本申请要求2015年6月22日递交的美国临时专利申请号62/182,711的优先权，以引用的方式将其内容并入本文。
本申请涉及用于检测分析物的生物传感器、各种试剂盒以及其使用方法。具体而言，所述生物传感器包括滚环扩增(rca)模板，其中分析物的结合触发引物的激活和扩增反应。
背景技术：
dna扩增是基因组学、分子诊断学、化学生物学和dna纳米技术中的重要工具。除了聚合酶链式反应[1]，最近，被称为“滚环扩增”(rollingcircleamplication，rca)的dna等温扩增技术引起了很大的关注[2,3]。rca涉及借助具有链置换能力和高合成能力(processivity)的dna聚合酶(例如φ29dna聚合酶(φ29dp))在环状dna模板上延伸dna引物[4]。这些聚合酶可连续地将新合成的dna链从环状模板中移出，从而有效地进行多轮复制。rca的产物是具有数千个重复单位的极长的单链(ss)dna[2,3]。由于其扩增能力和操作简便性，rca已成为流行的dna扩增技术[5-9]。
自然界中dna聚合酶已演化出具有多种功能的引人瞩目的酶。例如，除了其dna聚合和链置换功能以外[4]，φ29dp能够实施针对ssdna(而不针对双链dna)的3'-5'核酸外切消化[10]。已演化出在dna聚合酶中常见的溶核酸活性(nucleolyticactivity)，以在体内校正dna的复制[11]。但是，这种性质很少被研究用于体外应用。
技术实现要素：
本申请展示了多功能扩增生物传感策略，该策略将滚环扩增(rca)、用于靶向识别的结构切换(structure-switching)核酸分子以及核酸聚合酶的核酸外切剪切功能和核酸依赖性聚合功能进行独特的整合，其特征在于两双链体三重核酸组装体(two-duplextripartiteassembly)。本申请的生物传感策略能够输出的检测极限比结构切换核酸分子结合其对应分析物的解离常数低几个数量级。
因此，本申请包括用于检测分析物的生物传感器，该生物传感器包含核酸组装体，其中，所述核酸组装体包含：
(a)环状单链核酸分子，所述环状单链核酸分子为滚环扩增(rca)的模板；
(b)线性的结合分析物的单链核酸分子；以及
(c)包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子，所述第一核酸序列为rca模板的引物，所述第二核酸序列被具有核酸外切酶(exonuclease)活性的核酸聚合酶消化，
其中，在不存在所述分析物的情况下，线性单链核酸分子的所述第一核酸序列与所述环状单链核酸分子的一部分结合，并且线性单链核酸分子的所述第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分结合；而在存在所述分析物的情况下，所述线性单链核酸分子的第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分的结合被破坏，使得所述第二核酸序列能被具有核酸外切酶(exonuclease)活性的核酸聚合酶消化。
本申请还包括利用本申请的生物传感器的测定方法。在一些实施方式中，所述测定是检测样品中分析物的方法，其中，所述样品疑似包含所述分析物，所述方法包含将所述样品与本申请的生物传感器进行接触，然后监测来自rca模板的核酸产物的存在，其中所述来自rca模板的核酸产物的存在表明在所述样品中存在所述分析物。
本申请进一步包括包含本申请的生物传感器的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括所述生物传感器和使用所述生物传感器实施测定的任何其它试剂(例如具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶)。在一些实施方式中，所述试剂盒包括在所述测定中使用所述生物传感器的说明书以及实施所述测定所需的任何对照。所述对照可处于所述生物传感器自身，或者可选地，所述对照在单独的基底上。在一些实施方式中，所述试剂盒包括实施本申请的任何测定方法所需的全部组分。
