通过引用将任何优先权申请并入在此，根据37cfr1.57，将与本申请一起提交的申请数据表中指定的国外或国内优先权中的任何以及所有申请通过引用并入，包括于2015年4月9日提交的美国临时专利申请第62/145,417号。关于联邦政府资助的r&d的声明本发明在美国国立卫生研究院国家综合医学研究所批准的nih基金/合同号gm069811、来自国立环境卫生科学研究所的核心中心基金p30-es002109，以及来自国家癌症研究所(swanson生物技术中心)的科赫研究所支持基金p30-ca14051的政府支持下进行。政府在本发明中具有一定的权利。背景领域本文所述的一些实施方案涉及这样的细胞，其被基因工程化以在所述细胞的群体达到期望密度时释放多肽。在一些实施方案中，释放的多肽可以是治疗性多肽。在一些实施方案中，治疗性多肽杀死肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞生长。相关领域描述诸如溶瘤病毒和工程化免疫细胞的生活疗法，作为癌症治疗以及正在进行的黑素瘤、癌和白血病的临床试验的替代方案出现(o’shea,c.c.viruses–seekinganddestroyingthetumorprogram.oncogene24,7640–7655(2005)；june,c.h.etal.engineeredtcellsforcancertherapy.cancerimmunology,immunotherapy1–7(2014)；miest,t.s.&cattaneo,r.newvirusesforcancertherapy:meetingclinicalneeds.naturereviewsmicrobiology12,23–34(2014))。同时，长久以来细菌作为病原体的整体观点，已让步于人体内功能微生物的广泛普及这一理解(cho,i.&blaser,m.j.thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.naturereviewsgenetics13,260–270(2012)；xuan,c.etal.microbialdysbiosisisassociatedwithhumanbreastcancer.plosone9,e83744(2014)；fischbach,m.a.,bluestone,j.a.&lim,w.a.cell-basedtherapeutics:thenextpillarofmedicine.sciencetranslationalmedicine5,179ps7–179ps7(2013))。鉴于该大环境，某些细菌将进化为优先在肿瘤内生长可能是不可避免的，因此为工程化疗法的发展提供了天然的平台(pawelek,j.m.,low,k.b.&bermudes,d.tumor-targetedsalmonellaasanovelanticancervector.cancerresearch57,4537–4544(1997)；ruder,w.c.,lu,t.&collins,j.j.syntheticbiologymovingintotheclinic.science333,1248–1252(2011)；weber,w.&fussenegger,m.emergingbiomedicalapplicationsofsyntheticbiology.naturereviewsgenetics13,21–35(2011))。尽管已经利用肿瘤内微生物定位来刺激宿主免疫系统靶向癌细胞，此类疗法在理想情况下由被程序化以安全避免全身炎症应答但持续产生局部释放的抗肿瘤物质的细菌组成(baban,c.k.,cronin,m.,o’hanlon,d.,o’sullivan,g.c.&tangney,m.bacteriaasvectorsforgenetherapyofcancer.bioengbugs1,385–394,2010；cann,s.h.,vannetten,j.&vannetten,c.drwilliamcoleyandtumourregression:aplaceinhistoryorinthefuture.postgraduatemedicaljournal79,672–680,2003)davila,m.l.etal.efficacyandtoxicitymanagementof19-28zcartcelltherapyinbcellacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine6,224–224ra25,2014)。在本文所述的实施方案中，是工程化的临床测试的细菌在阈值群体密度下裂解并释放基因编码的抗肿瘤治疗物中的用途。在裂解时，少量存活的细菌使所述群体再接种，从而导致脉冲裂解和具有隐形体内印迹的递送循环。前述基因回路的工程化的近期研究进展，将合成生物学作为发展生物疗法的新方法(fischbach,m.a.,bluestone,j.a.&lim,w.a.cell-basedtherapeutics:thenextpillarofmedicine.sciencetranslationalmedicine5,179ps7–179ps7,2013；ruder,w.c.,lu,t.&collins,j.j.syntheticbiologymovingintotheclinic.science333,1248–1252,2011；weber,w.&fussenegger,m.emergingbiomedicalapplicationsofsyntheticbiology.naturereviewsgenetics13,21–35,2011；以及folcher,m.&fussenegger,m.syntheticbiologyadvancingclinicalapplications.currentopinioninchemicalbiology,2012)。鉴于有益微生物的广泛普及以及它们在体内的功能性作用，细菌为治疗代谢障碍、胃肠疾病和癌症的生物疗法发展呈现了天然的平台(cho,i.&blaser,m.j.thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.naturereviewsgenetics13,260–270(2012)；garrett,w.s.cancerandthemicrobiota.science348,80–86,2015；pawelek,j.m.,low,k.b.&bermudes,d.tumor-targetedsalmonellaasanovelanticancervector.cancerresearch57,4537–4544,1997)。随着用于治疗性基因表达的模块的发展的持续进步，未知的可能性是构建动态控制集落生长和治疗物表达的回路(jeong,j.-h.etal.anti-tumoraleffectofthemitochondrialtargetdomainofnoxadeliveredbyanengineeredsalmonellatyphimurium.plosone9,e80050,2014；loessner,h.etal.remotecontroloftumour-targetedsalmonellaentericaserovartyphimuriumbytheuseofl-arabinoseasinducerofbacterialgeneexpressioninvivo.cellularmicrobiology9,1529–1537,2007；swofford,c.a.,vandessel,n.&forbes,n.s.quorum-sensingsalmonellaselectivelytriggerproteinexpressionwithintumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences112,3457–3462,2015)。这些工程化细菌在理想情况下将自行维持它们的群体密度，同时持续产生并在原地释放治疗剂。在本文所述的实施方案中，是具有临床相关特性的工程化细菌在阈值群体密度下同步裂解并释放基因编码的治疗物中的用途。裂解时，少量存活的细菌使生长的群体重接种，从而导致脉冲裂解和释放循环。概述该部分提供了本公开的一般性概述，并且对其全部范围或其全部特征而言不全面。本公开的一些实施方案描述于下述具有编号的段落中：1.细胞，其被基因工程化以在所述细胞的群体达到期望密度时释放多肽。2.如段1所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。3.如段1至2中任一段所述的细胞，其中所述多肽是治疗性多肽。4.如段3所述的细胞，其中所述治疗性多肽是杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长的多肽。5.如段3所述的细胞，其中所述治疗性多肽是引发针对肿瘤细胞的免疫应答的多肽。6.如段3所述的细胞，其中所述治疗性多肽是募集t细胞或树突状细胞的多肽。7.如段3所述的细胞，其中所述治疗性多肽是引起或增加凋亡的多肽。8.如段3所述的细胞，其中所述治疗性多肽是增强抗癌药物的释放和/或效力的多肽。9.如段8所述的细胞，其中所述抗癌药物是脂质体抗癌药物。10.如段1至9中任一段所述的细胞，其中当所述细胞的所述群体达到所述期望密度时，所述细胞裂解。11.如段1至10中任一段所述的细胞，其中所述细胞能够在肿瘤内增殖。12.如段1至10中任一段所述的细胞，其中所述细胞能够在肿瘤的坏死区域内增殖。13.如段1至12中任一段所述的细胞，其中所述细胞是厌氧细胞。14.如段1至13中任一段所述的细胞，其中所述细胞被基因工程化，以产生在所述细胞的所述群体达到所述期望密度时裂解所述细胞的多肽。15.如段14所述的细胞，其中裂解所述细胞的所述多肽包含φx174e裂解多肽、来自产生大肠杆菌素的细菌的e7裂解多肽、或者λ噬菌体裂解多肽。16.如段15所述的细胞，其中裂解所述细胞的所述多肽包含φx174e裂解多肽。17.如段14至16中任一段所述的细胞，其中裂解所述细胞的所述多肽受可调控型启动子的控制。18.如段9所述的细胞，其中所述细胞产生增加所述可调控型启动子的强度的可扩散诱导物。19.如段9至10中任一段所述的细胞，其中所述可调控型启动子包含luxi启动子或其功能片段。20.如段18所述的细胞，其中所述可扩散诱导物包含酰基高丝氨酸内酯。21.如段20所述的细胞，其中所述酰基高丝氨酸内酯通过luxi蛋白的作用产生。22.如段21所述的细胞，其中所述luxi蛋白的表达受luxi启动子的控制。23.如段20至22中任一段所述的细胞，其中所述酰基高丝氨酸内酯结合luxr蛋白，并且所述luxr蛋白激活从所述luxi启动子的转录。24.如段20至23中任一段所述的细胞，其中所述细胞内酰基高丝氨酸内酯的水平受所述细胞内aiia蛋白的水平调控。25.如段24所述的细胞，其中所述aiia蛋白的表达受可调控型启动子的控制。26.如段3至25中任一段所述的细胞，其中所述治疗性多肽由所述细胞内的质粒编码。27.如段14至26中任一段所述的细胞，其中裂解所述细胞的所述多肽由所述细胞内的质粒编码。28.如段14至27中任一段所述的细胞，其中所述治疗性多肽由所述细胞内的第一质粒编码，并且裂解所述细胞的所述多肽由所述细胞内的第二质粒编码。29.如段14至27中任一段所述的细胞，其中所述治疗性多肽和裂解所述细胞的所述多肽由所述细胞内的相同质粒编码。30.如段10至29中任一段所述的细胞，其中当所述细胞的群体处于所述期望密度时，所述群体中并非所有细胞均被裂解，从而允许裂解之后所述细胞的再生长并促进所述治疗性多肽的脉冲释放。31.如段18至30中任一段所述的细胞，其中所述诱导物的水平受与裂解所述细胞的所述多肽相同的可调控型启动子的调控。32.如段3至31中任一段所述的细胞，其中所述治疗性多肽包含溶血素e。33.如段1至32中任一段所述的细胞，其中所述细胞优先位于肿瘤的坏死区域内。34.如段1至33中任一段所述的细胞，其中所述多肽释放的时机与基因回路的活性直接或间接耦合。35.如段34所述的细胞，其中所述基因回路包含调控clpxp蛋白酶活性的基因回路。36.如段35所述的细胞，其中所述释放的多肽包含laa标签。37.如段35至36中任一段所述的细胞，其中针对所述释放的多肽的所述clpxp蛋白酶的活性水平受过氧化氢水平的调控。38.如段10至37中任一段所述的细胞，其中所述细胞裂解的时机与基因回路的活性直接或间接耦合。39.如段38所述的细胞，其中与所述细胞裂解的时机耦合的所述基因回路包含调控clpxp蛋白酶活性的基因回路。40.如段39所述的细胞，其中裂解所述细胞的多肽包含laa标签。41.如段39至40中任一段所述的细胞，其中针对裂解所述细胞的所述多肽的所述clpxp蛋白酶的活性水平受过氧化氢水平调控。42.包含多株段1至41中任一段所述的细胞的集合，其中当所述各株达到所述期望密度时所述株释放不同的多肽。43.如段42所述的集合，其中所述多株中的各株具有针对不同抗生素的抗性。44.如段42所述的集合，其中所述多株中的各株产生作用于所述集合中其它株的细菌素。45.如段42所述的集合，其中所述多株中至少一株以不同于所述集合的其它株中至少一株的释放频率的频率释放多肽。46.向个体提供多肽的方法，其包括向所述个体施用段1至41中任一段所述的细胞，其中在促进所述个体内所述细胞释放所述多肽的条件下进行所述施用。47.治疗个体中的健康病况的方法，其包括向所述个体施用权利要求1至41中任一段所述的细胞，其中所述多肽是治疗性多肽。48.如段46至47中任一段所述的方法，其中所述多肽是杀死肿瘤或者抑制肿瘤生长的多肽，并且其中以将所述细胞递送至所述肿瘤的方式施用所述细胞。49.如段46至47中任一段所述的方法，其中所述多肽在所述个体中以脉冲方式释放。50.如段46至49中任一段所述的方法，其还包括向所述个体施用第二治疗剂。51.如段50所述的方法，其中在向所述个体施用段1至41中任一段所述的细胞的同时，向所述个体施用所述第二治疗剂。52.如段50所述的方法，其中在不同于向所述个体施用权利要求1至41中任一段所述的细胞的时间，向所述个体施用所述第二治疗剂。53.如段50所述的方法，其中所述第二治疗剂是化疗剂或生物治疗剂。54.如段53所述的方法，其中所述第二治疗剂包含5-氟尿嘧啶。55.向个体提供多种多肽的方法，其包括向所述个体施用段42至45中任一段所述的包含多株细胞的集合，其中在促进所述个体内所述多株释放各所述不同多肽的条件下进行所述施用。56.如段55所述的方法，其中所述不同多肽中的至少一种是杀死肿瘤或抑制肿瘤生长的治疗性多肽，并且其中以向所述肿瘤递送所述多株所述细胞的方式施用包含所述多株所述细胞的集合。57.如段56所述的方法，其中所述治疗性多肽是引发针对肿瘤细胞的免疫应答的多肽。58.如段56所述的方法，其中所述治疗性多肽是募集t细胞或树突状细胞的多肽。59.如段56所述的方法，其中所述治疗性多肽是引起或增加凋亡的多肽。60.如段56所述的方法，其中所述治疗性多肽是增强抗癌药物的释放和/或效力的多肽。61.如段60所述的细胞，其中所述抗癌药物是脂质体抗癌药物。62.如段55至61中任一段所述的方法，其中所述不同的多肽的每一种在所述个体中以脉冲方式释放。63.如段55至62中任一段所述的方法，其中向所述个体施用所述多株中的第一株并允许其增殖期望的时间段，以及随后向所述个体施用所述多株中的第二株并允许其增殖期望的时间段，其中由于所述第二株的施用而阻止或抑制所述第一株的增殖。64.如段63所述的方法，其中所述第一株具有针对第一抗生素的抗性且对第二抗生素敏感，以及所述第二株具有针对所述第二抗生素的抗性且对所述第一抗生素敏感，并且其中当期望所述第一株增殖时向所述个体施用所述第一抗生素，且当期望所述第二株增殖时向所述个体施用所述第二抗生素。65.如段63所述的方法，其中所述第一株产生杀死第二株或抑制第二株生长的第一细菌素，并且所述第二株产生杀死所述第一株或抑制所述第一株生长的细菌素。66.如段55至65中任一段所述的方法，以循环方式向所述个体施用所述多株中的所述株的每一株。67.如段55至66中任一段所述的方法，其中在促进所述个体内所述多株中仅一株增殖的同时，阻止或抑制所述多株中其它株的增殖。68.段1至41中任一段所述的细胞在向个体提供释放自所述细胞的多肽中的用途。69.段1至41中任一段所述的细胞在治疗个体的健康病况治疗个体的健康病况中的用途。70.包含多株段1至41中任一段所述的细胞的集合在向个体提供多种多肽中的用途。71.如段68至70中任一段所述的用途，其中所述多肽是治疗性多肽。72.如段71所述的用途，其中所述治疗性多肽是杀死肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞生长的多肽。73.如段71所述的用途，其中所述治疗性多肽是引发针对肿瘤细胞的免疫应答的多肽。74.如段71所述的用途，其中所述治疗性多肽是募集t细胞或树突状细胞的多肽。75.如段71所述的用途，其中所述治疗性多肽是引起或增加凋亡的多肽。76.如段71所述的用途，其中所述治疗性多肽是增强抗癌药物的释放和/或效力的多肽。77.如段76所述的用途，其中所述抗癌药物是脂质体抗癌药物。78.如段68至77中任一段所述的用途，其中所述多肽在所述个体中以脉冲方式释放。79.如段68至78中任一段所述的用途，其还包括向所述个体施用第二治疗剂。80.如段79所述的用途，其中在向所述个体施用权利要求1至41中任一段所述的细胞的同时，向所述个体施用所述第二治疗剂。81.如段79所述的用途，其中在不同于向所述个体施用权利要求1至41中任一段所述的细胞的时间，向所述个体施用所述第二治疗剂。82.如段79所述的用途，其中所述第二治疗剂是化疗剂或生物治疗剂。83.如段81所述的用途，其中所述第二治疗剂包含5-氟尿嘧啶。84.如段70所述的用途，其中向所述个体施用所述多株中的第一株并允许其增殖期望的时间段，以及随后向所述个体施用所述多株中的第二株并允许其增殖期望的时间段，其中由于所述第二株的施用而阻止或抑制所述第一株的增殖。85.如段84所述的用途，其中所述第一株具有针对第一抗生素的抗性且对第二抗生素敏感，以及所述第二株具有针对所述第二抗生素的抗性且对所述第一抗生素敏感，并且其中当期望所述第一株增殖时向所述个体施用所述第一抗生素，以及当期望所述第二株增殖时向所述个体施用所述第二抗生素。86.如段84所述的用途，其中所述第一株产生杀死第二株或抑制第二株生长的第一细菌素，以及所述第二株产生杀死所述第一株或抑制所述第一株生长的细菌素。87.如段70至86中任一段所述的用途，其中以循环方式向所述个体施用所述多株中的所述株的每一株。88.如段70至87中任一段所述的用途，其中在促进所述个体内所述多株中仅一株增殖的同时，阻止或抑制所述多株中其它株的增殖。89.制备段1至41中任一段所述的细胞的方法，其包括经细菌接合向所述细胞中引入编码所述释放的多肽的核酸。90.制备段14至41中任一段所述的细胞的方法，其包括向所述细胞中引入编码裂解所述细胞的所述多肽的核酸。91.如段89至90中任一段所述的方法，其中所述核酸的引入经细菌接合进行。前述概述仅是说明性的，并且不意图以任何方式进行限制。除了以上所述的说明性方面、实施方案和特征，根据附图和下述详细描述以及权利要求，本公开的其它方面、实施方案、目标和特征将变得完全显而易见。附图说明图1.slc的一个实施方案的构建和表征。(a)该回路包含激活子(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44,2012)和裂解质粒。当该群体达到临界ahl浓度的群体阈值时，luxi启动子驱动用于裂解的基因e的转录，luxi和sfgfp或luxcdabe作为报告基因模块。luxi或ptac启动子也驱动体内回路的治疗性基因的转录。该系统中的luxr由天然的pluxr启动子驱动。(b)阐明从接种至群体‘起始’的各裂解循环的主要阶段的示意图。底部的图显示的是微流体生长室中经历群体起始的三个主要阶段的包含回路的细胞的典型时间序列图像(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330,2010)。(c)典型微流体实验的荧光特征。估计的细胞群体轨迹揭示，裂解事件与sfgfp荧光的峰相对应。(d)随微流体装置的介质通道中估计的流速而变化的周期和环境温度。误差棒指示13-50个峰的±1标准差。用stecher,b.etal.flagellaandchemotaxisarerequiredforefficientinductionofsalmonellaentericaserovartyphimuriumcolitisinstreptomycin-pretreatedmice.infectionandimmunity72,4138–4150(2004)中所述的株1进行以上实验，参见完整株信息的补充信息。图2.计算机建模以及可调谐性。(a)来自计算模型的细菌集落，时间序列的集落大小、集落ahl、单细胞sfgfp或luxi的胞内浓度，以及单细胞裂解蛋白的胞内浓度。(b)来自计算模型的结果，其显示通过改变clpxp介导的luxi的降解来调整振荡周期的能力。实线：集落大小；虚线：单细胞裂解蛋白的胞内浓度。(c)荧光特性，其显示luxissra(连接实心圆的线，株2)和非ssra(连接空心圆的线，株1)标记的回路版本的裂解振荡。(d)在饱和和非饱和ahl条件下回路的行为，以及模型预测(插图)。