到PKEX2和TCYC1之间。扩增的基因文库通过Gibson克隆克隆到p413KEX2中，分别产生文库lib-Fas1-p413KEX2或lib-Fas2-p413KEX2。
用于筛选突变的FAS1/FAS2对于VLCFA生产的功能性的适当的菌株通过如其他地方描述的(Paul等人，2006)在酵母基因组中基因敲除ELO2、ELO3来创建。该方法应用于菌株CEN.PK113-11C(MATa MAL2-8C SUC2his3Δ1ura 3-52)。构建带有处于TEF1启动子控制下的野生型ELO3基因的质粒(p416TEF-ELO3)。通过Gibson克隆，用30bp突出引物从酵母基因组DNA扩增ELO3基因，克隆到p416TEF(Mumberg等人，1995)上的TEF1启动子和CYC1终止子之间来进行。如其他地方描述的(Paul等人，2006)，这个质粒用于补充CEN.PK113-11C、Elo2Δ、Elo3Δ的致死表型。文库lib-Fas1-p413KEX2或lib-Fas2-p413KEX2转化到这个菌株中，选择HIS+原养型转化体。筛选这些转化体在5-氟-乳清酸(FOA)上的生长，用于负选择p416TEF-ELO3的质粒丢失。仅带有能够产生VLCFA的有功能的FAS系统的细胞补偿延伸酶系统的丢失，显示了在这些条件下的生长。在不同温度(26℃、30℃、33℃、37℃)下进行筛选，因为对不同链长度的VLCFA的不同的细胞需求是预期的。
将相同的方法用于小的文库，在其中酿酒酵母的Fas2蛋白质中MPT和ACP结构域之间的连接区域被专门改变。例如，通过差错PCR，或如其它地方描述的(Jakociunas等人，2015)使用CRISPR/Cas9系统改变基因组中的接头长度来进行。
最终的候选物通过Gibson克隆亚克隆到pSP-GM2:AmFAR中处于TEF1启动子控制下，在菌株JV03(MATa MAL2-8C SUC2 ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δ pox1Δ)和PWY12(fas1Δ::HIS3 fas2Δ::LEU2)(Wenz等人，2001)中测试。
实施例9
通过异源表达衍生自分枝杆菌的脂肪酸合成酶增强VLCFA合成
衍生自细菌宿主如母牛分枝杆菌、迪尔诺弗分枝杆菌41002、新金分支杆菌和副偶发分支杆菌PA-1、细胞内分枝杆菌的脂肪酸合成酶基因序列为在酿酒酵母中表达进行密码子优化。例如，基因3-氧酰基-ACP合成酶[母牛分枝杆菌](WP_003928293)(SEQ ID NO：39)的密码子优化序列获自金斯瑞(860Centennial Ave.，Piscataway，NJ 08854，U.S.)，在每个侧面含有30bp突出，用于通过Gibson克隆亚克隆到pSP-GM2和pSP-GM2::AmFAR(实施例1)中的TEF1启动子和CYC1终止子之间，产生pSP-GM2::MvFas和pSP-GM2::AmFAR::MvFas。此外，编码衍生自母牛分枝杆菌的酰基-载体蛋白合成酶(AcpS)的基因(WP_040539704.1)为在酿酒酵母中表达进行密码子优化，获自金斯瑞，使用早先扩增的pTDFB启动子和tFBA1终止子序列通过Gibson克隆组装亚克隆到pSP-GM2::MvFas和pSP-GM2::AmFAR::MvFas中。每种质粒转化到以下的酵母菌株中：CEN.PK 113-5D(MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52)、JV03(MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δpox1Δ)和PWY12(fas1Δ::HIS3fas2Δ::LEU2)(Wenz等人，2001)这些质粒还转化到具有处在Phxti启动子控制下的FAS1基因的酵母菌株(CEN.PK113-5D，PHXTI-FAS1)中。它展现了处在葡萄糖限制状态下酵母FAS1基因的降低表达。在这个菌株中，在葡萄糖限制状态下测试使用细菌FAS系统生产VLCFA的功能性和选择性，来避免内源酵母FAS系统对丙二酰基-辅酶A供应的竞争。如实施例1中描述的测定脂肪酸分布和脂肪醇分布。