从以下的详细描述中，本申请的其它的特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，虽然详细的描述和具体的实施例说明了本申请的实施方式，但是其仅用以进行说明，而权利要求的范围不应被这些实施方式所限制，而是应该被赋予与说明书整体相一致的最广泛的解释。
附图说明
现在将参照附图对本申请的实施方式进行更详细地描述，在附图中：
图1(a)示出了本申请生物传感器的一个实施方式的示意图，图1(b)-图1(d)示出了对于包含1μm放射性pp1的一种示例性生物传感器，用0.1u/μlφ29dp消化并通过20％dpage进行分析，其中(b)表示仅对pp1消化0-60min；(c)表示在0-2.5μmap1存在下消化30min；(d)表示在1.5μmap1和0.5mmatp存在下消化。
图2示出了对于包含1μm放射性pp1的本申请的一种示例性生物传感器，在如下条件下用0.1u/μlφ29dp消化30min：(a)在0-2.5μmct1存在的情况下；(b)在1μmct1、1.5μmap1、0.5mmatp存在的情况下；以及(c)在1μmct1、1.5μmap1、0.5mmgtp存在的情况下。
图3示出了对本申请的示例性生物传感器进行的琼脂糖凝胶分析，其中rca产物(pr)来自不存在atp(a)或存在atp(b)的情况下pp1、ct1和ap1的rca反应。
图4示出了：(a)在1μmct1、1.5μmi-ap2和100nmpdgf存在的情况下用0.1u/μlφ29dp对1μm放射性pp2消化30min；(b)和(c)示出了对于本申请的示例性生物传感器，在不存在100nmpdgf以及存在100nmpdgf下，对含有1μmpp2、1μmct1和1.5μmi-ap2的各种组合的rca反应的混合物中的rp进行琼脂糖凝胶分析。
图5示出了使用本申请的示例性生物传感器对pdgf进行检测：(a)对含有1μmpp2、1μmct1、1.5μmi-ap2以及递增浓度的pdgf的rca反应混合物中的rp进行的琼脂糖凝胶分析；(b)超分支rca(hyper-branchedrca，hrca)的工作原理；(c)借助evagreen对hrca反应进行实时荧光监测，其中展示了如下浓度：0(基线)、1fm(距离x轴的第二条线)、10fm(距离x轴的第三条线)、100fm(距离x轴的第四条线)、1pm(距离x轴的第五条线)、10pm(距离x轴的第六条线)、100pm(距离x轴的第七条线)、1nm(最上面一条线)；以及(d)120min时的荧光读数关于pdgf浓度的函数。
图6示出了对于包含5'-fam标记的ap1的本申请的生物传感器的一个实施方式，在pp1-ap1杂交体中由φ29dp进行核酸消化。各反应在30℃、50μl1×rca反应缓冲液(含有1μmap1、0.1u/μlφ29dp和各种浓度的pp1)中进行60min。反应混合物借助20％dpage进行分析。
图7示出了在示例性生物传感器(pp1-ap1杂交体)中gtp对pp1降解的作用。该实验在30℃下、50μl1×rca反应缓冲液(含有1μmpp、1.5μmap1、0.1u/μlφ29dp和0.5mmgtp)中进行30min。反应混合物通过20％dpage进行分析。
图8示出了(a)用0.1u/μlφ29dp对在0μm-2.5μmct1存在的情况下的包含1μm放射性i-pp1的示例性生物传感器消化30min，通过20％dpage对反应混合物进行分析；(b)对含有pp1-ct1或i-pp1-ct1(i：在pp1的3'末端处具有反向dt(图中的点))的rca反应混合物的rp进行的0.6％琼脂糖凝胶分析。
图9示出了使用本申请示例性生物传感器对pdgf的特异性测试。(a)利用i-ap2m(突变型适配体探针，其序列见表1)的rca反应。先在室温下的50μl1×rca反应缓冲液(含有1μmpp2、1.5μmi-ap2m、1μmct1、100nmpdgf或所示的这些的组合)中进行靶向结合反应30min。然后通过加入5udnap、0.4mmdntp启动rca反应，然后在30℃孵育1小时。(b)与各种蛋白质靶标的rca反应。先在室温下的50μl1×rca反应缓冲液(含有1μmpp2、1.5μmi-ap2、1μmct1和100nm的bsa、凝血酶、igg或pdgf)中进行靶向结合反应30min。通过0.6％琼脂糖凝胶对反应混合物进行分析。