通过稳定的荧光输出来表征在200nmahl下稳定状态的裂解行为，而ahl的移出使系统返回至振荡行为(株1)。虚线：ahl浓度。实线：荧光。图3.体外治疗剂表征。(a)含有癌细胞和细菌的微流体共培养物的示意图。改变该芯片中的流体阻力以实现稳定的几近停滞的流动减少，从而允许癌细胞粘附以及释放的治疗物从阱至通道的扩散(参见补充信息中的方法)。(b)依序对共培养物以时间序列进行可视化观察的鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)(株3)‘起始’、裂解以及hela细胞死亡的的画面。(c)随时间的变化，来自(b)的细菌的荧光特性(空心圆)和hela细胞活力(实心圆)分数(图像中的活细胞数/死细胞数)。(d)与来自鼠伤寒沙门氏菌培养物的上清液共培养的hela细胞的％活力，所述培养物含有slc+hlye回路(株4)、仅slc回路(株5)、仅组成型hlye(株6)或者不含质粒(株7)。误差棒指示三次测量的平均值±1标准误。(e)与不同起始接种密度的hela细胞共培养的slc+hlye回路(株4)的荧光特性。黑色‘x’表示hela细胞完全死亡的点。(f)从荧光开始出现至hela细胞死亡所测量的毒素暴露时间，其随着sfgfp产生速率的变化而变化(参见(e)中的实例)。尽管死亡时间取决于接种，但是暴露的总量级保持恒定(插图)。误差棒指示三次测量±1标准误。参见elh1301宿主株信息的补充信息(hohmann,e.l.,oletta,c.a.&miller,s.i.evaluationofaphop/phoq-deleted,aroa-deletedliveoralsalmonellatyphivaccinestraininhumanvolunteers.vaccine14,19–24,1996)。图4.体外疗法和动力学。(a)含有稳定治疗性tsdc株(株8，群体治疗和群体裂解)的荷瘤小鼠随时间的ivis成像。(b)用该株进行鼠伤寒沙门氏菌注射之后，来自个体肿瘤的相关发光特性。(c)来自基因组整合的组成型发光株(株9)的相关发光特性。含有组成型发光株的终点发光平均高32倍(右图)。为了更高的发光信号，经瘤内注射进行(a)-(c)中的实验(也参见图7a)。(d)注射有tsdc回路(实线，株10)的荷瘤小鼠以及无质粒对照(虚线，株7)随时间的平均相对肿瘤体积。显示了个体相对肿瘤体积轨迹(中图)，其中实线或虚线表示平均轨迹。显示了两种情况的最终相对肿瘤体积(右图)。误差棒分别指示对照和tsdc情况下17和22个个体肿瘤±1标准误。各情况由>9只小鼠组成。*p<0.01，单向anova。经静脉注射进行(d)中的实验(也参见图7b)。(e)显示了来自三种测试株的实验的相对恢复体重(仅细菌，株7；tsdc，株10；组成型治疗株，株12)。误差棒指示5-11个体小鼠±1标准误。**p<0.0001，单向anova。图5.不同细菌生长中的回路鲁棒性。(a)在用于鼠伤寒沙门氏菌(株1)的典型微流体实验的生长室中，每个连续振荡循环裂解的细菌细胞的分数和数目。实线：裂解的细胞的分数。虚线：裂解的细胞。(b)随着大肠杆菌微流体装置的介质通道中估计的流速的变化而变化的周期。误差棒指示12-19个峰±1标准差。(c)随着大肠杆菌的环境温度的变化而变化的周期。在大肠杆菌中，在高于37℃的温度下回路不振荡。误差棒指示12-19个峰±1标准差。用株13进行(b)和(c)中的实验。(d)荧光特性，其显示大肠杆菌中ssra(实线和实心圆，株13)、ts-ssra(虚线和空心圆，株15)和非ssra(虚线和实心圆，株14)标记的luxi回路版本的回路行为。由于回路丧失了振荡行为，并降低了降解效力，利用大肠杆菌中变化的降解标签策略，周期不是可调的。(e)流中的区域和温度参数空间，其中回路显示出振荡行为。鼠伤寒沙门氏菌的株参数给出了更广泛的范围，其允许鲁棒性振荡(参见本文其它信息)。热图染色与振荡周期相对应。图6.研究裂解介导的胞内释放。(a)释放之后用于sfgfp可视化的含有0.4μm槽的细菌生长室。(b)典型振荡循环的细菌数目(虚线和空心圆)、细菌荧光(实线和实心圆)、槽荧光(实线和空心圆)(株1)。(c)来自(b)的微流体槽的荧光时间序列图像。(d)用于在微流体装置中进行细菌和癌细胞共培养实验的一般步骤(也参见补充信息)(kolnik,m.,tsimring,l.s.&hasty,j.vacuum-assistedcellloadingenablesshear-freemammalianmicrofluidicculture.labonachip12,4732–4737(2012))。图7.研究体内治疗性回路。(a)生长～20h之后，图4中使用的治疗株的终点体外发光强度。宿主株a和b是株8和株10。宿主a显示出高于宿主b～2倍的发光。(b)经尾静脉注射含有治疗性回路的鼠伤寒沙门氏菌，并且之后定位于肿瘤中。(c)含有tsdc(粗实线)、组成型治疗/基础裂解株(细虚线)和仅含有细菌的对照(粗虚线)的荷瘤小鼠随时间的相对体重。误差棒分别指示对照和治疗情况下5只和11只小鼠±1标准误。通过静脉注射进行实验。(d)酶标仪上测量的体内使用的不同回路的体外生长曲线(株7、10和12)。图8a-i.该研究中使用的一些质粒的图形表示(参见本文其它信息)。图9a-c.利用小的微流体装置(100孔)观察的无群体时钟贡献的快速且非同步的胞内时钟振荡，因为群体时钟需要临界集落大小发挥功能。图10.基于共享降解的快速翻译后耦合平台。(a)我们通过clpxp降解(1±1min(±s.e.m.)，由虚线箭头表示)测量了与模块-模块协调相关的延迟，并通过诱导单个细胞中(虚线箭头)lux启动子并追踪超折叠gfp(sfgfp)-laa(lux启动子，实线箭头)和cfp-laa(plac/ara-1启动子，实线箭头)的应答(右图，55灰色细胞轨迹对，其中突出表示3个代表性的对)测量了在单一实验中通过转录和翻译(31±5min)的输入-输出应答。(b)通过外部提供的h2o2快速诱导(<2min，我们的实验步骤时间)蛋白降解，在针对rssb的阻碍的应答中产生了clpxp负载的可逆变化。(c)为了使用翻译后耦合以驱动下游模块，通过添加相同的laa标签我们将群体时钟连接至组成型表达的荧光蛋白。通过相同的降解标签，组成型模块紧密耦合至群体起搏器。在降解标签前添加不同长度的接头(thr-ser(ts)重复)使降解动力学相移，其中较长的接头产生较长的延迟。误差棒指示偏移时间的标准差(s.d.)，以平均值为中心(对于各ts接头长度，50–200个细胞).a.u.,任意单位。图11.在多种尺度下翻译后连接的基因时钟。(a)该网络由耦合的胞内群体时钟组成。由于延迟的负反馈作用于其自身启动子，胞内时钟振荡，并且其周期可通过iptg和阿拉伯糖来调谐。群体时钟振荡受培养基流速调谐，并且经ahl在集落水平同步化。(b)耦合的胞内群体时钟系统在小群体中非同步振荡，并且一旦群体时钟起始则转换为在较大群体中的同步化振荡。尽管自身缺乏细胞-细胞通讯模式，但是通过宿主连接的与群体时钟的耦合，胞内时钟的变异系数(cv)明显下降(底图，数据来自28个单细胞踪迹)。(c)在无群体时钟的情况下，iptg降低小细胞群体中的胞内时钟周期(实线)，以及在含有胞内时钟的情况下，增加较大群体中的耦合周期(虚线)。各数据点取自10–30个振荡峰。误差棒指示周期的s.e.m.，其集中在平均值。(d)在我们的计算模型中，负载介导的耦合允许胞内时钟经clpxp处耦合的降解来调整群体时钟周期，因为胞内时钟在耦合脉冲之间持续振荡，并促进脉冲起始。(e)该自适应形式的脉冲调频确保脉冲动力学不改变，同时调整脉冲间隔持续时间(左，模型；右，实验；6–9个振荡峰)。插图显示了由胞内时钟导致的耦合脉冲的较早起始。误差棒指示相对的群体时钟周期的s.e.m.。(f)该机制还通过使得在较高培养基流速下振荡而使耦合系统更稳定。nfb，负反馈振荡器；qs，群体-感应振荡器。图12.基因多谱编码。(a)将单独的iptg和阿拉伯糖以及流速输入编码为调频振荡，其可从胞内时钟的报告基因的时间序列进行测量。该工程化的系统能够将来自两个底层网络的信息编码为单一多谱时间序列。粗实线：qs(cfp)；细实线：nbf(yfp)。(b)由来自胞内时钟(上图，数据各自来自30个单细胞踪迹)和群体时钟(底图)的实验数据和计算模型产生的频率应答曲线，模型应用于来自独立的原创性研究的数据。误差棒指示周期的s.e.m.，其集中在平均值。(c)在耦合系统中，来自两种时钟的调频振荡可在胞内时钟的输出中观察到，并且其提取自傅里叶逆变换(插图，补充信息中的方法)。(d)iptg和阿拉伯糖以及流速输入的独立恢复。胞内时钟针对iptg和阿拉伯糖的频率应答与单独的时钟相等(上图)，并且群体时钟的频率应答通过胞内时钟转移(底图)。由各种情况下5–10个单细胞踪迹计算的周期。误差棒指示周期的s.e.m.，其集中在平均值。图13.多集落水平下的翻译后耦合。(a)在多集落水平，氧化还原信号转导产生的h2o2与细胞应激应答网络的相互作用将集落之间的群体时钟振荡同步化。踪迹取自整个阵列中10个独立的集落。(b)宿主连接的振荡改变了针对通过ndh(nadh脱氢酶ii)的酶活性产生的h2o2的应答中不同方面的波形。利用h2o2(虚线)，振荡具有较大幅度和更陡的坡度，揭示通过合成的时钟网络与天然应激应答的相互作用所产生的转录和降解均增加了。暗线指示所有轨迹的平均值。(c)h2o2增加振荡幅度，同时降低所需的降解时间，揭示clpxp活性的增加。实线：无h2o2；虚线：有h2o2。该针对h2o2的应答中clpxp能力的增加，用于通过使幅度变化对周期的影响最小化而减轻转录噪音的影响，导致有h2o2时周期分布紧缩(模型，图17c、图17d)。图14.增加ts接头序列的长度导致下游模块降解延迟增加。(a)单荧光轨迹分析的详细分析。鉴定的峰为实心圆，槽为空心菱形，上坡10％点为实心方块，以及下坡10％点为实心菱形。两种周期测量值是峰至峰以及两个连续的10％上坡点之间的时间。(b)上图：sfgfp未显示渗透进cfp荧光通道内。用10nm酰基-高丝氨酸内酯(ahl，虚线)诱导sfgfp，显示sfgfp的荧光增加，其在cfp通道内未检测到。底图：使用公开的aav降解标签(andersen,j.b.etal.newunstablevariantsofgreenfluorescentproteinforstudiesoftransientgeneexpressioninbacteria.appl.environ.microbiol.64,2240–2246(1998))，显示下游模块降解延迟15min。(c)在无ts接头序列的情况下，下游模块降解的延迟非常小。(d)单ts接头序列导致延迟10min。(e)双ts接头序列导致延迟16min，这与aav降解序列类似。(f)5-ts接头序列导致延迟25min(使用c–f中显示的数据产生图10c)。在图14c-14f，暗线指示所有轨迹的平均值。图15.通过ahl进行的细胞-细胞通讯，降低了群体时钟中的变异性。(a)相对于平均群体应答，各‘前导’细胞显示群体时钟蛋白的早期激活。(b)在双细胞模拟中，细胞1和细胞2开始分离，其中aiia和luxi的组成型产生略微不同。在t＝100min时，两种细胞通过培养基中的外部ahl相连，显示与具有较短周期的细胞1连接的细胞具有减缓的动力学(细胞2)。(c)细胞1和细胞2开始分离，其中细胞1包含胞内时钟动力学(绿色)，其导致细胞1中较高频率的振荡。当细胞连接时(t＝100)，不含胞内时钟的较慢的细胞2，通过细胞之间的外部ahl通讯连接至较快的细胞上。(d)当在lux启动子下组成型产生噪音的20个细胞的轨迹(不同的线踪迹)的外部ahl池在t＝400min处混合时，使它们同步化。平均轨迹以粗实线显示。(e)细胞同步化之后的周期差异性(右斜线)低于各个细胞(左斜线)。qs：群体-感应振荡器。图16.胞内时钟通过降低群体时钟的周期增加耦合振荡器系统的鲁棒性。(a)移除增加胞内时钟强度的iptg，导致更加规律的振荡(实验)。(b)在无iptg情况下，耦合振荡器的脉冲间隔时间变异性的降低提示，胞内时钟在脉冲间隔动力学中发挥重要作用(实验)。(c)在非常高的流速下，群体时钟振荡不规律。调整胞内时钟降低了群体时钟周期，恢复规律振荡，并因为h2o2生物像素(biopixel)耦合允许集落之间全面水平的同步化。遗传添加胞内时钟(0.1mmiptg)帮助在高流速下同步化群体时钟(430μms-1)。增加胞内时钟的强度并移除iptg，进一步增强了h2o2集落间同步化(实验，粗黑线指示实验踪迹的平均值)。图17.h2o2增加clpxp的降解速率，并且这与lux启动子的转录增加相组合，降低了振荡器周期的变异性。(a)由于h2o2，降解时间显著降低(实验)。(b)由于h2o2导致的降解时间降低，是因为clpxp降解速率的有效增加(实验)。(c)单独的lux启动子的h2o2激活，将仅增加群体时钟振荡的幅度。类低地，clpxp活性的h2o2依赖性增加，仅导致更急剧的降解和较长的脉冲间隔持续时间。这两种作用的组合导致幅度增加以及脉冲间隔持续时间减少，这与实验匹配(模型)。(d)单独地，这两种h2o2作用对降低群体时钟周期cv影响较小，其在这两种作用均存在时才降低(模型)。图18.计算建模和可调谐性。(a)模型由胞内变量(裂解基因e和luxi)以及胞外变量(集落大小和ahl)组成。时间序列的集落大小(上图，虚线)、集落ahl(上图，实线)、胞内luxi(下图，虚线)以及裂解蛋白(底图，实线)在右侧显示。(b)clpxp介导的降解的模型参数空间区域，其作为温度和流的代表(purcell,o.,grierson,c.s.,bernardo,m.&savery,n.j.temperaturedependenceofssra-tagmediatedproteindegradation.journalofbiologicalengineering6,10,2012)，其中模型输出是振荡性增加，伴随着更高的产生项和降解项。(c)来自该计算模型的结果，其显示了通过改变clpxp介导的luxi降解来调谐振荡周期的能力。(d)荧光特性，其显示luxissra(实心圆，株2)和非ssra(空心圆，株1)标记的回路版本的裂解振荡。对于完整的模型信息，参见补充信息。图19.体内细菌动力学。(a)随时间进行的小鼠的ivis成像，所述小鼠荷有两个后侧肿瘤，注射一次稳定的slc-hly株(株8，同步化裂解和疗法)。(b)来自(a)中图像的左(实线)和右(虚线)侧肿瘤的相对发光特性(相对于在0h的发光)。(c)slc-hly株的细菌发光的单肿瘤密度图谱轨迹。(d)来自基因组整合的组成型发光株(株9)的相对发光特性。与静脉注射相比，瘤内注射导致注射后发光高35倍(图23d)。将(b)和(d)中的各线轨迹值显示为图上方的密度图谱。(e)组成型株的细菌发光的单肿瘤密度图谱轨迹。各轴的数据代表单独的实验。(f)单一静脉注射slc+组成型hlye(实线,n＝9只小鼠，株11)、含有组成型hlye的非slc株(虚线，n＝5只小鼠，株12)或者无质粒对照株(虚线，n＝9只小鼠，株7)的皮下荷瘤小鼠，随时间的平均相对体重(***p<0.001，用bonferroni事后检验进行双向anova，s.e.)。(g)具有注射有slc-3株(实线，株10、14和15)以及无质粒对照(虚线，株7)的皮下肿瘤的小鼠，随时间的平均相对体重。在第0、2、6和10天瘤内注射细菌(黑色箭头)(对于这两种情况，n＝10只小鼠，s.e.)。图20.体内疗法。(a)小鼠中肝脏结直肠癌转移的实验性同基因移植模型的示意图，包括细菌或化疗剂(5-fu)的施用时间表。口服递送细菌，而经腹腔内注射递送5-fu。(b)具有肝脏结直肠癌转移的小鼠，随时间的相对体重，所述小鼠饲喂slc-3株(粗实线)，注射有5-fu化疗剂(细实线)或者两者组合(虚线)。误差棒指示5-7只小鼠±1标准误。(c)对于(b)的化疗和工程化细菌疗法的情况，利用ivis成像，通过肿瘤细胞发光来测量中值相对肿瘤活性。(d)来自(b)的组合疗法情况的中值相对肿瘤活性。(c)和(d)的误差棒指示5-7只小鼠的四分位间距。虚线标记相对肿瘤活性0.70。(e)来自(b)中情况的小鼠的分数，其应答为肿瘤活性随时间降低30％。(f)来自(b)中的小鼠随时间的存活分数(**p<0.01，对数秩检验；n＝5–7只小鼠)。图21.slc的不同特性。(a)典型微流体实验的鼠伤寒沙门氏菌的生长室中，每一连续振荡循环所清除的细菌细胞的分数和数目，其包括裂解的影响和阱外的细胞流(株1)。上线：清除分数；底线：清除的细胞。(b)来自(a)中实验的时间序列图像的子集，其显示生长室的一部分，其中初始裂解事件的存活者(160min框，封闭部分)产生对裂解敏感的后代(250min框，封闭的部分)。(c)对于大肠杆菌(株13)，周期是环境温度的函数。对于大肠杆菌中37℃以上的温度，该回路不振荡。误差棒指示12-19个峰±1标准差。(d)在计算模型中群体起始时的集落幅度，所述起始增加luxi激活蛋白的降解。通过鼠伤寒沙门氏菌中luxissra(实线，株2)和非ssra(虚线，株1)标记的回路版本的分批孔板实验，确认了这些结果(插图)。图22.研究裂解介导的胞内释放。(a)具有0.4μm槽的细菌生长室，所述槽用于在释放之后使sfgfp可视化。(b)典型振荡循环的细菌数目(虚线，空心圆)、细菌荧光(实线，实心圆)、槽荧光(实线，空心圆)(株1)。(c)来自(b)的微流体槽的荧光时间序列图像。(d)在微流体装置中进行细菌和癌细胞共培养实验的一般步骤(也参见补充信息)(kolnik,m.,tsimring,l.s.&hasty,j.vacuum-assistedcellloadingenablesshear-freemammalianmicrofluidicculture.labonachip12,4732–4737,2012)。图23.体内表达盒疗法测试。(a)生长～20h之后，减弱的slc株的终点体外发光密度。对于株8和10，宿主株a和b是宿主菌。它们分别是elh1301和elh430(hohmann,e.l.,oletta,c.a.&miller,s.i.evaluationofaphop/phoq-deleted,aroa-deletedliveoralsalmonellatyphivaccinestraininhumanvolunteers.vaccine14,19–24,1996)。含有相同回路的宿主a显示高于宿主b～2倍的发光。(b)荷有注射有基因组整合的组成型发光株(株9)的皮下肿瘤的小鼠，随时间的ivis成像。(c)来自图19中呈现的实验的slc株(裂解+)和组成型株(裂解-)的终点体内细菌发光。误差棒表示来自9个肿瘤的平均细菌发光的标准误。(d)静脉注射(血管)或瘤内(肿瘤)施用的组成型株的注射后体内细菌发光。在注射后～20h测量发光。误差棒分别表示在静脉内和瘤内情况下，来自6个和9个肿瘤的平均细菌发光的标准误。(e)注射有slc-hly(细虚线，株10)、slc-cdd(粗虚线，株14)、slc-ccl21(虚线、株15)以及合在一起(slc-3)(实线)的皮下荷瘤小鼠，随时间的平均相对肿瘤体积。在第0、2、6、8和10天，瘤内注射细菌(黑色箭头)(****p<0.0001，用bonferroni事后检验进行双向anova，n＝14-17个肿瘤，s.e.)。(f)具有注射有slc-3株(实线，株10、14和15)以及无质粒对照(虚线，株7)的皮下肿瘤的小鼠，随时间的平均相对肿瘤体积。在第0、2、6和10天，瘤内注射细菌(黑色箭头)(****p<0.0001，用bonferroni事后检验进行双向anova，n＝18-19个肿瘤，s.e.)。(g)注射有无质粒细菌(株7)、5-fu化疗剂、slc-3株以及slc-3与化疗剂的组合的皮下荷瘤小鼠，随时间的平均相对肿瘤体积变化。在第0、4和7天瘤内注射细菌(黑色箭头)，以及在第2和9天施用化疗剂(白色箭头)(*p<0.05,****p<0.0001，用bonferroni事后检验进行双向anova，n＝12–16个肿瘤，s.e.)。(h)来自(g)中情况的小鼠的分数，其应答为肿瘤体积随时间降低30％。(i)单一静脉注射slc-hly的荷瘤小鼠随时间的平均相对肿瘤体积以及(插图)分数，所述小鼠的应答为肿瘤体积随时间降低30％(n＝17-22个肿瘤，s.e.)。(j)具有肝脏结直肠癌转移的小鼠，随时间的存活分数，所述小鼠饲喂slc-3株(虚线)或无质粒对照(实线)(*p<0.05，对数秩检验；n＝11-12只小鼠)。图24.(a)取自施用后3天具有不同处理的小鼠的肿瘤切片的组织学：(i)静脉注射有治疗性细菌(slc-3)、化疗剂(5-fu)的组合，或者不含治疗物的细菌对照(株7)的组织切片的h&e染色。(ii)相同切片的tunel染色，其指示细胞的凋亡。(iii)相同切片的沙门氏菌免疫组织化学，其确认肿瘤中细菌的存在。(i)、(ii)和(iii)的比例尺表示50μm。(iv)和(v)整个肿瘤部分的tunel和沙门氏菌染色。(iv)和(v)的比例尺表示100μm。使用dapi染色获得(ii)-(iv)中活细胞和死细胞的度量。将所有组的来自20×图像的组织学切片(n＝6)进行比较，并且显示，对于slc-3，标准化为样本面积的tune染色的平均强度显著高于另两组(p<0.0001，单向anova)，并且在化疗剂和仅细菌的情况之间无显著差异。此外，对于slc-3样本，我们观察到了肿瘤的细菌定植以及组织中显著更高的细胞死亡。图25a-i.本研究中使用的一些质粒的图示(更多细节参见本文所述的其它信息)。根据下述描述和所附权利要求，连同考虑到附图，本公开的前述以及其它特征将变得更加显而易见。应理解，这些附图仅描述本公开的一些实施方案，并且其不被认为是限制本公开的范围；将通过使用附图，用其它特异性和细节来描述本公开。