并行地，使用引物SEQ ID NO：173-SEQ ID NO：178，在每个侧面含有30bp突出的、基因3-氧酰基-ACP合成酶[母牛分枝杆菌]的密码子优化的序列(WP003928293)(SEQ ID NO：39)通过Gibson克隆亚克隆到p415GPD(SEQ ID NO：41)中的GPD1启动子和CYC1终止子之间，产生p415GVD::MvFas。此外，编码衍生自母牛分枝杆菌的酰基-载体蛋白合成酶(AcpS)的基因(WP_040539704.1)(SEQ ID NO：40)为在酿酒酵母中表达进行密码子优化，获自金斯瑞，使用早先扩增的pTDFB启动子和tFBA1终止子序列(SEQ ID NO：179-SEQ ID NO：182)通过Gibson克隆组装亚克隆到p415GPD:MvFas中，产生p415GPD::MvFas::Acps。
Gibson组装方法(Gibson等人，2009)用于构建质粒p415GVD:MvFas；p415GVD:MvFas::Acps和pSPGM2::At5FAR。
所有质粒通过化学转化转化到大肠杆菌DH5α中。所需质粒的菌落通过菌落PCR来验证。
在分离质粒和通过测序(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)验证每个基因之后。质粒p415GPD::MvFas::Acps转化到以下酵母菌株中TDY7005(Mata lys2ura3-52trplΔleu2Δelo2::KAN elo3::TRPl/pRS316-ELO3)(Paul等人，2006)(实施例8)，选择LEU2原养型转化体。筛选转化体在FOA上的生长，通过序列分析确认正确的克隆。
分离八个独立的克隆，每个克隆在SD-leu+2％葡萄糖培养基中5mL的前培养中生长2天，以0.05-0.1的OD600接种到250mL摇瓶中的25ml新鲜SD-leu+2％葡萄糖培养基中。脂质的提取如之前描述的进行，例外是最终样品溶解在己烷中(而不是氯仿/甲醇)(Khoomrung等人，2013)。随后，使用装备有ZB-5MS Guardian(L＝30m，ID 0.25mm，df＝0.25μm，Phenomenex)柱的气相色谱(Focus GC，ThermoScientific)质谱仪(DSQII ThermoScientific)分析2μl注射物。入口温度设置在280℃，氦(载气)气流设置在1ml/分钟不分流。用于FAME定量的GC程序如下：45℃的初始温度保持2.5分钟；然后以20℃每分钟的速率升高到220℃，保持2分钟；以20℃每分钟的速率升高到300℃，保持5分钟。入口和检测器的温度分别保持在280℃和300℃。
对照菌株(TDY7005)和生产菌株(YT01)的一个独立克隆的气相色谱图和定量数据在图19和20中显示。
在这个实施例中，我们证明了衍生自分枝杆菌的FAS系统在酵母酿酒酵母中的功能性表达允许C22脂肪酸的特异性和高水平生产，达到3μg/mg CDW。
实施例10
通过创造嵌合酶(酵母来源和分枝杆菌来源)进化酵母脂肪酸合成酶增强VLCFA合成
根据实施例9中描述的衍生自分枝杆菌的细菌FAS系统的密码子优化基因序列，根据其它地方描述的DNA混洗方法(Crameri等人，1998)将这些的一部分融合到酵母衍生的FAS1/FAS2序列。使用的载体和筛选系统与实施例8中描述的方式相同。使用Gibson克隆将嵌合体亚克隆到p413KEX2中来产生文库。在如实施例8中进行的筛选之后，最终的候选物通过Gibson克隆亚克隆到pSP-GM2::AmFAR中处于TEF1启动子控制下，在菌株JV03(MATa MAL2-8c SUC2 ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δpox1Δ)和PWY12(fas1Δ::HIS3 fas2Δ::LEU2)中测试。
实施例11
在解脂耶氏酵母中长链脂肪醇和蜡酯的生产
根据本发明在解脂耶氏酵母中表达重组基因可以伴随本文讨论的相关遗传工程方法的修饰。解脂耶氏酵母菌株PO1f(MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2)，一种获自ATCC(ATCC MYA-2613)的亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，用作背景菌株。要在该菌株中表达的基因可以如早先描述的进行组装和整合(Gao等人，2014)。这种方法涉及扩增要表达的基因、启动子、终止子、标志物和整合位点。片段然后使用重叠延伸PCR(OE-PCR)组装到单个基因表达盒中，然后使用Zymogen Frozen EZ酵母转化试剂盒II(Zymo Research Corporation)如早先报道的(Blazeck等人，2011)将DNA转化到酵母菌株中。在适当的退出培养基(SD-ura、SD-leu或SD-ura-leu)上选择菌株。