图10示出了对于包含1μm放射性pp3的本申请的示例性生物传感器，在1μmct1、1.5μmi-dp1和100nmhcv-1dna存在的情况下，用0.1u/μlφ29dp消化30min。通过20％dpage对反应混合物进行分析。
图11示出了本申请的示例性生物传感器的dna检测。(a)示出了hrca反应的evagreen辅助荧光监测，该hrca反应检测以下浓度的hcv-1：0.2pm(距离x轴的第五条线)、2pm(距离x轴的第六条线)、20pm(距离x轴的第七条线)、0.2nm(距离x轴的第八条线)、2nm(距离x轴的第九条线)和20nm(最上面一条线)；(b)示出了hrca反应的evagreen辅助荧光监测，该hrca反应检测以下浓度的hcv-1：0am(距离x轴的第一条线)、20am(距离x轴的第二条线)、0.2fm(距离x轴的第三条线)、2fm(距离x轴的第四条线)和20fm(最上面一条线)；(c)示出了0.02fm-200fm的hcv-1下，hrca反应的180min荧光读数关于hcv-1浓度的函数；以及(d)示出了hcv-m1(距离x轴的第一条线)、hcv-m2(距离x轴的第二条线)和hcv-1(最上面一条线)的特异性测试。
具体实施方式
i.定义
除非另有说明，本领域技术人员将理解的是，在这部分和其它部分中描述的定义和实施方式旨在适用于这些定义和实施方式所适用的本文所述的本申请的所有实施方式和方面。
如本文使用的，术语“分析物”意味着希望使用本申请的生物传感器来感应或检测的任何的试剂。术语分析物还包括化合物或试剂的混合物，例如但不限于：组合库(combinatoriallibraries)和来自生物体或天然环境的样品。
如本文使用的，术语“样品”是指希望使用本申请的生物传感器进行测定的任何的材料。所述样品可为任何来源，例如：任何的生物来源(例如人类或动物医学样品)、环境来源(例如水或土壤)或天然来源(例如植物)、或者来自任何的制造来源或合成来源(例如食品或饮料)。所述样品包含或疑似包含一种或多种分析物。
术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。
如本文使用的，术语“适配体(aptamer)”是指短的、化学合成的单链(ss)rna或dna寡核苷酸，所述适配体折叠成特定的三维(3d)结构，从而与特定的分析物结合(例如具有在皮摩尔至纳摩尔范围内的解离常数)。
如本文使用的，术语“滚环扩增”或“rca”是指可快速地合成多个环状dna或rna分子拷贝的单向核酸复制。术语rca还包括“超分支滚环扩增”或“hrca”，所述hrca是衍生自滚环扩增的技术，其通过使用正向引物和反向引物来提高rca灵敏度。
如本文使用的，术语“核酸外切剪切”或“核酸外切消化”是指核酸外切酶从多核苷酸链的末端(外向)一次一个对核苷酸进行切割。
如本文使用的，术语“凝胶电泳”或“电泳系统”是指根据其电泳迁移率来分离生物大分子(包括蛋白质或核酸(核酸电泳))的技术。所述凝胶电泳过程可在变性或非变性条件下进行。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，除非该内容另有明确说明，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括指复数。因此，例如，含有“分析物(ananalyte)”的组合物包括一种这样的分析物或两种以上分析物的混合物。
如在本申请和权利要求中使用的，“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，例如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，例如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，例如“include”和“includes”)或“含有(containing)(以及含有的任何形式，例如“contain”和“contains”)这些词是宽泛或开放式的，并且不排除额外的、未列举的要素或处理步骤。