本公开的详细描述在下述详细描述中参考附图，附图构成本节的一部分。在附图中，相似的符号通常识别相似的组件，除非上下文另外指明。详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不旨在进行限制。可以使用其它实施方案，并且可以做出其它改变，而不脱离在此呈现的主题的精神或范围。将会容易地理解，如本文通常所述的以及附图中阐明的，可以以多种不同的配置安排、替代、组合以及设计本公开的方面，其全部明确包含在本公开中并且组成本公开的一部分。本文描述的一些实施方案涉及基因回路，其将细菌程序化为在高细胞密度下显示出动态裂解。这对群体进行了剪除，并允许其释放基因编码的治疗性蛋白。我们使用的细菌是基因减弱的‘靶向肿瘤’的细菌(其可能含有致病基因如phop、phoq、aroa和msbb的基因缺失)，其在注射或接种时内化到肿瘤内，并且在坏死组织内生长。由于工程化的细菌仅能够在肿瘤的坏死区域内生长，我们的回路作为群体感应器发挥作用，具体地，其允许肿瘤内有效负载的释放。在一些实施方案中，可将株工程化以产生可以由基因编码的抗肿瘤剂。基因编码的抗肿瘤剂的非限制性实例包括毒素，如溶血素e、蜂毒素、抗微生物肽、白喉毒素、白树毒素和炭疽毒素。基因编码的抗肿瘤剂的其它实例包括来源于非细菌来源的蛋白和小分子，如促凋亡肽和肿瘤归巢肽(如cdd-irgd)，以及引发针对癌症的免疫应答的蛋白，如细胞因子和趋化因子(如il-2、ccl21等)。本文描述了三种治疗株，其作为组合疗法被组合性测试。在一些实施方案中，细菌维持的方法可以是并入产生治疗性多肽的株种。在一些实施方案中，至少一种治疗性多肽是基因编码的抗肿瘤治疗性多肽。例如，一些实施方案利用两种或更多种株，每株产生不同的治疗性多肽，并且相对其它株每株对不同的抗生素敏感，且具有针对不同抗生素的抗性。例如，株a可以具有针对抗生素a的抗性，而株b可以具有针对抗生素b的抗性。在一些实施方案中，可以周期性施用疗法，如每隔一天。例如，可在第一天施用株a和抗生素a，然后在第2天施用株b和抗生素b。可以重复该周期。在一些实施方案中，可以应用细菌素。此类细菌素可以通过细菌产生，然后在裂解时释放以杀死其它细菌(你可以添加针对特定细菌素的抗性)。例如，一个实施方案是三物种系统，其中株a产生杀死株b的细菌素，株b产生杀死株c的细菌素，以及株c产生杀死株a的细菌素。在一个实施方案中，可以在第1天施用株c，然后在第2天施用株b(清除c)，然后在第3天施用株a(清除b)，然后施用株c等。该系统具有消除可以与治疗性细菌竞争的肿瘤环境中存在的细菌的进一步优势。一些实施方案应用治疗性多肽的多相递送。例如，可在两株相同的治疗性细菌中，或者在两种不同的治疗性细菌株中，将两种正交群体感应/裂解系统工程化。群体感应系统是正交的，因为各系统可以独立于来自其它系统的自诱导物发挥功能。在一些实施方案中，本文所述的群体感应系统可以包括细菌中多种已知的系统，如lux、las、rhl或rpa系统。可将这些可选系统配置于质粒上，然后将其转化进细菌内。在一些实施方案中，可以使用含有正交群体感应系统的两株，以递送不同的治疗剂。在一些实施方案中，共培养导致一种群体在一种速率下递送治疗物，并且另一群体在第二速率下递送，如果两种正交群体感应系统之间的生长或回路特性不同，则这可以实现。由于裂解由内至外发生，因此系统不是耦合的。其它实施方案可以包含下述：1.使用株递送疗法，其不够有效却是快速作用/运输的治疗物，所述治疗物将通过使用引起快速或高频裂解的我们的回路变异用于“弱化”癌细胞。这可以与产生有效但可能缓慢作用的治疗物的较低频率递送或裂解的株组合。不同药物作用的时标很重要—用一种药物弱化防御，然后用其它药物降低捶打。可以通过以下更加详细讨论的不同方法来调谐裂解的频率。高频和低频裂解株可以是用含有合适的修饰以实现期望的裂解频率的裂解回路(sdc或slc)转化的株。2.使用一株诱导癌细胞的进化，以使它们更易受通过第二株递送的疗法的影响。3.两株的共存。两种共裂解系统导致同一培养物中两种细菌的长期稳定。即，含有驱动裂解的不同周期的正交群体感应系统的两株将导致其中的两株在共培养物中共存的群体。由于裂解，群体均不能掌控。这可以随着第一株的生长和裂解至在共培养物中达到群体阈值而可视化。一旦第一株遭遇裂解事件，其群体减少，这允许第二株生长并达到其裂解阈值。第二株遭遇裂解，从而使两株的动力学和共存保持。在一些实施方案中，可将肿瘤中既有的细菌改变为在期望的细胞密度下释放治疗性蛋白。例如，在一些实施方案中，可以使用细菌接合以采用裂解回路和治疗物来转化肿瘤环境中已经存在的细菌。然后天然的细菌就能够杀死递送细菌(信使)，以便你将裂解系统转染至已经驻留在肿瘤环境中的细菌内。出于该目的，我们将探索泛宿主性接合系统的用途。一些实施方案可以在大的肿瘤环境中利用同步裂解，以协调对多个坏死核心的攻击。例如，在一些实施方案中，可以使用于2012年12月14日提交，并且名为“利用合成生物学协调细胞活性的多尺度平台(multiscaleplatformforcoordinatingcellularactivityusingsyntheticbiology)”的pct申请第pct/us2012/069914号中描述的组合物和方法，将其通过引用整体并入本文，或者使用于2011年12月16日提交的美国临时专利申请第61/576,976号中所述的组合物和方法，将其公开内容通过引用整体并入本文。具体地，在一些实施方案中，可以在厘米长度范围内使用同步振荡器。在一些实施方案中，使用h2o2大范围信号转导，以在肿瘤长度范围内同步裂解破裂。在此种环境下，不需要微流体“像素”来容纳集落，因为裂解限定了集落大小，而无需限制性几何图形。除了在厘米规模内同步递送，还存在自由基与癌相互作用的可能。一些实施方案通过工程化细菌使用基因回路，利用在细菌中构建复杂行为的能力来显示振荡裂解。我们使用之前hasty组所描述的基因振荡器的基因回路基序，其中我们利用耦合的负反馈和正反馈环。群体裂解允许我们将细菌群体保持较低，帮助我们避免全身炎症应答。由于群体裂解周期性发生，有效负载的释放也以脉冲方式发生。此外，系统仅在允许细菌达到阈值大小的环境中释放内部有效负载。因此，可将一些实施方案看做靶向肿瘤的装置，其能够在肿瘤内部的密集群体中自我触发，释放内部有效负载，并使细菌群体维持在较低水平以避免有害的免疫应答。相对于利用来自可诱导型启动子的治疗性蛋白简单表达的其它方法(经化学或环境信号)，本发明的组合物和方法提供了优势。本文所述的术语“可调控型启动子”、“可诱导型启动子”可互换使用，并且指活性受顺式或反式作用因子影响的任何启动子。在一些实施方案中，“可调控型启动子”指在针对外部条件进行应答中激活或阻抑转录的启动子，所述外部条件如分子控制元件的存在或不存在(例如，酰基高丝氨酸内酯—ahl)或ph或温度。可调控型启动子的一般和特定实例众所周知，并且容易获得。此类其它方法不依赖于动态递送，但是更简单地依赖于某种基因产物的组成型产生。此外，此类其它方法不利用用于靶向肿瘤的细菌的自我触发的群体控制(例如，经裂解)的策略。一些实施方案包含重组质粒，所述重组质粒形成基因回路，并且由耦合的正反馈和负反馈基因元件组成。例如，在一些实施方案中，正反馈基因元件可以利用驱动来自luxi启动子的基因表达的lux群体感应系统(由luxi和luxr基因组成)。该启动子允许luxi、裂解和报告基因的转录。因此，一旦被激活，该启动子则驱动负反馈元件(来自噬菌体φx174的裂解基因e以及荧光或发光报告基因)的转录。含有这些回路质粒的细菌群体(工程化的细菌)将产生luxi蛋白，其酶解产生ahl(酰基高丝氨酸内酯)，ahl是能够在集落中邻近细胞之间扩散并使集落同步进行pluxi转录(luxi启动子)的小分子。ahl随后结合luxr蛋白，当ahl浓度达到阈值水平时，其激活来自luxi启动子的转录。因此，工程化的细菌群体将生长至阈值群体大小，在该点集落内已累积足够的ahl以激活来自luxi启动子的转录，并产生裂解蛋白。一部分群体将裂解，剩余小的集落尺寸，从而降低ahl浓度。然后这些存活的细菌再生长至阈值群体大小，并显示出另一裂解事件。该过程以周期性的方式持续。在裂解时，细胞将向细胞外隙释放胞内内容物，包括治疗性基因的产物。因此，群体动态减弱，同时释放胞内有效负载。对于以上所述的线路图和不同阶段的示意图参见图1。在一些实施方案中，可以使用工程化的靶向肿瘤的细菌来向肿瘤动态递送治疗性蛋白，并维持小的体内印迹。一些实施方案涉及关于通过基因回路程序化细菌以在高细胞密度下显示出动态裂解的方法、材料和装置/系统。这减弱了群体，并允许其释放基因编码的治疗性蛋白。使用的细菌可以是减弱的‘靶向肿瘤’的细菌，其在注射或接种时在肿瘤内内化，并在坏死组织内生长。由于工程化的细菌仅能在肿瘤的坏死区域内生长，因此回路作为群体感应器发挥作用，具体地，其允许肿瘤内有效负载的释放。在一些实施方案中，重组质粒形成基因回路，并且其包含耦合的正反馈和负反馈基因元件。合适的正反馈基因元件的实例包括但不限于：lux群体感应系统以及其它群体感应系统，如las、rhl和rpa系统(waters,christopherm.,andbonniel.bassler."quorumsensing:cell-to-cellcommunicationinbacteria."annu.rev.celldev.biol.21:319-346,2005,schaefer,amyl.,etal."anewclassofhomoserinelactonequorum-sensingsignals."nature454:595-599,2008)。合适的负反馈基因元件的实例包括但不限于可在细菌中使用的任一裂解系统，如来自噬菌体φx174的裂解基因e、λ噬菌体裂解基因、来自产生大肠杆菌素的细菌的e7裂解基因等。在本文所述的一些实施方案中，正反馈基因元件可以包含驱动来自luxi启动子的基因表达的lux群体感应系统(包含luxi激活子和luxr基因)。该启动子允许luxi、裂解和报告基因的转录。因此，一旦被激活，该启动子则驱动负反馈元件的转录，例如来自噬菌体φx174l的裂解基因e以及荧光或发光报告基因。含有这些回路质粒的细菌群体(工程化细菌)将产生luxi蛋白，对于lux系统，其酶解产生ahl(酰基高丝氨酸内酯)，ahl是能够在集落内的邻近细胞之间扩散并使集落同步进行pluxi转录(luxi启动子)的小分子。不同的ahl作为不同群体感应系统(如las、rhl和rpa系统)的自诱导物发挥作用。随后ahl结合luxr蛋白(或各r蛋白，如lasr、rhlr或rpar)，当ahl浓度达到阈值水平时，其激活来自luxi启动子的转录。因此，工程化的细菌群体将生长至阈值群体大小，在该点集落内已累积足够的ahl以激活来自luxi启动子的转录并产生裂解蛋白。一部分群体将裂解，剩余小的集落尺寸，从而降低ahl浓度。然后这些存活的细菌再生长至阈值群体大小，并显示出另一裂解事件。该过程以周期性的方式持续。在裂解时，细胞将向细胞外隙释放胞内内容物，包括治疗性基因的产物。因此，群体动态减弱，同时释放胞内有效负载。相对于利用来自可诱导型启动子的治疗性蛋白简单表达的其它方法(经化学或环境信号)，本发明的组合物和方法提供了优势。这些其它方法不依赖于动态递送，但是更简单地依赖于某种基因产物的组成型产生。此外，此类其它方法不利用用于靶向肿瘤的细菌的自我触发的群体控制(例如，经裂解)的策略。一些实施方案利用2014年4月9日网上公开的“rapidandtunablepost-translationalcouplingofgeneticcircuits”nature508,387–391(17april2014),byarthurprindle,jangirselimkhanov,howardli,ivanrazinkov,levs.tsimring&jeffhasty中所述的基因回路，将其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可将前述公开物中描述的技术和基因回路用于本文所述的方法和组合物中不同药物和不同频率的递送。诸如溶瘤病毒和工程化的免疫细胞的生活疗法，作为癌症的治疗以及正在进行的黑素瘤、癌和白血病的临床试验的替代方案出现(o’shea,c.c.viruses–seekinganddestroyingthetumorprogram.oncogene24,7640–7655(2005)；june,c.h.etal.engineeredtcellsforcancertherapy.cancerimmunology,immunotherapy1–7(2014)；miest,t.s.&cattaneo,r.newvirusesforcancertherapy:meetingclinicalneeds.naturereviewsmicrobiology12,23–34(2014))。同时，长久以来细菌作为病原体的整体观点已让步于人体内功能微生物的广泛流行这一理解(cho,i.&blaser,m.j.thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.naturereviewsgenetics13,260–270(2012)；xuan,c.etal.microbialdysbiosisisassociatedwithhumanbreastcancer.plosone9,e83744(2014)；fischbach,m.a.,bluestone,j.a.&lim,w.a.cell-basedtherapeutics:thenextpillarofmedicine.sciencetranslationalmedicine5,179ps7–179ps7(2013))。鉴于该大环境，某些细菌将进化为优先在肿瘤内生长可能是不可避免的，因此为工程化疗法的发展提供了天然的平台(pawelek,j.m.,low,k.b.&bermudes,d.tumor-targetedsalmonellaasanovelanticancervector.cancerresearch57,4537–4544(1997)；ruder,w.c.,lu,t.&collins,j.j.syntheticbiologymovingintotheclinic.science333,1248–1252(2011)；weber,w.&fussenegger,m.emergingbiomedicalapplicationsofsyntheticbiology.naturereviewsgenetics13,21–35(2011))。尽管已经利用对肿瘤内微生物的定位来刺激宿主免疫系统靶向癌细胞，此类疗法在理想情况下由程序化以安全避免全身炎症应答但持续产生局部释放的抗肿瘤物质的细菌组成(baban,c.k.,cronin,m.,d.,g.c.&tangney,m.bacteriaasvectorsforgenetherapyofcancer.bioengbugs1,385–394(2010)；cann,s.h.,vannetten,j.&vannetten,c.drwilliamcoleyandtumourregression:aplaceinhistoryorinthefuture.postgraduatemedicaljournal79,672–680(2003)；davila,m.l.etal.efficacyandtoxicitymanagementof19-28zcartcelltherapyinbcellacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine6,224ra25–224ra25(2014))。在此，我们将临床测试的细菌工程化以在阈值群体密度下裂解，并释放基因编码的抗肿瘤治疗物。在裂解时，少量存活的细菌使群体再接种，从而导致脉冲裂解和具有隐形体内印迹的递送循环。我们使用微流体装置来表征工程化细菌的鲁棒性和可调谐特性，并且我们分别证实了在微恒化器中与人癌细胞共培养时以及分批培养时它们的治疗潜力。我们利用荧光素酶监测体内递送动力学，对同系结直肠小鼠癌症模型中裂解程序的隐形性质进行了测试。相比于非程序化的株，突出强调的峰与平均集落发光的32倍降低相关，连同与最终肿瘤体积降低2倍相关。我们的平台可能实施与诸如病毒和纳米颗粒的其它治疗剂联合的新型递送策略(cheong,i.etal.abacterialproteinenhancesthereleaseandefficacyofliposomalcancerdrugs.science314,1308–1311(2006))。为了将细菌工程化以在肿瘤环境内维持安全的群体水平，我们利用之前显示能够产生鲁棒性振荡动力学的耦合的正反馈和负反馈环设计了隐形递送回路(sdc)(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010)；prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))。在本公开中术语“同步裂解回路”(slc)和“隐形递送回路”(sdc)可互换使用。在我们的回路中(图1a)，常见的启动子分别驱动其自身激活子(正反馈)和裂解基因(负反馈)。例如，luxi启动子调控自诱导物(ahl)的产生，所述自诱导物结合luxr并使之能够转录激活所述启动子。对于来自含有它们各自的ahl、r蛋白和激活子蛋白的细菌的其它群体感应系统而言也是这种情况。此类组件的实例包括：rhlr、lasr、lasi或rhli。负反馈起源于由也受luxi启动子控制的细胞裂解基因(其可以是，例如φx174e、e7裂解基因、或者来自噬菌体λ的其它裂解基因)触发的细胞死亡(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012)；young,k.d.&young,r.lyticactionofclonedphix174genee.journalofvirology44,993–1002(1982)；marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909(2010))。重要的是，ahl可以扩散至邻近细胞，从而提供细胞间同步机制。起源于隐形递送回路的动力学，可以概念化为ahl缓慢积累至阈值水平，随后是快速剪除群体并使其能够释放细菌内容物的裂解事件(图1b)。裂解之后，少量剩余的细菌开始重新产生ahl，并且以循环方式重复该过程。我们使用微流体装置来观察生长、裂解和蛋白释放，其中sfgfp作为治疗物表达的代表。在减弱的鼠伤寒沙门氏菌中测试我们的回路，我们在微流体室中观察到周期性的裂解事件，其中荧光报告基因特性中的峰与群体裂解相对应(图1c)。振荡稳定，并且不随时间衰减，在生长18小时内产生总细胞数目变化小于5％的一致的群体大小(图5a)。此外，由于体内微环境由环境条件波动表征，我们对不同的孵育温度(36℃至40℃)和灌注速率(100μm/s至200μm/s)进行了测试，在所有条件中测量了3个小时的平均周期(图1d)。在本文提供的补充视频1、2和3的讨论中进一步总结了这些实验的结果。因此我们预期sdc产生稳定的裂解循环，并在面对体内环境中可能遇到的环境干扰时释放。我们开发了计算模型来探究影响sdc的鲁棒性的参数(图2a和补充信息)。我们发现，高的产生和降解速率导致参数空间内振荡动力学的更广泛的区域。这解释了我们的下述观察：鼠伤寒沙门氏菌中的振荡比大肠杆菌中的更稳定，但是发现蛋白产生和降解的速率更低(prindle,a.etal.geneticcircuitsinsalmonellatyphimurium.acssyntheticbiology1,458–464(2012))(图5b-e)。因此，回路的鲁棒性行为最终依赖于宿主菌的固有参数。由于操纵回路行为的能力极大提高了在不同环境中应用我们的系统的多功能性，通过在luxi蛋白上添加ssra降解标签序列，我们探究了裂解周期的可调谐性。我们观察到表达幅度的～3倍的增加和周期的～2倍的增加，这与模型预测一致(图2b-c)。通过经胞外ahl的化学诱导，我们还探究了回路行为的可调谐性。我们的计算模型预测了在饱和浓度下‘稳定的群体裂解(图2d，插图)。此外或者可选地，也可使用多种合适的方法和技术来改变循环周期，包括改变细菌的生长率、启动子强度、核糖体结合位点(rbs)强度和/或使用不同的群体感应系统。在高ahl浓度下测试回路，我们发现细胞生长和裂解似乎是平衡的，在移除胞外ahl时回复至振荡行为(图2d。这些实验的结果进一步记录于视频(补充视频4)中，其描述了60×放大倍数下株1(鼠伤寒沙门氏菌)中sdc的慢速摄像荧光显微镜像。该视频显示，在实验的第一部分，使用含有200nmahl的培养基，并且可以观察到细菌进入持续裂解状态。在装置中，通过荧光染料指示(红色通道)。然后将培养基转变为不含ahl的另一来源，其中不存在荧光染料，并且细菌回复至振荡状态，其中在成像结束前集落持续4个裂解循环。室的大小为100×100μm，并且每2min拍摄图像。因此，sdc表示能够显示出振荡和组成型模式的群体裂解的通用系统。为了将治疗性功能掺入sdc，我们添加了另一模块以包含被用作抗肿瘤治疗性毒素的大肠杆菌的溶血素e或hlye拷贝(ryan,r.etal.bacterialdeliveryofanovelcytolysintohypoxicareasofsolidtumors.genetherapy16,329–339(2009)；nguyen,v.h.etal.geneticallyengineeredsalmonellatyphimuriumasanimageabletherapeuticprobeforcancer.cancerresearch70,18–23(2010))。