例如，为了将延伸酶(来自希蒙得木的KCS，登记号：AAC49186.1；为酵母密码子优化的；参见实施例2)和还原酶(来自意大利蜂的FAR；登记号：ADJ56408；为酵母密码子优化的；参见实施例1)整合到解脂耶氏酵母中，整合位点(LEU2基因座)启动子(EXP1p和TEF1p)、终止子(lip2t和xpr2t)、基因(ELO和FAR)和标记物基因(URA3)使用引物AKp1-18进行扩增。通过OE-PCR将片段组装到表达盒中，转化如如上所述是菌株PO1f，产生能够生产长链醇的菌株Y1AK1(ELO FAR URA3leu2)。为了创造能够产生蜡酯的菌株，将基因AtWS(来自拟南芥的蜡酯合成酶；登记号NP568547；为酵母密码子优化的)导入菌株YIAK1中。通过使用AKp19-30扩增GPDp启动子、lip1t终止子、WES、整合位点(URA3基因座)和LEU2来进行。产生的片段组装到表达盒中，转化入菌株YIAK1，产生菌株Y1AK2(ELO FAR WES URA3 LEU2)。
做为选择，如其它地方描述的(Gao等人，2014)，通过将基因靶向rDNA基因座可以实现多拷贝整合。
根据本发明在解脂耶氏酵母中表达重组基因可以伴随本文讨论的相关遗传工程方法的修饰。在并行的方案中，解脂耶氏酵母菌株JMY195(Pol1d MATa，ura3-302，leu2-270，xpr2-322)(Ledall等人，1994)，一种获自BIMLip(INRA，UMR1319，MICALIS，Domaine de Vilvert，F-78352Jouy-en-Josas，France)的亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型，用作背景菌株。合成实施例1和2中描述的、编码各种FAR和WS的异源基因，为解脂耶氏酵母进行密码子组成优化(SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：36)。基因YALI0B20196g(与酿酒酵母的Elo2在90％查询覆盖下54％的同一性)(SEQ ID NO：29)和标注为Δ9-脱饱和酶的YALI0C05951p(SEQ ID NO：30)，根据来自解脂耶氏酵母野生型菌株W29(20460TM)(Tharaud等人，1992)的g-DNA，使用特异性的、含尿嘧啶的引物(SEQ ID NO：145-SEQ ID NO：148)进行扩增。也根据解脂耶氏酵母野生型g-DNA，使用含有尿嘧啶的特异性引物(SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：150)扩增启动子pTEF、pEXP、pGPAT、pGPD、pPOX2和pPOT1以及终止子XPR2t。
根据两种质粒JMP62::pTEF::URAex(质粒ID 65)和JMP62::pTEF::LEUex(质粒ID66)(Beopoulos等人，2014)，通过循环聚合酶延伸克隆(CPEC)(Quan等人，2009；Quan等人，2011)使用特异性引物(SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：156)构建两种新的质粒，产生质粒JMP62::URAex(USER)(质粒ID 67)和JMP62::LEUex(USER)(质粒ID 68)。这些质粒含有USER位点来是它们对于USER克隆有效(Jensen等人，2014)。
合成实施例1和2中描述的、编码各种FAR和WS的异源基因，为解脂耶氏酵母进行密码子组成优化(SEQ ID NO：31-SEQ ID NO：38)，用含有尿嘧啶的特异性引物(SEQ ID NO：157-SEQ ID NO：172)扩增。