通过用位于生长室之下的小的微流体槽使释放的sfgfp可视化，我们确认了回路释放胞内内容物的能力(图6a-c)。为了使体外细菌裂解和杀死癌细胞可视化，我们采用了新型微流体技术，从而使癌细胞粘附在侧面接有更小的细菌生长室的生长通道内部，以允许细菌裂解和癌细胞死亡单细胞可视化(图6d)。将含有回路的鼠伤寒沙门氏菌与hela细胞共培养，我们观察到在细菌裂解起始时hela细胞死亡，指示有效的毒素释放(图3a-b)。在本文提供的补充视频5和6的讨论中进一步总结了这些实验的结果。在初始sfgfp荧光～111min内实现了阱外部细胞的完全死亡(图3c)。因此，sdc能够释放体外杀死癌细胞所必需的水平的hlye。为了证实治疗活性的机制，我们评估了释放的细菌内容物的毒性以及来自未裂解的组成型hlye表达的基础毒素释放。如所预期的，我们发现暴露于来自含有hlye模块的sdc培养物的上清液的hela细胞，几乎显示出活力的完全丧失(图3d)。暴露于不含hlye模块或者含有不裂解的组成型hlye株的sdc上清液的hela细胞，显示出活力～15％的轻微丧失。我们推断，裂解允许hlye的有效体外释放，并且天然的胞内细菌内容物不显著影响hela细胞的活力。通过在孔板中用hela培养物接种不同数量含有回路的细菌，我们进一步研究了含有hlye的sdc的药物递送性质。由于细菌达到群体阈值所需的时间延长，我们观察到hela细胞从起始接种至死亡的时间，随细菌接种体积的降低而延长(图3e)。这些实验的结果也记录于视频(补充视频7)中，其描述了在20×放大倍数下，在组织培养孔板中共培养的细菌和癌细胞。该视频显示，株4(运动的鼠伤寒沙门氏菌，含有hlye的sdc)负载于含有单层hela细胞的孔中。细菌生长之后，通过绿色荧光蛋白(gfp)的表达，群体事件被可视化。此后不久，可以观察到hela细胞显示出细胞死亡。每1min拍摄慢速荧光显微图像。我们还观察到，诸如sfgfp和裂解基因e的群体依赖性基因的起始速率或产生速率，随接种密度升高而增加。通过关键释放时间或者起始至hela细胞死亡的时间对起始速率的依赖而确认这点。增加的速率与较短的释放时间相对应，指示增加的裂解和治疗物释放，尽管所有情况中所需的暴露量级似乎相似(图3f)。这样，接种的细菌量决定回路的起始时间和释放性质。通过能够有效递送治疗物的稳定回路，我们旨在表征我们系统的体内动力学。细菌在肿瘤疗法中的用途已经公认了超过一个世纪(coley,w.b.thetreatmentofinoperablesarcomabybacterialtoxins(themixedtoxinsofthestreptococcuserysipelasandthebacillusprodigiosus).proceedingsoftheroyalsocietyofmedicine3,1(1910))，并且某些兼性厌氧细菌如鼠伤寒沙门氏菌具有在肿瘤的坏死区域内优先定位并形成集落的能力(forbes,n.s.engineeringtheperfect(bacterial)cancertherapy.naturereviewscancer10,785–794(2010))。为了确保回路在抗生素筛选不存在的情况下的长期稳定性，我们整合了用于质粒保留和分离的稳定化元件(gerdes,k.theparb(hok/sok)locusofplasmidr1:ageneralpurposeplasmidstabilizationsystem.naturebiotechnology6,1402–1405(1988)；wood,t.,kuhn,r.&peretti,s.enhancedplasmidstabilitythroughpost-segregationalkillingofplasmid-freecells.biotechnologytechniques4,39–44(1990)；derman,a.i.etal.phylogeneticanalysisidentifiesmanyuncharacterizedactin-likeproteins(alps)inbacteria:regulatedpolymerization,dynamicinstabilityandtreadmillinginalp7a.molecularmicrobiology73,534–552(2009))。此外，我们将hlye和luxcdabe基因(体内报告模块)置于luxi启动子下，其经细菌发光而作为hlye产生和群体起始的指示物(图1a)。利用免疫活性小鼠中结直肠癌的皮下模型(mc26细胞系)，我们经静脉内或瘤内注射治疗性隐形递送回路(tsdc)(图7b)。如之前所观察到的，细菌定位于肿瘤微环境中，并按常规获得ivis测量值(danino,t.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.measuringgrowthandgeneexpressiondynamicsoftumor-targeteds.typhimuriumbacteria.jove(journalofvisualizedexperiments)e50540–e50540(2013))。我们观察到来自在细菌发光中突出强调的14hr和76hr峰的回路行为被定位于肿瘤区域(图4a-b)。然后我们对含有整合的组成型发光盒的对照株进行了测试，并观察到细菌发光的稳定增加，其不显示突出强调的峰(图4c)。我们还观察到，来自含有tsdc的肿瘤的发光强度平均低于组成型株～32倍，指示集落大小的减小(图4c，右图)。这些结果显示，tsdc在体内保留动力学行为，并且能够减弱肿瘤中的细菌群体。然后我们研究了我们的回路对肿瘤体积和小鼠体重的影响。在静脉注射tsdc的小鼠中，肿瘤体积在前三天内略微减小，并在其后显示出生长障碍(图4d，左图)。用不含质粒的细菌处理的肿瘤的大小，从第一天开始达到超过3倍的增加，其中最终肿瘤体积高于治疗情况下～2倍(图4d，右图)。与对照相比，治疗情况的肿瘤体积轨迹也显示出减小的差异(图4d，中图)。在注射后体重开始下降之后，治疗性回路和不含质粒的对照小鼠均在6-11天内恢复全部体重(图4e和图7c)。我们还对回路进行了测试，其中组成型地产生治疗物，并且其中用于裂解的luxi激活子被移除，导致裂解基因的基础表达(图7d)。与不含质粒的对照和tsdc相比，使用该株我们在前5天内观察到体重显著下降16％(图4e)。我们的结果指示实施了群体裂解，并且治疗在小鼠中导致显著的治疗效果以及安全的健康特性。工程化细胞在临床中的超前应用将需要稳定且动态的基因回路，其可以在不同环境中执行复杂的功能。通过调整药物递送的频率和幅度，利用这些类型的回路可以使新的治疗策略成为可能。未来的进步可能允许释放多种治疗物，细菌感应器的构建允许局部肿瘤环境的基因读出或者编码动态且低剂量的药物递送特性(lien,k.,georgsdottir,s.,sivanathan,l.,chan,k.&emmenegger,u.low-dosemetronomicchemotherapy:asystematicliteratureanalysis.europeanjournalofcancer(2013)；shaked,y.etal.low-dosemetronomiccombinedwithintermittentbolus-dosecyclophosphamideisaneffectivelong-termchemotherapytreatmentstrategy.cancerresearch65,7045–7051(2005)；thakur,m.d.etal.modellingvemurafenibresistanceinmelanomarevealsastrategytoforestalldrugresistance.nature494,251–255(2013))。此外，此类工程化策略可能允许在由工程化的病毒、细菌和宿主细胞(如t细胞)组成的肿瘤环境中构建治疗性群体。多成员协同工作的环境可以导致在肿瘤不同区域内实施不同的治疗功能。方法株和质粒在37℃培养箱中，于分别含有50μgml-1和34μgml-1卡那霉素和氯霉素以及0.2％葡萄糖的lb培养基中，培养我们的回路株。在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(cellgro30-002-ci)的dmem培养基中培养哺乳动物细胞，将其置于37℃下维持在5％co2的组织培养箱内。利用cpec克隆方法或者利用标准限制性消化/连接克隆来构建质粒(quan,j.&tian,j.circularpolymeraseextensioncloningofcomplexgenelibrariesandpathways.plosone4,e6441(2009))。激活子质粒(kan,cole1)已在我们组之前的工作中使用，而通过下述构建裂解质粒：经pcr从epop质粒中获得裂解基因e，并将其克隆进载体(chlor,p15a)，其受luxi启动子的控制(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012)；marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909(2010))。经pcr从mg1655的基因组dna中获得hlye基因，并将其克隆进裂解质粒，其受ptac或pluxi启动子的控制(deboer,h.a.,comstock,l.j.&vasser,m.thetacpromoter:afunctionalhybridderivedfromthetrpandlacpromoters.proceedingsofthenationalacademyofsciences80,21–25(1983))。用hela细胞和运动或不运动的鼠伤寒沙门氏菌sl1344进行共培养。对于全株和质粒信息，请参考补充信息。微流体和显微镜检查该研究中使用的微流体装置和实验制备方案，与我们组之前所报道的那些相似(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))。细菌生长室的面积为100x100μm，并且高度大约为1.4μm。对于芯片上的共培养实验，我们首先以非常低的流速将hela细胞的悬浮培养物负载于装置培养基通道内，以允许粘附，然后将装置在组织培养箱中培养0.5-2天，以允许增殖(kolnik,m.,tsimring,l.s.&hasty,j.vacuum-assistedcellloadingenablesshear-freemammalianmicrofluidicculture.labonachip12,4732–4737(2012))。在实验那一天，将装置转移至显微镜，并在成像前将含有回路的细菌负载于生长室内。利用photometricscoolsnapcooledccd相机，用nikonti2进行图像获取。利用nikonelements软件将范围和附件程序化。对于微流体和显微镜检查的其它细节，可见于补充信息中。体内实验肿瘤模型：用来自植入的小鼠结肠癌细胞系(mc26,tanabelab,massachusettsgeneralhospital)的两侧皮下后侧肿瘤，对6周龄雌性balb/c小鼠(taconic)进行动物实验。制备肿瘤细胞，用于在1e8个细胞ml-1dmem(无酚红)的浓度下植入。然后以每侧100μl的体积经皮下植入细胞，其中各植入物由1e7个细胞组成。肿瘤生长大约2周，直至达到直径4-10mm。细菌生长和施用：对于体外实验，使细菌株在含有适当抗生素和0.2％葡萄糖的lb培养基中生长过夜。在注射开始的那一天，开始在含有抗生素的新鲜培养基中1/100×稀释，并且生长直至od<0.1，以阻止细菌达到群体阈值(特别是对于sdc)。在注射进小鼠之前，用无菌pbs将细菌离心沉淀并洗涤2-3×。经下述递送细菌株：对于发光轨迹实验，瘤内注射；或者对于肿瘤治疗实验，静脉注射。以5e7个细胞ml-1pbs的浓度进行瘤内注射，其中每个肿瘤注射30-40μl的总体积。以5e7个细胞ml-1pbs的浓度进行静脉注射，其中经尾静脉注射的总体积为100μl。施用后监测：在细菌注射之后，用ivis光谱体内成像系统测量发光信号。将测量值相对于注射前的数值进行比较，以追踪细菌生长和裂解循环。利用卡尺定量肿瘤体积，以在整个成像过程中测量各肿瘤的长度、宽度和高度。将体积与注射前的数值进行比较，以追踪肿瘤的生理生长。在实验开始前将小鼠称重，并且通常在起始点之后每天一次，以监测体重和整体健康。进行的动物实验一式两份，其中结果相似。宿主株以及培养使含有我们的裂解回路的株在37℃振荡培养箱中，于含有50μgml-1和34μgml-1各抗生素(卡那霉素和氯霉素)以及0.2％葡萄糖的lb培养基中生长。添加葡萄糖以降低来自luxr启动子的表达，因为该启动子具有cap-camp激活复合物的结合位点(meighen,e.a.geneticsofbacterialbioluminescence.annualreviewofgenetics28,117–139(1994))。当细胞中的葡萄糖水平较高时，camp水平较低，降低了来自cap-camp的转录激活。对于微流体实验，我们选择不运动的鼠伤寒沙门氏菌用于我们的回路sl1344(m913:flighi突变体)(stecher,b.etal.flagellaandchemotaxisarerequiredforefficientinductionofsalmonellaentericaserovartyphimuriumcolitisinstreptomycin-pretreatedmice.infectionandimmunity72,4138–4150(2004))。对于用于治疗和体重的孔板共培养实验以及体内实验，我们利用减弱的鼠伤寒沙门氏菌宿主sl1344(elh1301:δphopqδaroa)，其在之前的工作中显示在质粒保留方面具有良好的效率(danino,t.,lo,j.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.n.invivogeneexpressiondynamicsoftumor-targetedbacteria.acssyntheticbiology1,465–470(2012))。对于测量回路的发光表达的体内实验，我们利用另一减弱的鼠伤寒沙门氏菌sl1344株作为回路宿主(elh430:δphopq)，其中发光表达较高(参见图7a和图23a)。对于组成型发光的情况，我们使用含有组成型发光盒的表征良好的细菌：与p16slux整合的大肠杆菌nissle1917(riedel,c.u.etal.constructionofp16slux,anovelvectorforimprovedbioluminescentlabelingofgram-negativebacteria.appliedandenvironmentalmicrobiology73,7092–7095(2007))。株和质粒列表显示于以下表1和2中。表1.表2.株#株名称宿主菌质粒1mod47sl1344，m913ptd103luxl(-laa)sfgfp+pza35x714e<+luxr)2mod46asl1344，m913ptd103luxlsfgfp+pza35x714e(+luxr)3mod67sl1344，m913ptd103luxl(-laa)sfgfp+pza35x714e(+luxr)ptaczhlye4mod61sl1344，elh1301ptd103luxlsfgfp+pza35x714e(+luxr)ptaczhtye5mod64sl1344，elh1301ptd103luxlsfgfp+pza35x714e(+luxr)6mod65sl1344，elh1301pza35ptaczhlye7elh1301sl1344，elh1301n/a8mod105sl1344，elh430pze25luxlluxcdabehok/alp+pza35x714e(+luxr)plux：：hlyehok/alp9ecn-luxcdabenissle1917n/a10mod101sl1344，elh1301pze25luxlluxcdabehok/alp+pza35x714e(+luxr)pluxxhlyehok/alp11mod102sl1344，elh1301pze25luxlluxcdabehok/alu+pza35x714e(+luxr)ptac；；hlyehok/alp12mod69sl1344，elh1301ptd103luxcdabehok/alp+pza35x714e(+luxr)ptac：：hlyehok/alp13mod29js006，bw25113ptd103luxlsfgfp+pza35x714e(+luxr)14mod110sl1344，elh1301pze25luxlluxcdabehok/alp+pza35x714e(+luxr)pluxzcdd-irgdhok/alp15mod1125l1344，elh1301pze25luxlluxcdabehok/alp+pza35x714e(+luxr)ptac：：mccl21hok/alp对于共培养实验，我们使用补充有10％胎牛血清和回路的合适抗生素的dmem(完全培养基)中的hela细胞系。hela细胞最初在含有青霉素/链霉素(cellgro30-002-ci)的生长培养基中生长，并且在实验之前将其置于37℃下含有5％co2的组织培养箱中。为了负载于微流体芯片或孔板中，最初用dpbs洗涤hela细胞，并用0.05％或0.25％的胰蛋白酶edta解吸附。然后使细胞沉淀，并重悬于dmem+fbs以及合适的抗生素中。质粒我们的回路由激活子质粒和裂解/治疗性质粒这两种质粒组成。主要的激活子质粒是ptd103luxisfgfp，其已在我们组之前的工作中使用(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))。该质粒在luxi和sfgfp(超折叠的绿色荧光蛋白变体)上含有ssra-laa降解标签(氨基酸序列aandenyalaa)(pédelacq,j.-d.,cabantous,s.,tran,t.,terwilliger,t.c.&waldo,g.s.engineeringandcharacterizationofasuperfoldergreenfluorescentprotein.naturebiotechnology24,79–88(2005))。通过从luxi上移除ssra-laa标签来构建ptd103luxi(-laa)和ptd103luxi(ts)。大部分构建利用cpec克隆方法完成(quan,j.&tian,j.circularpolymeraseextensioncloningofcomplexgenelibrariesandpathways.plosone4,e6441(2009))。利用由p15a复制起点和氯霉素抗性标志物组装的模块化的pz质粒构建裂解质粒(lutz,r.&bujard,h.independentandtightregulationoftranscriptionalunitsinescherichiacoliviathelacr/o,thetetr/oandarac/i1-i2regulatoryelements.nucleicacidsresearch25,1203–1210(1997))。来自噬菌体φx174的裂解基因e由lingchongyou友情提供，并且经pcr来自之前报道的epop质粒(marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909(2010))。e基因置于luxr-ahl激活型luxi启动子的表达之下。为了构建治疗版本的裂解质粒，我们经pcr从大肠杆菌株mg1655的基因组dna中提取hlye基因，并将其插入裂解质粒中。对于体外表征，用于驱动毒素表达的启动子是tac启动子，以及对于体内测试，是luxi启动子。这与基因末端的转录终止子一起形成治疗性毒素盒。在插入合适的质粒之前，将cdd-irgd和mccl21基因作为片段合成。对于在用于体内测试的回路株中使用的质粒，我们将两个稳定化元件hok/sok系统和alp7分隔系统插入激活子和裂解/治疗性质粒中。近期的工作显示，添加来自枯草芽孢杆菌(b.subtilis)质粒pls20的hok/sok毒素-抗毒素系统和alp7ar盒，使得质粒在体内几乎全部保留(gerdes,k.theparb(hok/sok)locusofplasmidr1:ageneralpurposeplasmidstabilizationsystem.naturebiotechnology6,1402–1405(1988)；wood,t.,kuhn,r.&peretti,s.enhancedplasmidstabilitythroughpost-segregationalkillingofplasmid-freecells.biotechnologytechniques4,39–44(1990))。对于该研究中使用的质粒的图谱，参见图8和图25。显微镜检查和微流体本文所述的显微镜检查和微流体技术，与我们组之前所报道的那些相似(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010))。简言之，我们的微流体装置由pdms(聚二甲硅氧烷)构建，其被模塑并在硅片上烤，其中通过交联的光致抗蚀剂形成微米刻度特征。然后将各装置(由从硅片转移至pdms的一组特征所形成)从烤过的pdms中裁出，并且在装置中刺孔以允许流体线相连。然后将装置结合在盖玻片上，并置于显微镜台上以进行细胞复制和成像。流体线与来自提供培养基、细胞或作为废物槽发挥作用的不同注射器的装置相连。通过改变相关注射器之间的相对高度而产生液体静压力驱动的流动来控制装置中的流动方向。在负载于装置上之前，我们将细胞培养至大约0.1(利用来自plastibrand的1.5ml比色杯)的光密度(a600nm)。在负载之前，用培养基注射器‘湿润’装置，以移除通道内的气泡(ferry,m.,razinkov,i.&hasty,j.microfluidicsforsyntheticbiologyfromdesigntoexecution.methodsenzymol497,295(2011))。通过降低指定的废物端口从细胞端口负载装置，以使细胞负载注射器和废物注射器的高度相对改变，导致细胞从细胞端口流向废物端口。一旦细胞负载在阱内，则流动方向反转，允许培养基流入所有端口内，从而向阱内的细胞提供连续的营养素灌注。在这些微流体实验中，我们向培养基和细胞悬液中添加0.075％tween20，以防止细胞粘附在装置内的通道和端口上。如之前所述，在侧阱阵列装置中完成图1-2中用于表征回路行为的实验(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010))。与gfp槽一同使用的装置也布置为侧阱阵列。对于阱和槽的示意图，参见图6a和图22a。对于芯片上的共培养实验，我们利用侧阱阵列装置，并用弯曲通道在所有入口/出口端口上添加流体阻力，以增加可实现的流速的动态范围。对于哺乳动物细胞的负载，在负载之前，将细胞进行胰蛋白酶作用、沉淀并悬浮于0.5-1.0mldmem+fbs+抗生素(卡那霉素和氯霉素)中。在光学显微镜下负载细胞，以在接近停滞的流动条件下，使未粘附的细胞定位于培养基通道内。然后将微流体芯片和注射器设备小心置于co2培养箱中，同时避免注射器相对高度的任何改变，以维持几近停滞的流动。允许细胞在2–4小时内粘附，之后略微提高培养基注射器以向通道供应新鲜培养基，然后使其增殖过夜。在第二天，在之前所述的温度和co2环境室下，将芯片和注射器设备转移至显微镜(kolnik,m.,tsimring,l.s.&hasty,j.vacuum-assistedcellloadingenablesshear-freemammalianmicrofluidicculture.labonachip12,4732–4737,2012)。然后制备细菌培养物，并在成像之前如以上所述进行负载。如果流速太高，则当细菌群体达到群体阈值(通过sfgfp的出现指示)时使其降低，以允许释放的治疗物更好地扩散进哺乳动物生长通道内。对于包括的主要步骤的示意图，参考图6d和图22d。对于显微镜检查，我们使用与我们之前的工作中所描述的相同系统(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44,2012)。简言之，我们使用nikoneclipsetiepifluorescent显微镜，其中基于相差成像。对于图像的获取，我们使用来自photometrics的coolsnaphq2ccd相机。通过nikonelements软件控制显微镜和获取。使用与加热单元相连的有机玻璃培养室，以维持微流体装置的温度，所述加热单元涵盖台子周围大片区域。在50-200ms曝光时间下，以60×放大倍数拍摄相差图像。对于gfp，在150ms下进行60×的荧光成像，对于lumencorsola光源，设置30％。对于通常的实验过程，每2–3分钟拍摄图像。为了估计装置通道内的流速，我们测量了在200ms荧光曝光时荧光珠(1.0μm)的痕迹长度，以估计平均流体速度。关于这些图像的分析的进一步信息呈现于以下数据分析部分。孔板实验对于活力实验，我们将单层hela细胞接种于含有青霉素和链霉素抗生素的标准组织培养96孔平底板(fisherscientific)上。我们使来自图3d的四种细菌株在50ml培养物中生长至0.08的光密度，之后进行沉淀并重悬于含有合适抗生素的1.2ml培养基中。然后使细菌培养物生长1小时，随后在1.5ml微量离心管中沉淀。然后向三个hela培养孔中添加100μl得到的各上清液。此后，我们实施vybrantmtt细胞增殖分析试剂盒(v-13154,molecularprobes)的方案，以测量hela细胞的活力。对于改变的接种实验(图3e-f)，我们也利用相同的孔板。我们使sdc+hlye株生长至～0.07的光密度，之后使细胞沉淀并在1ml新鲜培养基和抗生素中重悬。然后对于每一各自的情况，将不同体积的该密集培养物接种至三个孔中，并在20×放大倍数下进行成像。数据分析通过分析来自荧光通道的画面，并绘制随时间的平均像素强度曲线图来获得荧光强度特性。测量的周期是荧光特性的峰-至-峰周期。通过分析imagej中的相差图像获得阱中的细胞数目。由于细菌在生长室中形成单层，我们首先估计各细菌细胞的平均面积和平均空隙分数(阱中细菌之间的开放空间)。考虑到图像的μm/像素，我们利用imagej测量了细胞占据的阱的面积，并将其除以细菌细胞的平均面积。然后将该数值乘以(1–空隙分数)，以获得阱中细胞的总的估计数目。将不邻近主要细胞群的细菌单独计数，并将其与最终数目相加。通过将裂解的细菌数目除以裂解前细菌数目的最大值，获得每一周期裂解的细胞的分数。通过利用matlab生成图。为了估计培养基通道中的流速，我们使1μm的荧光珠在20×下成像，并利用matlab对图像进行分析。以像素计测量荧光珠痕迹的长度，并将其转换为微米。然后将痕迹的长度除以曝光时间(200ms)，以获得流速。在该研究中，我们报道了中值流速，因为在珠轨迹中它对于异常值较不敏感。建模为了描述sdc的动态行为，我们开发了常微分方程模型，其含有关于细胞群体大小(n)、ahl(h)、细胞间luxi(i)和细胞内裂解蛋白e(l)的方程。群体变量是细胞群体数目(n)和胞外ahl(h)(我们假定luxr-ahl快速结合)。可将该模型看做一个系统，其中我们追踪了整个实验中存活的谱系(经单细胞)，其对胞外ahl做出应答，胞外ahl反过来随着细胞数目的增加而增加。由于激活项plux所提供的正反馈，一旦达到胞外ahl阈值，则lux驱动基因、luxi和e的胞内产生进入“开启”状态(第二稳定状态)。裂解蛋白的增加经杀死项γn导致细胞数目快速降低，其被模型化为希尔函数，以基于裂解蛋白的浓度来转换杀死的“开启/关闭”。一旦ahl和裂解蛋白的水平衰减，plux和γn返回至其“关闭”稳定状态，这允许细胞数目升高，并重复该过程。由于起始取决于ahl的阈值，因此可将slc看作显示整合-和-起始行为的回路。细胞群体最大值(n0)被定义为能够匹配单细胞阱内部的细胞数目的最大值。由于细胞生长(μg)，细胞离开阱。希尔函数γn描述了细胞通过裂解而降解的速率。我们假定ahl扩散通过细胞膜很快，允许动态描述阱内的总ahl(h)。ahl(h)的产生与细胞群体(n)的产生以及每个细胞的luxi(i)浓度成正比。ahl稀释度与n成反比，因为细胞累积导致来自阱的ahl清除的阻碍增加。luxi和裂解蛋白的内部产生由plux描述。这两种蛋白的降解是由于细胞生长(μg)以及一些基础降解(γi和γl)。此外，luxi通过clpxp机制(γc)进一步降解。参数：我们选择模型参数来定性适配实验群体和gfp(代表luxi)轨迹(图2a)。在之前的工作中报道了，与大肠杆菌相比，鼠伤寒沙门氏菌中蛋白产生和降解增加了(prindle,a.etal.geneticcircuitsinsalmonellatyphimurium.acssyntheticbiology1,458–464(2012))。我们发现，这三个参数(ahl、luxi产生速率和基础luxi降解速率：cl、ci、γl、γi)导致大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌之间行为的主要定性差异(图2b)。我们详细研究了所有这三个参数，发现所有这三个参数的增加扩大了回路振荡的区域(图5e)。模型参数值：在本文所述的一些实验中，使用下述模型参数值：μg(由于细胞生长导致的稀释度)0.2；n0(细胞群体大小最大值)10；k(最大细胞裂解速率)10；l0(导致半数最大裂解的裂解基因的浓度)2；n(裂解函数的希尔系数)4；b(ahl产生速率)50；μ(由于流动导致的最大ahl清除速率)15；cl(裂解基因拷贝数)0.5；ci(luxi拷贝数)1；α0(lux启动子基础产生)0.5；αh(lux启动子ahl诱导的产生)30；h0(ahl与lux启动子的结合亲和力)5；γl(裂解蛋白的基础降解)2；γi(luxi的基础降解)2；γc(luxi的clpxp降解)8。在一些实验中，使用下述模型参数值：μg(由于细胞生长导致的稀释度)0.2；n0(细胞群体大小最大值)10；k(最大细胞裂解速率)10；l0(导致半数最大裂解的裂解基因的浓度)2；n(裂解函数的希尔系数)2；b(ahl产生速率)25；μ(由于流动导致的最大ahl清除速率)12；cl(裂解基因拷贝数)0.5；ci(luxi拷贝数)1；α0(lux启动子基础产生)0.5；αh(lux启动子ahl诱导的产生)35；h0(ahl与lux启动子的结合亲和力)5；γl(裂解蛋白的基础降解)2；γi(luxi的基础降解)2；γc(luxi的clpxp降解)12。补充视频补充视频1.拍摄显示60×放大倍数下株1(鼠伤寒沙门氏菌，在luxi上无ssra标签)中隐形递送回路(sdc)的慢速摄像荧光显微镜检查的视频。该视频显示，细菌集落在微流体室中生长，直至其达到群体阈值，在该阈值下细胞发荧光(指示回路基因的群体激活)，并且一部分群体裂解。存活者重新填充并生长，直至再次达到阈值，重复该过程。视频追踪了集落8个裂解循环，并且该株的裂解周期为～3小时。在100×100μm室的底部，每2min拍摄图像。补充视频2.拍摄显示60×放大倍数下株2(鼠伤寒沙门氏菌，在luxi上有ssra标签)中sdc的延迟荧光显微镜检查的视频。该视频显示较长的裂解周期，其中对于luxi具有较高降解效力。细菌集落在微流体室中生长，直至其达到群体阈值，在所述阈值下细胞发荧光(指示回路基因的群体激活)，并且一部分群体裂解。存活者重新填充并生长，直至再次达到阈值，重复该过程。视频追踪了集落6个裂解循环，并且该株的裂解周期为～6小时。室的大小为100x100μm，并且每2min拍摄图像。补充视频3.拍摄显示60×放大倍数下株13(大肠杆菌)中sdc的延迟荧光显微镜检查的视频。该视频显示，回路在大肠杆菌中并不稳定，尽管在37℃下仍然观察到常规裂解震荡。细菌集落在微流体室中生长，直至其达到群体阈值，在所述阈值下细胞发荧光(指示回路基因的群体激活)，并且一部分群体裂解。存活者重新填充并生长，直至再次达到阈值，重复该过程。视频追踪了集落6个裂解循环，并且该株的裂解周期为～3小时。室的大小为100×100μm，并且每2min拍摄图像。补充视频4.拍摄显示60×放大倍数下株1(鼠伤寒沙门氏菌)中sdc的延迟荧光显微镜检查的视频。视频显示，在实验第一部分，使用含有200nmahl的培养基，并且可以观察到细菌进入持续裂解状态。在装置中，由荧光染料指示(红色通道)。然后将培养基换成不含ahl的另一来源，其中不存在荧光染料，并且细菌恢复至振荡状态，其中集落持续4个裂解循环，然后结束成像。室的大小为100×100μm，并且每2min拍摄图像。补充视频5.拍摄显示60×放大倍数下微流体装置上细菌和癌细胞共培养的视频。该视频显示，株3(非运动性鼠伤寒沙门氏菌，含有hlye的sdc)负载于生长室中，而hela细胞生长于装置的主要通道内。可以观察到细菌在它们的室中生长，直至它们达到群体阈值并裂解。在裂解时，可以观察到通道中的hela细胞正经受细胞死亡。每3min拍摄慢速摄像荧光显微镜检查的图像。补充视频6.在60×放大倍数下，微流体装置上细菌和癌细胞共培养的第二视频。该视频显示，株3(非运动性鼠伤寒沙门氏菌，含hlye的sdc)负载于生长室中，而hela细胞生长于装置的主要通道内。可以观察到细菌在它们的室中生长，直至它们达到群体阈值并裂解。裂解时，可以观察到通道中的hela细胞正经受细胞死亡。每3min拍摄慢速摄像荧光显微镜检查图像。补充视频7.拍摄20×放大倍数下组织培养孔板中细菌和癌细胞共培养的视频。该视频显示，株4(运动性鼠伤寒沙门氏菌，含有hlye的sdc)负载于含有单层hela细胞的孔内。细菌生长之后，通过绿色荧光蛋白(gfp)的表达使群体事件可视化。此后不久，可以观察到hela细胞显示出细胞死亡。每1min拍摄慢速摄像荧光显微镜检查图像。合成生物学的一种前景是基因回路的产生，其使得能够在活细胞中进行逻辑编程。设置此类‘wet编程’，以转换范围从治疗学和诊断学至水处理策略的生物技术的广泛且不同的一系列分支。尽管基因模块文库开发的进步持续快速(gardner,t.s.,cantor,c.r.&collins,j.j.constructionofagenetictoggleswitchfromescherichiacoli.nature403,339–342；siuti,p.,yazbek,j.&lu,t.k.syntheticcircuitsintegratinglogicandmemoryinlivingcells.naturebiotechnol.31,448–452(2013)；tigges,m.,marquez-lago,t.,stelling,j.&fussenegger,m.atunablesyntheticmammalianoscillator.nature457,309–312(2009)；xie,z.,wroblewska,l.,prochazka,l.,weiss,r.&benenson,y.multi-inputrnai-basedlogiccircuitforidentificationofspecificcancercells.science333,1307–1311(2011))，但是将它们整合进较大回路的主要挑战是，在模块间产生足够快速且精确的通讯(moon,t.s.,tamsir,a.,stanton,b.c.&voigt,c.a.geneticprogramsconstructedfromlayeredlogicgatesinsinglecells.nature491,249-253,2012；delvecchio,d.,ninfa,a.j.&sontag,e.d.modularcellbiology:retroactivityandinsulation.mol.syst.biol.4,161,2008)。具有吸引力的方法是，将促进稳定的细胞信号转导的主进程与工程化回路整合(nandagopal,n.&elowitz,m.b.syntheticbiology:integratedgenecircuits.science333,1244–1248(2011))。在该背景下，近期的研究证实，细菌蛋白降解可以通过过度负荷胞内蛋白酶的有限供应而引发针对应激的精确应答(fredriksson,a.etal.declineinribosomalfidelitycontributestotheaccumulationandstabilizationofthemasterstressresponseregulatorσsuponcarbonstarvation.genesdev.21,862–874(2007)；merrikh,h.,ferrazzoli,a.e.,bougdour,a.,olivier-mason,a.&lovett,s.t.adnadamageresponseinescherichiacoliinvolvingthealternativesigmafactor,rpos.proc.natlacad.sci.usa106,611–616(2009)；cookson,n.a.etal.queueingupforenzymaticprocessing:correlatedsignalingthroughcoupleddegradation.mol.syst.biol.7,561(2011))。在此，我们使用蛋白酶竞争在多空间和时间尺度将基因回路的快速且可调谐的耦合工程化。我们表征了耦合延迟时间，其比基于标准转录因子的的耦合方法快多个数量级(与～20–40min相比，少于1min)，并且通过对蛋白与其降解标签之间的接头进行操纵证实了可调谐性。我们将该机制用作将胞内和集落水平的基因时钟耦合的平台，然后使多集落动力学同步，以降低这两种时钟的变异性。我们显示了如何将耦合的时钟网络用于将独立的环境输入编码为单一时间序列输出，从而使得在基因回路环境中频率能够多路复用(信息在公共通道通过不同的频率传输)。我们的结果通过使用天然的‘排队’方法(如竞争性蛋白降解)，建立了基因回路的快速且可调谐耦合的总体框架。为了使合成的基因模块之间的快速耦合工程化，我们开发了翻译后耦合平台，其通过clpxp蛋白酶经共有的降解操作(图10a)。在该方案中，所有laa标记的组件(keiler,k.c.,waller,p.&sauer,r.roleofapeptidetaggingsystemindegradationofproteinssynthesizedfromdamagedmessengerrna.science271,990–993(1996))通过竞争有限数目的蛋白酶被动态地连接(keiler,k.c.,waller,p.&sauer,r.roleofapeptidetaggingsystemindegradationofproteinssynthesizedfromdamagedmessengerrna.science271,990–993(1996)；goldbeter,a.&koshland,d.e.anamplifiedsensitivityarisingfromcovalentmodificationinbiologicalsystems.proc.natlacad.sci.usa78,6840–6844(1981))，以使标记的模块保持紧密连接(1±1min(±s.e.m.)，图10a中的实验轨迹对gfp–cfp(绿色荧光蛋白-青色荧光蛋白))，尽管具有显著的感应延迟(31±5min，如10a中从添加诱导物至gfp出现所消逝的时间)。该耦合方法产生延迟，其比基于标准转录因子的耦合方法(～20–40min)快多个数量级(rosenfeld,n.&alon,u.responsedelaysandthestructureoftranscriptionnetworks.j.mol.biol.329,645–654(2003)；hooshangi,s.,thiberge,s.&weiss,r.ultrasensitivityandnoisepropagationinasynthetictranscriptionalcascade.proc.natlacad.sci.usa102,3581–3586(2005))。为了直接阐明可以通过经由调整clpxp活性来整合模块输出而达到的应答时间，我们显示，外部提供的低水平(90mm)h2o2‘诱导物’，以clpxp依赖性方式快速(<2min，我们的实验步骤时间)且可逆地调整组成型表达的gfp的浓度(图10b)。在此，h2o2通过妨碍rssb来减少clpxp上天然底物的负载，rssb是靶向选择性σ因子rpos的接头蛋白，用于通过clpxp进行降解(fredriksson,a.etal.declineinribosomalfidelitycontributestotheaccumulationandstabilizationofthemasterstressresponseregulatorσsuponcarbonstarvation.genesdev.21,862–874(2007)；merrikh,h.,ferrazzoli,a.e.,bougdour,a.,olivier-mason,a.&lovett,s.t.adnadamageresponseinescherichiacoliinvolvingthealternativesigmafactor,rpos.proc.natlacad.sci.usa106,611–616(2009)；mika,f.&hengge,r.atwo-componentphosphotransfernetworkinvolvingarcb,arca,andrssbcoordinatessynthesisandproteolysisofσs(rpos)ine.coli.genesdev.19,2770–2781(2005))。由于rpos持续产生并通过clpxp降解，使其限制速率的接头蛋白失活，导致laa标记的蛋白的有效clpxp降解速率瞬间增加(pruteanu,m.&hengge-aronis,r.thecellularleveloftherecognitionfactorrssbistransductioninσsturnoverinescherichiacoli.mol.microbiol.45,1701–1713(2002))。通过用群体-感应时钟驱动组成型模块，我们系统地探究了耦合机制(图10c)。作为起搏器，群体时钟在集落水平经酰基高丝氨酸内酯(ahl)产生密度依赖性同步振荡，ahl是能够在高至100μm的距离内同步细胞行为的小分子(danino,t.,mondrago′n-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010))。