质粒JMP62::URAex(USER)和JMP62::LEUex(USER)用酶Nb.Bsml和AsiSl.切割。目标基因用USER酶化合物(NEB)处理，之后克隆到切开的质粒主干中。产生的质粒是：JMP62::URAex::AmFAR、JMP62::URA3ex::MaFAldhR、JMP62::URA3ex::SciFAR、JMP62::URAex::TaFAR、JMP62::URAex::AmFAR::AbWS、JMP62::URAex::AmFAR::AtWS JMP62::URAex::AmFAR::EgWS、JMP62::URAex::AmFAR::SciWS、JMP62::URAex::MaFAldhR::AbWS、JMP62::URAex::MaFAldhR::AtWS、JMP62::URAex::MaFAldhR::EgWS、JMP62::URAex::MaFAldhR::SciWS、JMP62::URAex::SciFAR::AbWS、JMP62::URAex::SciFAR::AtWS、JMP62::URAex::SciFAR::EgWS、JMP62::URAex::SciFAR::SciWS、JMP62::URAex::TaFAR::AbWS、JMP62::URAex::TaFAR::AtWS、JMP62::URAex::SciFAR::EgWS、JMP62::URAex::TaFAR::SciWS、JMP62::LEUex::YlElo2、JMP62::LEUex::YlOle1and JMP62::LEUex::YlOle1::YlElo2(质粒ID 69-91)。
所有的USER质粒用NotI消化，凝胶纯化，通过化学转化、使用Chen等人，1997的一步转化方案转化入解脂耶氏酵母JMY195。
通过在新鲜的SD-Ura/SD-Leu/SD-URA-LEU 2％葡萄糖平板上划线纯化，从每个生产者和对照菌株分离三个独立的克隆。每个克隆在5mL葡萄糖最小培养基(必要时添加尿嘧啶或亮氨酸)(Verduyn等人，1992)中生长2天，以0.05-0.1的OD600接种到250mL摇瓶中25ml新鲜的葡萄糖最小培养基(必要时添加尿嘧啶或亮氨酸)中。培养物在30℃和200rpm下孵育。48h之后，通过在1000rcf下离心5分钟收集细胞团，用5mL磷酸盐缓冲液(10mM KH2PO4，pH 7.5)洗涤两次。
为了分析具有整合的JMP62::LEUex::YlElo2、JMP62::LEUex::YlOle1或JMP62::LEUex::YlOle1::YlElo2片段的菌株中的脂肪酸谱，根据Khoomrung等人，2012制备并分析脂肪酸甲基酯(FAMEs)。
整合了线性化的质粒ID 69-88之一的其余菌株中的脂肪醇和蜡酯的分析如实施例2中描述的进行。
对照菌株(JMY195 JMP62::URAex(USER))和生产菌株JMY195JMP1047USER::AmFAR::SciWS的一个独立克隆的示范性的气相色谱图在图25中示出。
实施例12
与基因删除相组合的解脂耶氏酵母中长链脂肪醇生产
向目标产物的流动可以通过除去β-氧化能力来提高，这可以通过删除基因MFE1来实现。另外，删除PEX10基因，其涉及过氧化物酶体生物发生。因而，这些基因的删除与上文的修饰相组合。为了产生PEX10删除的菌株，将ELO-FAR盒靶向PEX10基因座而不是LEU2基因座。这些构建体转化到菌株PO1f中，产生菌株Y1AK3(Δpex10ELO FAR URA3 leu2)。
做为选择，为了产生含有MFE1基因中的删除的菌株，ELO-FAR盒靶向MFE0基因座而不是LEU2基因组。这些构建体转化到菌株PO1f中，产生菌株Y1AK4(Δmfe1 ELO FAR URA3 leu2)。
为了获得在两个基因中都含有删除的菌株，LEU2被靶向菌株Y1AK3的MFE1基因组，产生菌株Y1AK5(Δpex10 Δmfe1 ELO FAR URA3 LEU2)。
为了获得具有上述删除之一的蜡酯生产菌株，扩增WES并融合到如上所述基于LEU2的表达盒中，靶向菌株Y1AK3或Y1AK4的URA3基因座，分别产生菌株Y1AK6(Δpex10 ELO FAR WES URA3 LEU2)和Y1AK7(Δmfe1 ELO FAR WES URA3 LEU2)。为了获得具有两种删除的蜡酯生产用，扩增WES并融合到如上所述基于LEU2的表达盒中，靶向菌株Y1AK3的MFE1基因座，产生菌株Y1AK8(Δpex10 Δmfe1 ELO FAR WES URA3 LEU2)。
向目标产物的流动可以通过删除消耗脂肪酸的基因来提高，脂肪酸是脂肪酰基-辅酶A和脂肪醇合成的前体。这些基因的实例是lro1、dga1和dga2，它们的基因产物负责解脂耶氏酵母中的三酰基甘油(TAG)形成。基因pox1-6是涉及β-脂肪酸氧化的编码酶，从而降低游离脂肪酸的水平。另外，解脂耶氏酵母具有能够产生二不饱和脂肪酸的酶。由于我们的目标产物来源于单不饱和脂肪酸，这个生物体中编码Δ-12脱饱和酶的基因fad2也是删除的靶点。