利用微流体装置(unger,m.a.,chou,h.-p.,thorsen,t.,scherer,a.&quake,s.r.monolithicmicrofabricatedvalvesandpumpsbymultilayersoftlithography.science,288,113–116(2000))，我们观察了组成型模块的集落水平表达，并发现振荡表达与群体时钟同步(图10c，右上图)。然后通过在下游蛋白与其降解标签之间添加一系列不同长度的间隔区，我们构建了降解标签文库。间隔区含有1至5个拷贝的氨基酸序列‘thr-ser’(ts)，并且其对偏移时间(offsettime)的影响可与之前公开的替代性降解标签相比(图14b-f)。尽管所有间隔区序列均产生同步激活动力学，但是下游模块的降解动力学根据接头序列的长度而偏移，其中较长接头产生更长的gfp–cfp偏移时间(图10c，底图)。因此，我们的clpxp耦合平台通过共有降解来快速连接基因模块，并且通过改变各模块的降解动力学而允许调谐耦合的强度和时间。为了使能够产生它们自身的动力学的基因模块之间的耦合工程化，我们设计了含有群体时钟和之前所述的胞内时钟的变体的回路(图11a)(stricker,j.etal.afast,robustandtunablesyntheticgeneoscillator.nature456,516–519(2008))。基于plac/ara-1启动子的该胞内时钟变体，保留了使用pllaco-1启动子的公开版本的快速动力学和简单的遗传结构。胞内时钟基于具有延迟的负反馈环，所述延迟导致振荡。plac/ara-1或pllaco-1启动子驱动它们的转录抑制子laci蛋白的表达。laci抑制子的折叠和成熟所引起的延迟，导致转录活性的振荡破裂。更普遍地，可以利用其它启动子/抑制子组合如驱动tetr的tet阻抑性启动子或驱动ci抑制子的λ启动子，来构建导致振荡的该负反馈基序。在染色体arac的存在下，基于plac/ara-1启动子的胞内时钟的周期，可以通过异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)和阿拉伯糖来调谐。我们首先使用小的微流体装置(100个细胞)，并观察到快速且非同步的胞内时钟振荡，而无群体时钟贡献，因为群体时钟需要临界集落大小来发挥功能。在较大的装置(5,000个细胞)中，随着群体生长变大，我们观察到从非同步的振荡至相同的胞内和群体时钟振荡的转变(图11b)。在较大群体的情况下，在群体时钟脉冲期间，负载于clpxp上的底物足以使胞内时钟从其振荡状态转移出来，使得两个时钟之间能够完全连接，尽管它们的空间和时间尺度大大不同。因此，尽管自身缺乏细胞-细胞通讯模式，通过clpxp介导的与群体时钟的耦合，胞内时钟在集落水平有效同步。我们发现，改变各细胞的胞内时钟周期间接地调谐了群体时钟周期，因为与较长的胞内时钟周期相关的iptg值反而产生较短的群体时钟周期(图11c)。我们开发了振荡器网络的计算模型，其涉及负载介导的脉冲调频形式以解释该影响(图11d–f)。在耦合脉冲之间，胞内时钟通过负载介导的luxi降解速率的降低促进群体脉冲起始，因为较大的胞内时钟负载产生较高水平的ahl合酶(图11e，左以及图11a–e)。在耦合的脉冲期间，胞内时钟的贡献使得脉冲自身的持续时间未改变(图11e，左(模型)和右(实验))。与单独的群体时钟相比，关于流速通过降解连接胞内和群体时钟还使得耦合系统的振荡状态扩展(图11f)。以这种方式，胞内时钟持续刺激群体时钟起始，使得在较高的外部流速下能够发挥更稳定的功能(图12a–c)。利用在多尺度快速耦合基因时钟的平台，我们旨在工程化能够将来自两种时钟的信息频率编码(frequency-encoding)为单一报告基因的多谱时间序列的系统(图12a)。在此，测量的胞内时钟报告基因的输出，包含来自缓慢群体时钟破裂之间其自身快速胞内时钟动力学的贡献。由于较快plac/ara-1胞内时钟的天然周期的范围与较慢的群体时钟完全分开(danino,t.,mondrago′n-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010)；stricker,j.etal.afast,robustandtunablesyntheticgeneoscillator.nature456,516–519(2008))，iptg和阿拉伯糖以及流速输出均可编码为时域内的调频振荡，并且独立提取自傅里叶变换。因此，单一时钟历史的测量揭示了两种潜在的时钟网络的活性。当扫描iptg和阿拉伯糖以及流速输入时，我们从表征孤立的胞内和群体时钟的频率应答曲线开始，分别发现7–25min和55–95min的范围(图12b，上图(arac1株内的胞内时钟)和下图(群体时钟，原始研究数据)(marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909(2010))。然后我们测量了取自耦合的时钟系统的轨迹，并通过傅里叶变换提取了两种时钟的频率成分(press,w.h.innumericalrecipes:theartofscientificcomputing3rded.(cambridgeuniv.press,2007))(图3c和方法概述)。在扫描iptg和阿拉伯糖诱导物时，我们发现，胞内时钟的频率应答对多谱报告基因的贡献未被包含群体时钟而改变，因为针对iptg和阿拉伯糖的胞内频率应答与分离的时钟相同(图12d，上图(耦合的)和图12b，上图(分离的))。然后我们扫描了三种固定的诱导物水平下的流速，并且发现根据我们的通过胞内时钟进行的clpxp介导的调频模型，群体时钟的不同应答曲线对多谱报告基因的贡献发生转移(图12d，底图)。因此，为了解码给定的iptg和阿拉伯糖对以及流速输入，我们首先将胞内时钟频率恢复为iptg和阿拉伯糖的度量，然后使用对应的群体时钟应答曲线来测量流速。为了将快速耦合扩展至更大的空间尺度，我们向该网络中添加了h2o2基因信号转导(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))盒，并且观察到多集落水平的同步(图13a)。在进行这些实验时，我们还在clpxp处观察到h2o2介导的天然应激应答网络与我们的合成回路之间的相互作用(图13b)。在最初的设计中，h2o2经有氧反应控制系统arcab，通过转录下调lux启动子来使群体时钟振荡同步(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))。除了转录增加(图13c，上图)，我们发现采用h2o2其表观降解速率增加(图13c，下图以及图17a和17b)，这与针对外部提供的h2o2的应答中增加的clpxp活性一致。在针对h2o2的应答中，转录输出和有效clpxp降解速率的联合增加也通过减小各集落的周期变化的影响来收紧多集落水平的周期分布(图13c，上图以及图17c、17d)。由相互作用模块组成的工程化合成回路是正在进行的工作(gardner,t.s.,cantor,c.r.&collins,j.j.constructionofagenetictoggleswitchfromescherichiacoli.nature403,339–342；siuti,p.,yazbek,j.&lu,t.k.syntheticcircuitsintegratinglogicandmemoryinlivingcells.naturebiotechnol.31,448–452(2013)；tigges,m.,marquez-lago,t.,stelling,j.&fussenegger,m.atunablesyntheticmammalianoscillator.nature457,309–312(2009)；xie,z.,wroblewska,l.,prochazka,l.,weiss,r.&benenson,y.multi-inputrnai-basedlogiccircuitforidentificationofspecificcancercells.science333,1307–1311(2011)；moon,t.s.,tamsir,a.,stanton,b.c.&voigt,c.a.geneticprogramsconstructedfromlayeredlogicgatesinsinglecells.nature491,249–253(2012)；delvecchio,d.,ninfa,a.j.&sontag,e.d.modularcellbiology:retroactivityandinsulation.mol.syst.biol.4,161(2008))，其通常依赖于转录和翻译，较少注意到翻译后耦合机制(grünberg,r.&serrano,l.strategiesforproteinsyntheticbiology.nucleicacidsres.38,2663–2675,2010)。蛋白酶竞争提供下述优势：快速应答、具有不同识别序列的模块性以及同时控制含有蛋白酶适配子的多个回路(mcginness,k.e.,baker,t.a.&sauer,r.t.engineeringcontrollableproteindegradation.mol.cell22,701–707(2006)；griffith,k.l.&grossman,a.d.inducibleproteindegradationinbacillussubtilisusingheterologouspeptidetagsandadaptorproteinstotargetsubstratestotheproteaseclpxp.mol.microbiol.70,1012–1025(2008))。更普遍地，在天然生物网络中，对细胞资源(例如代谢物、酶、转录因子、结合位点)的竞争产生用于降低噪音、增加对输入浓度的敏感性以及在多种输入之间进行辨别的非线性耦合作用(goldbeter,a.&koshland,d.e.anamplifiedsensitivityarisingfromcovalentmodificationinbiologicalsystems.proc.natlacad.sci.usa78,6840–6844(1981)；burger,a.,walczak,a.m.&wolynes,p.g.abductionandasyluminthelivesoftranscriptionfactors.proc.natlacad.sci.usa107,4016–4021(2010)；mukherji,s.etal.micrornascangeneratethresholdsintargetgeneexpression.naturegenet.43,854–859(2011)；buchler,n.e.&louis,m.moleculartitrationandultrasensitivityinregulatorynetworks.j.mol.biol.384,1106–1119(2008)；strogatz,s.nonlineardynamicsandchaos:withapplicationstophysics,biology,chemistryandengineering(perseusbooks,2001))。我们设想，经内置细胞方法(我们称为‘宿主连接的’耦合)整合的工程化回路，通过促进合成模块之间的稳定信号转导，具有产生更复杂的回路的潜力。基因回路的正向工程化中的最新进展，将合成生物学定位为发展生物疗法的新方法(fischbach,m.a.,bluestone,j.a.&lim,w.a.cell-basedtherapeutics:thenextpillarofmedicine.sciencetranslationalmedicine5,179ps7–179ps7,2013；ruder,w.c.,lu,t.&collins,j.j.syntheticbiologymovingintotheclinic.science333,1248–1252,2011；weber,w.&fussenegger,m.emergingbiomedicalapplicationsofsyntheticbiology.naturereviewsgenetics13,21–35,2011；以及folcher,m.&fussenegger,m.syntheticbiologyadvancingclinicalapplications.currentopinioninchemicalbiology,2012)。考虑到有益微生物的广泛流行及其在体内的功能性作用，细菌为代谢障碍、胃肠疾病和癌症治疗中的生物疗法的发展呈现了天然平台(cho,i.&blaser,m.j.thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.naturereviewsgenetics13,260–270(2012)；garrett,w.s.cancerandthemicrobiota.science348,80–86,2015；pawelek,j.m.,low,k.b.&bermudes,d.tumor-targetedsalmonellaasanovelanticancervector.cancerresearch57,4537–4544,1997)。随着治疗性基因表达模块的发展的持续进步，未知的可能性是动态地控制集落生长和治疗物表达的回路的构建(jeong,j.-h.etal.anti-tumoraleffectofthemitochondrialtargetdomainofnoxadeliveredbyanengineeredsalmonellatyphimurium.plosone9,e80050,2014；loessner,h.etal.remotecontroloftumour-targetedsalmonellaentericaserovartyphimuriumbytheuseofl-arabinoseasinducerofbacterialgeneexpressioninvivo.cellularmicrobiology9,1529–1537,2007；swofford,c.a.,vandessel,n.&forbes,n.s.quorum-sensingsalmonellaselectivelytriggerproteinexpressionwithintumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences112,3457–3462,2015)。这些工程化的细菌在理想情况下将自我维持其群体密度，同时持续产生并原位释放治疗剂。在本文所述的实施方案中，是具有临床相关性质的工程化细菌在阈值群体密度下同步裂解并释放基因编码的治疗物中的用途。在裂解时，少量存活的细菌重新接种生长群体，从而导致脉冲裂解和释放循环。我们使用微流体装置来表征基因回路的鲁棒性和可调谐性，并且我们证实了其作为在与人癌细胞体外共培养物中的抗癌剂的前景。然后我们将‘同步化的裂解株’注射进小鼠中移植的同基因结直肠肿瘤中，并在体内使用荧光素酶报告基因来观察脉冲集落动力学。根据之前的发现：细菌可以为化疗提供天然补充物(dang,l.h.,bettegowda,c.,huso,d.l.,kinzler,k.w.&vogelstein,b.combinationbacteriolytictherapyforthetreatmentofexperimentaltumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences98,15155–15160,2001)，我们测试了我们的系统：动物模型，其仍是临床前测试中的范例，尽管它们具有不完善的人体结果预测(begley,c.g.&ellis,l.m.drugdevelopment:raisestandardsforpreclinicalcancerre-search.nature483,531–5332012；sausville,e.a.&burger,a.m.contributionsofhumantumorxenograftstoanticancerdrugdevelopment.cancerresearch66,3351–3354,2006)。在肝脏结肠直肠癌转移的实验性同基因移植模型中，我们使用化疗和工程化细菌的组合来证实治疗潜力，并且发现组合疗法导致肿瘤负荷显著降低以及显著的存活益处。我们的方法可以使得使用工程化细菌连同传统药物、新型生物治疗物或纳米颗粒的新型递送策略成为可能(cheong,i.etal.abacterialproteinenhancesthereleaseandefficacyofliposomalcancerdrugs.science314,1308–1311,2006；o’shea,c.c.viruses–seekinganddestroyingthetumorprogram.oncogene24,7640–7655,2005；june,c.h.etal.engineeredtcellsforcancertherapy.cancerimmunology,immunotherapy,1–7,2014)。为了控制群体水平并促进治疗性细菌株中的药物递送，我们利用之前用于产生稳定的振荡动力学的耦合正反馈和负反馈环，将同步化的裂解回路(slc)工程化(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330,2010；prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44,2012)。该回路(图1a)由驱动其自身激活子(正反馈)和裂解基因(负反馈)这两者的表达的常见启动子组成。具体地，luxi启动子调控自诱导物(ahl)的产生，ahl结合luxr并使其能够转录激活所述启动子。负反馈源于由也受luxi启动子控制的噬菌体裂解基因引发的细胞死亡(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44,2012；young,k.d.&young,r.lyticactionofclonedx174genee.journalofvirology44,993–1002,1982；marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909,2010)。重要的是，ahl可以扩散至邻近细胞，从而提供细胞间同步机制。可将源于同步化裂解回路的细菌群体动力学概念化为信号转导分子(ahl)缓慢积累至阈值水平，随后发生快速剪除群体并使得释放细菌内容物的裂解事件(图1b)。裂解之后，少量剩余的细菌开始重新产生ahl，允许“整合和起始”过程以循环方式重复。我们使用微流体装置来观察生长、裂解和蛋白释放，其中sfgfp作为减弱的鼠伤寒沙门氏菌中的回路动力学和治疗物表达的代表。我们观察到周期性裂解事件，其由与群体裂解相对应的荧光报告基因特性中的峰表征(图1c)。各循环后存活的细胞产生裂解敏感性后代，以使裂解细胞的分数在整个循环保持一致，表明裂解和存活以随机方式发生(图21a-b)。考虑到在波动的体内微环境中实施的最终目标，我们测试了一系列孵育温度(36℃至40℃)和灌注速率(100μm/s至200μm/s)，测量了在所有条件下我们的微流体装置中3小时的平均时间(图1d)。在本文提供的补充视频1、2和3的讨论中进一步概述了这些实验的结果。这些发现表明，在面对体内环境中可能遇到的相关环境波动时，slc具有产生稳定的裂解和释放周期的能力。合成生物学中细菌疗法的出现强调了对预测建模的需求。该需求来源于由细菌克隆相对于动物实验的时间尺度中的差异所产生的瓶颈：疗法的创建可以比疗法的体内测试快得多。因此，为了在在动物模型中进行测试之前，定量表征slc回路，我们首先开发了计算模型来探究影响鲁棒性和可调谐性的参数(图18a)。我们观察到，高的产生和降解速率导致参数空间中更广的振荡动力学范围(图18b)。该模型与我们的下述观察一致：鼠伤寒沙门氏菌中的振荡比大肠杆菌中的更稳定，其中之前发现蛋白产生和降解的速率更低(prindle,a.etal.geneticcircuitsinsalmonellatyphimurium.acssyntheticbiology1,458–464,2012),(fig.21c).由于操纵回路行为的能力极大提高了在不同环境中应用我们的系统的多功能性，我们通过在luxi蛋白上添加ssra降解标签序列探究了裂解周期的可调谐性。与模型预测一致，我们实验性地观察到增加的周期和集落起始幅度(图18c-d和图21d)。因此，slc使得能够调谐药物的递送周期和量级。为了将治疗功能并入slc，我们增加了作为成孔抗肿瘤毒素已被测试的溶血素e或大肠杆菌的hlye的表达(ryan,r.etal.bacterialdeliveryofanovelcytolysintohypoxicareasofsolidtumors.genetherapy16,329–339,2009；nguyen,v.h.etal.geneticallyengineeredsalmonellatyphimuriumasanimageabletherapeuticprobeforcancer.cancerresearch70,18–23,2010)。为了使细菌裂解和体外杀死癌细胞可视化，我们将微流体装置工程化，以使癌细胞粘附在侧面接有较小的细菌生长室的生长通道内，允许细胞裂解和癌细胞死亡的单细胞可视化(图22d)。将人宫颈癌hela细胞与包含slc回路的鼠伤寒沙门氏菌共培养之后，在细菌裂解开始时我们就观察到hela细胞死亡，这指示有效的毒素释放(图3a-b)。在本文提供的补充视频5和6的讨论中进一步概述了这些实验的结果。阱外全部细胞死亡发生在初始sfgfp荧光～111min内(图3c)。因此，slc能够以足以体外杀死癌细胞的水平释放hlye。为了证实治疗活性的机制，我们对分批培养物中释放的细菌内容物中的毒性进行了评估。如所预期的，我们发现暴露于来自含有hlye模块的slc的培养物上清液中的hela细胞，显示出活力几乎完全丧失(图3d)，而暴露于不含hlye模块的slc上清液中的hela细胞，显示活力仅轻微丧失(～15％)。我们推断，细菌裂解允许有效的hlye体外释放，并且天然胞内细菌内容物不显著影响hela细胞的活力。通过在孔板中接种不同量的包含回路的细菌与hela的培养物，我们进一步研究了含有hlye的slc的药物递送特性。我们观察到，从起始接种至hela细胞死亡的时间随细菌接种体积的降低而增加，可能因为细菌达到群体阈值所需的时间延长(图3e)。在补充视频6中进一步形象概述了这些实验的结果，其描述了60×放大倍数下，微流体装置上的细菌和癌细胞共培养。该视频显示，株3(非运动性鼠伤寒沙门氏菌，含有的hlye的sdc)负载于生长室中，而hela细胞生长于装置的主要通道内。可以观察到细菌在其室中生长，直至它们达到群体阈值并裂解。在裂解时，可以观察到通道内的hela细胞正经受细胞死亡。每3min拍摄慢速拍摄荧光显微镜检查图像。增加的起始速率与暴露于hlye直至细胞死亡的较短暴露时间相对应，这指示了增加的裂解和治疗物释放，尽管在所有情况中所需的暴露量级似乎类似(图3f)。以这种方式，接种的细菌的初始群体水平决定了回路的初始时间和释放性质。我们随后使用荧光素酶报告基因监测小鼠中移植的同基因结直肠癌肿瘤中的细菌群体动力学。为了使得在体内抗生素选择不存在的情况下，质粒的损失程度最小化，我们将之前所述的用于质粒保留和分离的稳定元件并入slc中(gerdes,k.theparb(hok/sok)locusofplasmidr1:ageneralpurposeplasmidstabilizationsystem.naturebiotechnology6,1402–1405,1988；wood,t.,kuhn,r.&peretti,s.enhancedplasmidstabilitythroughpost-segregationalkillingofplasmid-freecells.biotechnologytechniques4,39–44,1990；derman,a.i.etal.phylogeneticanalysisidentifiesmanyuncharacterizedactin-likeproteins(alps)inbacteria:regulatedpolymerization,dynamicinstabilityandtreadmillinginalp7a.molecularmicrobiology73,534–552,2009；danino,t.,lo,j.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.n.invivogeneexpressiondynamicsoftumor-targetedbacteria.acssyntheticbiology1,465–470,2012；danino,t.etal.programmableprobioticsfordetectionofcancerinurine.sciencetranslationalmedicine7,289ra84–289ra84；2015)。此外，我们将治疗性基因和luxcdabe基因(体内报告基因模块)均置于luxi启动子下，其经细菌发光作为hlye产生和群体起始的指示物(图1a)。利用具有免疫能力的小鼠中的皮下结直肠癌模型(mc26细胞系)，我们经瘤内注射slc细菌株(slc-hly)。利用体内成像(ivis)技术(danino,t.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.measuringgrowthandgeneexpressiondynamicsoftumor-targeteds.typhimuriumbacteria.jove,journalofvisualizedexperiments,e50540–e50540,2013)，我们观察了肿瘤内的脉冲细菌群体动力学(图19a-c、图23a)，其与设计和体外性质一致。发光强度的量级平均低于组成型对照株～300倍，这指示了肿瘤内细菌群体水平显著降低(图23c)。这些结果证实了用于体内应用的细菌群体动力学的成功工程化。作为有助于理解回路对小鼠的健康影响的准备步骤，我们将组成型产生hlye的两株的体内影响进行比较，其中单次直接注射进具有确定的皮下肿瘤的小鼠血液中。一株含有完全同步化的裂解回路(slc-consthly)，并且另一株不含用于同步裂解的luxi介导的正反馈(非slc-consthly)。与slc和非回路对照株相比，对于产生非slc治疗物的株，我们观察到小鼠健康显著降低(图23e)。然后我们利用slc系统的多功能性产生两种其它治疗株，所述治疗株分别激活宿主免疫应答(经t细胞和树突状细胞募集，利用ccl-21)并引发肿瘤细胞的凋亡(利用cdd-irgd)(chen,r.etal.applicationofapro-apoptoticpeptidetointratumorallyspreadingcancertherapy.cancerresearch73,1352–1361,2013；loeffler,m.,le’negrate,g.,krajewska,m.&reed,j.c.salmonellatyphimuriumengineeredtoproduceccl21inhibittumorgrowth.cancerimmunology,immunotherapy58,769–775,2009)(图23)。我们发现，直接向肿瘤递送的重复注射不导致多株slc-3与对照之间的显著体重差异，其中用slc-3株处理的小鼠显示出显著的治疗效果(图23f-g)。此外，我们检查了取自用slc-3株、化疗或非回路细菌处理的小鼠的肿瘤切片的组织学。我们观察到肿瘤的细菌定植，以及slc-3情况下组织中显著较高的细胞死亡(图24)。合在一起，这些结果指示，该回路赋予静脉注射的小鼠增强的安全性，以及肿瘤内增加的细胞死亡。为了建立我们的回路在癌症疗法环境中的应用的原理论证，我们从之前的研究中得到灵感，其显示厌氧细菌可以占据无血管的肿瘤区室，其中由于缺乏氧气，认为化疗无效(dang,l.h.,bettegowda,c.,huso,d.l.,kinzler,k.w.&vogelstein,b.combinationbacteriolytictherapyforthetreatmentofexperimentaltumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences98,15155–15160,2001)。已经提出，最佳治疗方法可以包括协同组合，细菌由此在肿瘤的坏死中心递送药物，而对于血管区域则使用标准化疗(dang,l.h.,bettegowda,c.,huso,d.l.,kinzler,k.w.&vogelstein,b.combinationbacteriolytictherapyforthetreatmentofexperimentaltumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences98,15155–15160,2001；forbes,n.s.engineeringtheperfect(bacterial)cancertherapy.naturereviewscancer10,785–794,2010)。在该范例的指导下，我们在肝脏结直肠癌转移的实验性同基因移植模型中，对slc细菌与常见的化疗(5-氟尿嘧啶或简单的5-fu)的组合进行了测试。我们观察到，细菌株的口服递送导致建立的肝脏肿瘤安全且有效的定植，在移植后递送5-7天，从而允许重复给药，而对小鼠无副作用(图20a-b)。在针对第0天和第21天单独的细菌疗法的重复口服递送或者单独施用化疗的应答中，肿瘤显示出相似的活性轨迹(图20c)。但是，两种疗法的组合导致在18天的周期内，肿瘤活性显著降低(图20d)。在该18天周期的最初，大部分肿瘤能够引发肿瘤大小至少30％的减小(图20e)。对于具有不可治愈的结直肠癌转移的动物，整体应答导致存活时间大约增加50％(图20f)。改善可能由用于长期回路稳定性的策略或者其它治疗物的利用引起。同步化的裂解回路直接解决了程序化的群体对照的全身炎症应答问题；因为在各振荡裂解事件之后细菌集落被剪除，该设计具有减轻非期望的宿主应答的潜力。相对于大部分纳米技术策略，该方法不需要预负载药物或者重复引入递送媒介物，并且细胞裂解消除了对其它分泌机制的需要。考虑到关于生理节律对宿主-微生物相互作用以及代谢障碍的影响的最近见解，循环药物释放可以具有更广泛的影响(leone,v.etal.effectsofdiurnalvariationofgutmicrobesandhigh-fatfeedingonhostcircadianclockfunctionandmetabolism.cellhostµbe17,681–689,2015；thaiss,c.a.,levy,m.&elinav,e.chronobiomics:thebiologicalclockasanewprincipleinhost–microbialinteractions.plospathog11,e1005113,2015)。更普遍地，同步化的裂解回路例证了这样的方法学：利用合成生物学的工具以充分利用某些细菌在实体瘤中定植的自然倾向。此类工程化策略可以允许治疗性群体在肿瘤环境中的发展，其中群体动力学由相互作用的病毒、细菌和宿主细胞(如t细胞)驱动(cheong,i.etal.abacterialproteinenhancesthereleaseandefficacyofliposomalcancerdrugs.science314,1308–1311,2006)。方法概述株和质粒在37℃培养箱中，于分别含有50μgml-1和34μgml-1卡那霉素和氯霉素以及0.2％的葡萄糖的lb培养基中培养本公开中描述的一些回路株。在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(cellgro30-002-ci)的dmem培养基中培养哺乳动物细胞，将其置于37℃、维持在5％co2的组织培养箱内。利用cpec克隆方法或者利用标准限制性消化/连接克隆来构建质粒(quan,j.&tian,j.circularpolymeraseextensioncloningofcomplexgenelibrariesandpathways.plosone4,e6441(2009)。激活子质粒(kan,cole1)已在我们组之前的工作中使用，而通过下述构建裂解质粒：经pcr从epop质粒中获得裂解基因e，并将其克隆进载体(chlor,p15a)，其受luxi启动子的控制(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–442012；marguet,p.,tanouchi,y.,spitz,e.,smith,c.&you,l.oscillationsbyminimalbacterialsuicidecircuitsrevealhiddenfacetsofhost-circuitphysiology.plosone5,e11909(2010))。经pcr从mg1655的基因组dna中获得hlye基因，同时合成mccl21(小鼠ccl21)和cdd-irgd。将这些基因克隆进裂解质粒，其受ptac或pluxi启动子的控制(deboer,h.a.,comstock,l.j.&vasser,m.thetacpromoter:afunctionalhybridderivedfromthetrpandlacpromoters.proceedingsofthenationalacademyofsciences80,21–251983)。用hela细胞和运动或非运动性鼠伤寒沙门氏菌sl1344进行共培养。对于全株和质粒信息，也参见补充信息。通过pcr反应对公开的构建体进行改造和组合以构建振荡器质粒(danino,t.,mondrago′n-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010)；stricker,j.etal.afast,robustandtunablesyntheticgeneoscillator.nature456,516–519(2008)；prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))，并且除luxr之外的所有回路组件均通过pcr标记有羧基末端ssra标签(aandenyalaa)(keiler,k.c.,waller,p.&sauer,r.roleofapeptidetaggingsystemindegradationofproteinssynthesizedfromdamagedmessengerrna.science271,990–993(1996))用于快速降解。我们将激活子和报告元件(luxi、cfp和yfp)置于一个载体(irap2、kan和cole1)上，并将阻抑元件(aiia和laci)置于第二载体(irap3、amp和p15a)上。通过在cfp和laa标签之间添加不同的ts重复插入来构建thr-ser(ts)构建体。例如，对于两个ts，将氨基酸序列‘tsts’插入紧邻降解标签‘aandenyalaa’之前。通过用‘aav’替代降解标签的‘laa’部分来构建aav构建体。微流体和显微镜检查该研究中使用的微流体装置和实验制备方案与我们组之前所报道的那些相似(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–442012)。细菌生长室的面积为100x100μm，并且高度大约为1.4μm。对于芯片上的共培养实验，我们首先以非常低的流速将hela细胞的悬浮培养物负载于装置培养基通道内，以允许粘附，然后将该装置在组织培养箱中培养0.5-2天，以允许增殖(kolnik,m.,tsimring,l.s.&hasty,j.vacuum-assistedcellloadingenablesshear-freemammalianmicrofluidicculture.labonachip12,4732–47372012)。在实验那一天，将装置转移至显微镜，并在成像前将含有回路的细菌负载于生长室内。利用photometricscoolsnapcooledccd相机，用nikonti2进行图像获取。利用nikonelements软件将范围和附件程序化。对于微流体和显微镜检查的其它细节，可见于补充信息中。在nikonti上进行图像获取，并利用受nikonelements软件控制的photometricscoolsnapcooledccd相机或photometricsquantememccd相机获取图像。在具有混合或者在两种不同的培养基来源之间进行转换的能力的微流体装置内，拍摄细胞的图像。在进行实验的当天，将50ml过夜培养物稀释于50μl溶菌液体培养基(difco)和抗生素中。当细胞达到0.1的d600nm，则将细胞离心并重悬于5ml新鲜培养基中，并负载于装置内。使用三种装置来研究不同大小的群体：小集落(100个细胞)(ferry,m.s.,razinkov,i.&hasty,j.microfluidicsforsyntheticbiologyfromdesigntoexecution.methodsenzymol.497,295–372)、大集落(5,000个细胞)(danino,t.,mondrago′n-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010))，以及多个大集落(500个具有5,000个细胞的集落)(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012))。数据分析利用我们之前开发的算法和内置matlab功能，从慢速拍摄图像获得单细胞和各阱的荧光轨迹(prindle,a.etal.asensingarrayofradicallycoupledgenetic‘biopixels’.nature481,39–44(2012)；ferry,m.s.,razinkov,i.&hasty,j.microfluidicsforsyntheticbiologyfromdesigntoexecution.methodsenzymol.497,295–372)。我们鉴定了来自这些轨迹的峰和槽，并使用这些数值来计算周期和幅度。为了计算图10a中的耦合延迟和图10a中的偏移时间，我们测量了轨迹对的10％幅值点之间的差异。测量从诱导起始时间至诱导模块的10％幅度的诱导时间。为了提取来自时间序列数据的两种频率，我们利用lomb–scargle算法进行傅里叶变换。我们使用两种连续的变换单独分离各组件。首先，我们使用带通滤波器(5–25min)提取较快的胞内时钟组件。然后，我们使用第二带通过滤器(75–150min)过滤出较快的频率，以提取较慢的群体时钟组件。最终，我们将两个功率谱覆盖，保留峰的相对幅度。在线内容任何其它方法、扩展的数据显示项目和源数据可获自论文的在线版；这些部分特有的参考文献仅出现于在线论文中。其它实验结果降解标签实验除了探究模块降解中不同长度的接头(ts重复)对相移的影响(图14a-f)，我们还测试了表征充分的aav降解标签(andersen,j.b.etal.newunstablevariantsofgreenfluorescentproteinforstudiesoftransientgeneexpressioninbacteria.appliedandenvironmentalmicrobiology64,2240–2246,1998)。在andersenetal中，gfp-aav显示具有比gfp-laa高50％的半衰期。在该研究中，相对于与2ts接头序列相似的驱动模块(gfp-laa)，下游模块(cfp-aav)在降解中显示出延迟(图14b，底图)。需要进一步表征，以确定在sspb结合区域和aav降解标签之前的不同长度ts接头序列之间作用机制的差异。尽管cfp至gfp渗出比gfp至cfp渗出更显著，但是在图10a中，cfp至gfp渗出与我们的实验无关，其中诱导的蛋白(gfp)驱动耦合蛋白(cfp)的蛋白水平。因此，通过在缺乏cfp荧光团的株中用10nmahl激活sfgfp，我们进行实验来测试从sfgfp至cfp荧光通道的渗透潜力。我们未观察到cfp荧光的改变，但是sfgfp如所期望的增加(图14b，上图)。nfb有助于h2o2同步化集落之间的振荡我们将脉冲间隔(等待)时间限定为峰的10％下坡点与随后峰的10％上坡点之间的时间(图14a)。平均qs脉冲间隔时间随着向耦合系统中添加iptg(0.5mm)而降低，而各脉冲的时间保持恒定。此外，我们发现，与0.5mmiptg相比，在无iptg的情况下来自耦合的振荡器系统的qs轨迹显示出显著较低的变异性(图16a-b)。这些结果提示，与较高nfb蛋白产生相关的较强nfb(0mmiptg)(stricker,j.etal.afast,robustandtunablesyntheticgeneoscillator.nature456,516–519(2008))，导致耦合系统中较短且更稳定的脉冲间隔行为。在较大的生物像素装置(biopixeldevice)中，较不稳定的集落水平的振荡阻止了h2o2有效耦合邻近的像素，这导致非同步的qs振荡(在图16c中无nfb)。nfb降低了脉冲间隔持续噪音，其允许h2o2与生物像素装置中邻近集落内的qs振荡同步(在图16c中0.1mmiptg)。进一步增加nfb强度。h2o2增加蛋白降解速率我们对h2o2同步化的群体时钟轨迹的分析显示，周期减小以及振荡的幅度增加(图13b，上图)。h2o2同步化导致这些轨迹中降解时间明显降低(图17a)。对周期减小的主要贡献之一是，clpxp靶向的蛋白的活性增加，我们将其量化为cfp荧光从峰值时间降低至10％下坡时间的速率。图17b显示，由于h2o2耦合，clpxp降解速率显著增加(3×)。模型表述qs振荡器为了描述未耦合的qs振荡器的动态行为，我们扩展了提出的时滞微分方程模型(danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010))。除了luxi(i)、aiia(a)、内部ahl(hi)、外部ahl(he)的方程，我们还包含ahl底物(s)，其由酰基-acp和s-腺苷甲硫氨酸(sam)组成(parsek,m.r.&greenberg,e.p.acyl-homoserinelactonequorumsensingingram-negativebacteria:asignalingmechanisminvolvedinassociationswithhigherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences97,8789–8793(2000))，以解释hi的产生减缓而luxi分子的数目仍在上升。