带有前文提及基因的删除的菌株JMY2159(PoldMATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 pox1-6 Δdga1Δlro1 Δdga2 Δfad2Δ)(Beopoulos等人，2014)用实施例11中描述的质粒转化。
为了分析具有整合的JMV62::LEUex::YlElo2、JMV62::LEUex::YlOle1或JMV62::LEUex::YlOle1::YlElo2片段的菌株中的脂肪酸谱，根据Khoomrung等人，2012制备并分析脂肪酸甲基酯(FAMEs)。整合了ID 69-88的线性化质粒之一的其余菌株中的脂肪醇和蜡酯的分析如实施例2中描述的进行。
实施例13
酿酒酵母中的芥子酸生产
这个实施例证明了酿酒酵母中芥子酸(C22:1ω9)的提高水平的生产。芥子酸来源于油酸(C18:1)的延伸。为了提高油酸的水平，使用CRISPR/Cas9系统将突变S659A和S1157A(Shi等人，2014)导入ACC1基因中。另外，编码脂肪酸脱饱和酶的OLE1进行过量表达。做为选择，ChDes9-2对酿酒酵母进行密码子优化，使用CRISPR/Cas系统插入酵母基因组中来替换OLE1。将这与来自希蒙得木(登记号AAC49186.1)、拟南芥(AAA70154.1)、海甘蓝(AY793549)或芜菁甘蓝(AF490459)的植物FAE1-样3-酮脂酰-辅酶A合成酶(KAS)的表达组合。OLE1和相应的KAS基因(为在酵母中表达密码子优化的)使用Gibson克隆克隆到质粒pSP-GM2中。在菌株CEN.PK 113-5D(ura3-52)、JV03(ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δpox1Δ)、CEN.PK 113-5D elo3Δ和JV03 elo3Δ中实现所有列出的修饰。
这个实施例证明了酿酒酵母中芥子酸(C22:1ω9)的提高水平的生产。芥子酸来源于油酸(C18:1)的延伸。特别地，编码酿酒酵母的双突变ACC1p**的基因如实施例2中描述的整合到酿酒酵母的基因组中。
此外，编码酿酒酵母脂肪酸脱饱和酶的OLE1如实施例2和3中描述的过量表达。做为选择，在实施例2和3中描述的异源脱饱和酶ChDes9-1或SciFAD在酿酒酵母中过量表达以提高非常长链单不饱和脂肪酸的数量。
脱饱和酶的表达与来自希蒙得木、拟南芥、海甘蓝或芜菁甘蓝的植物3-酮脂酰-辅酶A合成酶(KCS)的表达组合，它们被报道主要合成芥子酸。携带那些基因的质粒的构建如实施例2和3中描述的进行。
质粒转化入菌株CEN.PK 113-5D(ura3-52)、JV03(ura3-52 are1Δ dga1Δ are2Δ lro1Δpox1Δ)、CEN.PK 113-5D elo3Δ、CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1**和JV03elo3ΔACC1**中。
通过在新鲜的SD-Ura 2％葡萄糖平板上划线纯化，从每个生产者和对照菌株分离三个独立的克隆。每个克隆在5mL葡萄糖最小培养基(Verduyn等人，1992)中生长2天，以0.05-0.1的OD600接种到250mL摇瓶中的25ml新鲜葡萄糖最小培养基中。培养物在30℃和200rpm下孵育。48h之后，通过在1000rcf下离心5分钟收集细胞团，用5mL磷酸盐缓冲液(10mM KH2PO4，pH 7.5)洗涤两次。
为了分析表达与脱饱和酶组合的KCS基因的菌株中的脂肪酸谱，根据Khoomrung等人，2012制备并分析脂肪酸甲基酯(FAME)。用于FAME的分析标准物购自Sigma Aldrich(Sigma Aldrich，Stockholm，Sweden)。将它们溶于己烷中，使用与样品相同的方案和柱进行分析。
对照菌株(CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1*pYX212)和生产菌株的一个独立克隆的示范性的生产数据在图21中显示。
通过在特定的背景菌株CEN.PK 113-5D elo3Δ ACC1*pYX212中与OLE1过量表达组合KCS延伸酶的异源表达，我们允许酵母生产C22:1芥子酸达到0.7μg/mg CDW。
实施例14
通过特定转运体蛋白的共表达增强蜡酯生产