将蛋白的转录、翻译和成熟速率组合为单个时滞参数τh。通过luxr和ahl复合物的转录激活(各luxr和ahl分子中的2个)给出了延迟产生项p(τh)，其取决于内部ahl过去的浓度hi(t-τh)。我们假定luxr水平恒定，因为其未被标记用于快速降解，并且在质粒上具有大量基因拷贝(其在cole1上具有两个，以及在p15a上具有一个)。根据(müller,j.,kuttler,c.,hense,b.a.,rothballer,m.&hartmann,a.cell–cellcommunicationbyquorumsensinganddimension-reduction.journalofmathematicalbiology53,672–702(2006))，我们使用的希尔系数为4，以解释可能由于ahl-luxr聚合导致的高ahl协同性。通过与d成正比的项来描述ahl通过细胞膜的扩散，同时通过与μ成正比的项来描述外部ahl的稀释。将细胞密度参数d并入系统，以解释总细胞体积和培养基体积的差异。与γi和γa成正比的酶促降解项，通过米氏动力学分别描述了luxi和aiia的酶促降解。不同的ki和ka值表示luxi和aiia与clpxp的不同优先结合动力学。关于该点的更多信息可见于，例如本申请的“模型参数值”部分。nfb振荡器为了描述nfb振荡器的动态行为，我们使用基于laci(l)的单时滞微分方程(mather,w.,bennett,m.r.,hasty,j.&tsimring,l.s.delay-induceddegrade-and-fireoscillationsinsmallgeneticcircuits.physicalreviewletters102,068105(2009))。将蛋白的转录、翻译和成熟集合在一起成为时滞参数τl。laci的转录失活给出了延迟产生项q(τl)，其取决于laci过去的浓度l(t-τl)。通过米氏动力学，用与γl成正比的项来描述laci的酶促降解。在产生表达q中的参数c，代表iptg对laci阻抑强度的影响。以上模型的动力学解释了大部分实验结果。为了解决qs脉冲期间，与qs振荡器耦合时nfb振荡器的幅度增加，我们必须包含具有yfp前体(γp)和成熟的yfp(γm)的方程的报告基因动力学。这些另外的方程对于解释耦合系统中的qs动力学不是必须的。关于该点的更多信息可见于，例如本申请的“模型参数值”部分。耦合的nfb和qs振荡器通过增加有效“排队”作用，经cplxp降解完成两种振荡器的耦合(cookson,n.a.etal.queueingupforenzymaticprocessing:correlatedsignalingthroughcoupleddegradation.mol.syst.biol.7,561(2011))。在未耦合的情况下，两种振荡器组件将独立降解，而在耦合情况下，降解的组件结束于同一降解项。为了通过clpxp降解耦合nfb和qs振荡器，我们向nfb系统的降解表达式中添加来自qs系统的luxi和aiia，并向qs系统的降解表达式中添加来自nfb系统的laci(l)。关于该点的更多信息可见于，例如本申请的“模型参数值”部分。我们改变流μ、iptg浓度c和阿拉伯糖浓度αl，以重新获得多个实验数据。缩短前导细胞等待时间为了理解qs脉冲激活的多细胞动力学，我们构建一个模型，其中两个相同的细胞共享外部ahl(he)。我们首先考虑仅qs系统，其由具有略有不同的aiia和luxi组成型产生的两种细胞组成。在该系统中，较慢的细胞与较快的细胞耦合，提示首先起始qs脉冲的细胞通过ahl细胞-至-细胞通讯，引起邻近细胞的qs脉冲激活(图15a)。接下来，我们向双细胞系统中的细胞1添加nfb，导致该细胞的周期缩短。因此，当两种细胞通过通过外部ahl相连时，较慢的细胞2(不含nfb)与较快的细胞1耦合(图15b)。因此，尽管在不同细胞中nfb可能异相，但是在较快细胞中qs脉冲的开始可以通过邻近区域中剩余的细胞来起始qs脉冲的传播。该作用进一步降低了细胞-细胞qs变异性，我们从20个细胞的模型的周期变异性降低中看出这一点(图15d)。我们向20个细胞中各细胞的aiia和luxi蛋白的组成型产生添加噪音(α0＝0.6±0.1)，并且显示同步化的细胞vs非同步化的细胞，周期变异性降低(图15e)。通过排队耦合qs和h2o2为了描述针对在luxi荧光报告基因表达期间产生的h2o2的应答中qs振荡器的动态行为，我们向qs振荡器时滞微分方程模型添加描述h2o2(vi和ve)的产生和降解的微分方程。我们假定h2o2的产生取决于luxi的浓度，luxi与cfp荧光蛋白处于同一启动子之下。h2o2通过过氧化氢酶的降解与其浓度成正比。h2o2以两种特有的方式影响qs振荡器。首先，在正常情况下部分阻抑lux启动子的arca，其在由h2o2引发的氧化条件下失活，减轻lux阻抑并增加luxi和aiia产生。我们通过向取决于h2o2浓度的产生项中添加乘数来对该现象进行建模。其次，h2o2显示降低clpxp负载，导致aiia和luxi降解速率增加。再次，我们通过在取决于h2o2浓度的降解项前添加乘数来对该行为进行建模。最后，h2o2可以经自由扩散穿过细胞膜，我们将其描述为通过扩散参数dv表征的扩散项。胞外h2o2(ve)可以进一步离开该系统，其中速率与其浓度成正比。h2o2增加qs周期的鲁棒性如我们之前所提及的，脉冲间隔持续时间减少导致起源于噪音的周期变异性降低。将h2o2对qs振荡器的影响并入我们的模型(参见上文)导致qs轨迹的一些重大变化。首先，如所预期的，qs的幅度和qs的下坡时间随着h2o2的添加而降低(图17c)。这两种作用的结果还导致脉冲间隔持续时间缩短，这导致更稳定的qs振荡(图17d)。我们模拟该模型，以获得至少50个周期测量值用于周期cv计算。通过向延迟产生项中添加噪音产生项而将噪音引入模型中(α0＝±0.1)有趣的是，我们的模型显示，lux启动子的h2o2激活以及clpxp活性增加的各自的影响导致qs周期的cv增加(图17d)。关于增加的c1pxp活性，较高的cv主要是由于所产生的较长脉冲间隔持续时间(图17c，绿色)。然而，由于较高的脉冲幅度变异性，增加的lux启动子活性导致更加多变的降解。这两种相对的h2o2作用似乎抵消了各自的变异性，而产生更稳定的qs振荡。用模型参数拟合实验结果为了拟合来自实验的nfb周期数据，我们使用laci产生项的下述参数尺度函数来拟合iptg和阿拉伯糖(ara)浓度：aa＝0.2758，da＝1.6291，ca＝0.5638，ha＝0.9029ac＝0.0968，dc＝60.8510，cc＝8.2451，hc＝0.4334类似地，我们利用下述函数，用模型流项μ拟合实验流值μ＝aμμ2+bμμ+caμ＝1.2e-7，bμ＝0.0022，cμ＝-0.11模型参数值ca＝1(aiia拷贝数)；ci＝4(luxi拷贝数)；γa＝8(aiia的clpxp降解)；γi＝8(luxi的clpxp降解)；ka＝1(aiia与clpxp的结合亲和力)；ki＝0.2(luxi与clpxp的结合亲和力)；α0＝0.6(lux启动子基础产生)；αh＝3(lux启动子ahl诱导的产生)；h0＝0.1(ahl启动子结合亲和力)；τh＝1(luxi和aiia产生的延迟)；b＝1(ahl通过luxi的合成速率)；ks＝25(ahl底物与luxi的结合亲和力)；s0＝50(基础ahl底物产生)；γh＝1(ahl通过aiia的降解速率)；kh＝0.1(ahl与aiia的结合亲和力)；d＝0.8(ahl穿过膜的扩散)；d＝0.1(细胞密度)；μ＝0.5(流速)；αl＝1(laci/yfp产生速率)；c＝0.0025(laci启动子结合亲和力)；τl＝0.7(laci/yfp产生的延迟)；kl＝0.001(laci/yfp与clpxp的结合亲和力)；γl＝0.05(laci/yfp的clpxp降解)；δ＝1(由于qs荧光团导致的h2o2产生)；ci＝2(米氏常数)；fp＝1.3(luxi启动子的h2o2激活的强度)；dv＝8(h2o2穿过膜的扩散)；μv＝0(胞外h2o2稀释度)。体内实验所有动物工作均由动物保护委员会批准(mit，0414-022-17协议)。皮下肿瘤模型：对6周龄雌性balb/c小鼠(taconicbiosciences,inc.)进行动物实验，其中两侧皮下后侧肿瘤来自移植的小鼠结肠癌细胞系(mc26,tanabelab,massachusettsgeneralhospital)。制备肿瘤细胞，用于在dmem(无酚红)中1e8个细胞ml-1的浓度下移植。然后以100μl/侧的体积经皮下移植细胞，其中各移植由1e7个细胞组成。肿瘤生长大约2周至直径达到4-10mm。实验性肝脏转移模型通过将产生荧光素酶的小鼠癌细胞注射到有免疫能力小鼠的手术外部化的脾脏中，产生实验性转移模型。在90秒内将肿瘤细胞接种于肝脏中，之后重新移动脾脏以预防异位肿瘤生长。使用mc26-lucf细胞系(tanabelab,mgh)并以5×104个细胞/100μlpbs注射到6周龄雌性balb/c小鼠(taconicbiosciences,inc.)的脾脏内。细菌生长和施用对于体外实验，使细菌株在含有合适的抗生素和0.2％葡萄糖的lb培养基中生长过夜。在注射当天，开始1/100x稀释于含有抗生素的新鲜培养基中，并生长至od<0.1，以防止细菌达到群体阈值(特别是对于slc)。在注射进小鼠之前，将细菌离心，并用无菌pbs洗涤2-3×。在5e7个细胞ml-1pbs的浓度下进行细菌的瘤内注射，其中每个肿瘤注射的总体积为10-20μl，而给予总体积为100μl的静脉注射。对于slc-3株的注射，在指定的密度下将其终体积在三株之间等分。对于肝脏转移实验，使细菌在含有合适的抗生素和0.2％葡萄糖的lb培养基中生长，直至它们达到0.05的od，之后将它们浓缩为1-5e9个细菌/ml，并经口服灌胃递送。皮下肝脏转移模型的施用后监测在细菌注射之后，用ivisspectrum体内成像系统测量发光信号。将测量值相对于注射前的数值进行比较，以追踪动力学。利用卡尺测量整个成像过程中各肿瘤的长度、宽度和高度(v＝l×w×h)，以量化皮下肿瘤体积。将体积与注射前的数值进行比较，以追踪生理肿瘤生长。对于皮下实验，肿瘤通常生长至平均300mm3，并且对于肝脏转移模型，其在实验前生长5-7天。基于需要安乐死的认可的性质来追踪小鼠的存活。统计学分析在microsoftexcel(学生t检验)或graphpadprism5.0(使用bonferroni事后检验、对数秩检验的anova)中，计算统计学检验。进行的统计学检验的细节在各图注中指出。在数据大约正态分布的情况下，对于单一变量利用学生t检验或单向anova，或者对于双变量利用双向anova，对数值进行比较。在实验之前，将小鼠随机分配进不同的组中。将本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同明确且单独指示将各出版物或专利申请通过引用并入。根据前述，将会理解，出于说明的目的描述了本公开的多个实施方案，并且可在不脱离本公开的范围和精神的情况下作出多种修改。因此，本文公开的多个实施方案不意图具有限制性，其中真正的范围和精神由所附权利要求书指明。参考文献：andersen,j.b.etal.newunstablevariantsofgreenfluorescentproteinforstudiesoftransientgeneexpressioninbacteria.appliedandenvironmentalmicrobiology64,2240–2246(1998).baban,c.k.,cronin,m.,d.,g.c.&tangney,m.bacteriaasvectorsforgenetherapyofcancer.bioengbugs1,385–394(2010).begley,c.g.&ellis,l.m.drugdevelopment:raisestandardsforpreclinicalcancerre-search.nature483,531–533(2012).buchler,n.e.&louis,m.moleculartitrationandultrasensitivityinregulatorynetworks.j.mol.biol.384,1106–1119(2008).burger,a.,walczak,a.m.&wolynes,p.g.abductionandasyluminthelivesoftranscriptionfactors.proc.natlacad.sci.usa107,4016–4021(2010).cann,s.h.,vannetten,j.&vannetten,c.dr.williamcoleyandtumourregression:aplaceinhistoryorinthefuture.postgraduatemedicaljournal79,672–680(2003).chen,r.etal.applicationofapro-apoptoticpeptidetointratumorallyspreadingcancertherapy.cancerresearch73,1352–1361(2013).cheong,i.etal.abacterialproteinenhancesthereleaseandefficacyofliposomalcancerdrugs.science314,1308–1311(2006).cho,i.&blaser,m.j.thehumanmicrobiome:attheinterfaceofhealthanddisease.naturereviewsgenetics13,260–270(2012).coley,w.b.thetreatmentofinoperablesarcomabybacterialtoxins(themixedtoxinsofthestreptococcuserysipelasandthebacillusprodigiosus).proceedingsoftheroyalsocietyofmedicine3,1(1910).cookson,n.a.etal.queueingupforenzymaticprocessing:correlatedsignalingthroughcoupleddegradation.molecularsystemsbiology7(2011).dang,l.h.,bettegowda,c.,huso,d.l.,kinzler,k.w.&vogelstein,b.combinationbacteriolytictherapyforthetreatmentofexperimentaltumors.proceedingsofthenationalacademyofsciences98,15155–15160(2001).danino,t.,mondragón-palomino,o.,tsimring,l.&hasty,j.asynchronizedquorumofgeneticclocks.nature463,326–330(2010).danino,t.,lo,j.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.n.invivogeneexpressiondynamicsoftumor-targetedbacteria.acssyntheticbiology1.10,465–470(2012).danino,t.,prindle,a.,hasty,j.&bhatia,s.measuringgrowthandgeneexpressiondynamicsoftumor-targeteds.typhimuriumbacteria.jove(journalofvisualizedexperiments)e50540–e50540(2013).davila,m.l.etal.efficacyandtoxicitymanagementof19-28zcartcelltherapyinbcellacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine6,224ra25–224ra25(2014).deboer,h.a.,comstock,l.j.&vasser,m.thetacpromoter:afunctionalhybridderivedfromthetrpandlacpromoters.proceedingsofthenationalacademyofsciences80,21–25(1983).delvecchio,d.,ninfa,a.j.&sontag,e.d.modularcellbiology:retroactivityandinsulation.mol.syst.biol.4,161(2008).derman,a.i.etal.phylogeneticanalysisidentifiesmanyuncharacterizedactin-likeproteins(alps)inbacteria:regulatedpolymerization,dynamicinstabilityandtreadmillinginalp7a.molecularmicrobiology73,534–552(2009).ferry,m.s.,razinkov,i.&hasty,j.microfluidicsforsyntheticbiologyfromdesigntoexecution.methodsenzymol.497,295–372(2011).fischbach,m.a.,bluestone,j.a.&lim,w.a.cell-basedtherapeutics:thenextpillarofmedicine.sciencetranslationalmedicine5,179ps7–179ps7(2013).folcher,m.&fussenegger,m.syntheticbiologyadvancingclinicalapplications.currentopinioninchemicalbiology(2012).forbes,n.s.engineeringtheperfect(bacterial)cancertherapy.naturereviewscancer10,785–794(2010).fredriksson,a.etal.declineinribosomalfidelitycontributestotheaccumulationandstabilizationofthemasterstressresponseregulatorσsuponcarbonstarvation.genesdev.21,862–874(2007).gardner,t.s.,cantor,c.r.&collins,j.j.constructionofagenetictoggleswitchfromescherichiacoli.nature403,339–342.garrett,w.s.cancerandthemicrobiota.science348,80–86(2015)gerdes,k.theparb(hok/sok)locusofplasmidr1:ageneralpurposeplasmidstabilizationsystem.naturebiotechnology6,1402–1405(1988).goldbeter,a.&koshland,d.e.anamplifiedsensitivityarisingfromcovalentmodificationinbiologicalsystems.proc.natlacad.sci.usa78,6840–6844(1981).griffith,k.l.&grossman,a.d.inducibleproteindegradationinbacillussubtilisusingheterologouspeptidetagsandadaptorproteinstotargetsubstratestotheproteaseclpxp.mol.microbiol.70,1012–1025(2008).grünberg,r.&serrano,l.strategiesforproteinsyntheticbiology.nucleicacidsres.38,2663–2675(2010).hohmann,e.l.,oletta,c.a.&miller,s.i.evaluationofaphop/phoq-deleted,aroa-deletedliveoralsalmonellatyphivaccinestraininhumanvolunteers.vaccine14,19–24(1996).hooshangi,s.,thiberge,s.&weiss,r.ultrasensitivityandnoisepropagationinasynthetictranscriptionalcascade.proc.natlacad.sci.usa102,3581–3586(2005).june,c.h.etal.engineeredtcellsforcancertherapy.cancerimmunology,immunotherapy1–7(2014).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