为了提高脂肪酸衍生产物的分泌，使用CRISPR/Cas9系统将编码脂肪酸转运体的FAT1基因的启动子替换为强组成型TEF1启动子。为了提高蜡酯的输出，编码拟南芥ABC转运体转运体ABCG11和ABCG12的密码子优化的基因克隆到表达载体pIYC04(Krivoruchko等人，2013)中分别处于TEF1和PGK1启动子的控制下，使用Gibson克隆，形成质粒pTRANS1。随后，编码拟南芥脂质传递蛋白LTPG1和LTPG2的密码子优化的基因用相同方法克隆到pIYC04中，产生pTRANS2。LPTG1/LPTG2表达盒然后整合到pTRANS1中产生pTRANS3。蜡酯和和生产菌株(参见实施例1、2和15)分别用质粒pTRANS1、2和3转化，在摇瓶中培养，测定细胞内及细胞外的代谢产物。
实施例15
通过在酿酒酵母中减量调节脱饱和酶OLE1基因表达增强饱和脂肪酸合成
为了产生饱和的非常长链脂肪酸(>C22:0)，来自酿酒酵母的内源的脱饱和酶基因OLE1进行减量调节。还通过使用CRISPR/Cas9系统用弱的酵母启动子如PKEX2，或用葡萄糖浓度依赖性启动子如PHXT1替换天然启动子来进行。这些修饰分别在菌株CEN.PK113-5D(ura3-52)、JV03(ura3-52 are1Δ dga1Δ are1Δ lro1Δ pox1Δ)、CEN.PK 113-5D Elo3Δ和JV03 Elo3Δ和CEN.PK 113-5D Elo3Δ::TEF-ELO2、JV03 Elo3Δ::TEF-ELO2中实施。
实施例16
通过游离脂肪酸和脂肪醛途径、衍生自脂肪酰基-辅酶A的非常长链脂肪醇生产
评估酿酒酵母中通过游离脂肪酸和脂肪醛途径来自脂肪酰基-辅酶A的非常长链脂肪醇生产(图22)。在酿酒酵母YJZ01(MATa MAL2-8C SUC2 his3Δ1 ura3-52 hfd1Δ)(Buijs等人，2015)中构建以下途径。表达来自水油海杆菌的FAR(Willis等人，2011)用于来自脂肪酰基-辅酶A的脂肪醇生产。表达来自海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)的脂肪酸还原酶MmCAR(Akhtar等人，2013)和相应的辅助因子、来自构巢曲霉的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶NpgA(Mootz等人，2002)用于脂肪醛的合成，其然后由内源的醛还原酶(Buijs等人，2015)或来自水油海杆菌的异源长链脂肪醛还原酶(Wahlen等人，2009)或由实施例1中描述的任何其他FAR转化为脂肪醇。
FACoAR编码基因MaFACoAR、脂肪酸还原酶编码基因MmCAR为酵母进行密码子优化，来自金斯瑞(Piscataway，NJ，USA)。使用早先描述的模块途径工程化策略(Zhou等人，2012)将这些基因的组合导入pYX212中，产生质粒pYX212-FaCoAR和pAOH0。在纯化质粒之后，通过限制分析和序列验证，质粒转化入hfd1Δ株酿酒酵母YJZ01(Buijs等人，2015)。
这种方法还应用于实施例2中提及的生产非常长链脂肪酸的菌株(CEN.PK 113-5D Elo3Δ和JV03Elo3Δ、CEN.PK 113-5D Elo3Δ::TEF-ELO2、JV03Elo3Δ::TEF-ELO2)。分析这些菌株，如早先描述的(Buijs等人，2015)测量脂肪醇分布。当与表达经由来自水油海杆菌的FAR的途径相比时，经由来自海鱼分枝杆菌的MmCAR的途径的脂肪醇生产更高6倍(参见图22和23)。
实施例17
内源酵母基因的过量表达以提高VLCFA合成的前体供应
使用侧翼是BamHL&Sail的限制性位点的相应引物，从CEN.PK 113-5D的基因组扩增内源酵母基因MPP6、ACP1、EPT1、FAA1、GEP4、GGA2、IDP3、INP54、LPP1、MCR1、OPM1、RTC3、SPO7、TGL1、YFT2、FAA3，克隆到表达载体pSP-GM2(SEQ ID NO：1)和pSP-GM2::AmFAR中。质粒转化入酵母菌株CEN.PK 113-5D和JV03，如Buijs等人(2015)中描述的测定脂肪酸和脂肪醇分布。来自这一筛选的脂肪醇生产的数量在图24中显示。
表1：5Delo3 ΔACC1**(pYX212::MaFAldhR::SciWS::Elo2)中的确切蜡酯组成
表2：酵母菌株
表3.质粒
表4：核苷酸序列
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