如在本申请和权利要求中使用的，“由……组成(consisting)”及其衍生词旨在作为封闭式的术语对所述的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在进行限定，并排除了未指出的其它特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在。
如本文使用的，术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”旨在对所述的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在以及对这些特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的基本特征和新颖性特征不造成实质性影响的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在进行限定。
如本文使用的，术语“约”、“基本上(substantially)”和“大约(approximately)”意味着被修饰的术语的合理的偏差量，该合理的偏差量不造成最终结果的显著变化。在这种偏差不否定其所修饰的词语的含义的条件下，这些程度术语应当解释为被修饰的术语包括至少±5％的偏差。
如本文使用的，术语“和/或”意味着单独地或组合地存在或使用所列出的项目。实际上，该术语意味着使用或存在所列项目中的“至少一个”或“一个以上”。
如本文使用的，术语“合适的”意味着特定化合物或条件的选择将取决于待实施的特定操作以及待变形的分子的特性，但是该选择是在受过训练的本领域技术人员的能力范围内的。
ii.生物传感器的应用
本申请展示了多功能扩增生物传感策略，所述策略将用于靶向识别的结构切换核酸序列与核酸聚合酶(例如φ29dp)的核酸外切剪切功能和dna依赖性聚合功能进行独特地整合。所述生物传感器的特征在于两双链体三重dna组装体，所述组装体包含环状dna模板、引物前体和分析物结合/识别序列。以靶标诱导的分析物结合/识别序列的结构切换事件作为由核酸聚合酶实施的剪切事件的控制元件，继而对同样由该核酸聚合酶执行的扩增事件进行控制。据申请人所知，之前从未被报道过整合的识别-消化-扩增策略。而且，这种方法可用于检测广泛的靶标，包括小分子、蛋白质和dna。通过引入hrca，本申请的生物传感策略能够输出比适配体的解离常数低几个数量级的检测极限，例如检测到低至渺摩尔(attomolar)浓度的分析物。因此，这种方法可将对其靶标具有相对较低的亲和力的分析物结合/识别序列转变为超灵敏的生物传感系统。借助当前可用的各种各样的分析物结合/识别序列以及可通过体外筛选方便制备的新序列，可预见的是，所描述的策略将具有多种多样的用途。
因此，本申请包括能够进行分析物依赖性滚环扩增(rca)的生物传感器，所述生物传感器包含核酸组装体，所述组装体由以下组成：可用作rca模板的环状单链核酸序列(在一些实施方式中称为环状模板)、可在封闭核苷酸被消化时用作rca引物的单链核酸序列(在一些实施方式中称为引物前体)、以及结合分析物的单链核酸序列(在一些实施方式中称为结合序列)。
在一些实施方式中，所述环状模板、引物前体和结合序列均为dna分子。在一些实施方式中，所述环状模板、引物前体和结合序列均为rna分子。在一些实施方式中，所述环状模板、引物前体和结合序列中的一种或多种为dna分子，而其它的为rna分子。在一些实施方式中，所述结合序列为dna适配体或rna适配体。在一些实施方式中，所述结合序列为脱氧核酶(dnazyme)或核酶(ribozyme)。在一些实施方式中，所述结合序列为核酸分子的反义序列。在一些实施方式中，所述环状模板、引物前体和结合序列通过形成核酸双链体而形成组装体。
在一些实施方式中，本申请的生物传感器按照以下链式反应的方式发挥功能：a)所述分析物引起所述结合序列从引物前体/环状模板/结合序列组装体中释放；b)然后通过3'-5'核酸外切消化由所述dna聚合酶将引物前体/环状模板组装体上的引物前体转化为成熟引物；c)然后所述dna聚合酶使用该成熟引物来复制所述环状模板，从而产生长链dna产物。
在一些实施方式中，所述长链dna产物可通过荧光、颜色改变或其它方法进行检测。
本申请还包括用于检测分析物的生物传感器，该生物传感器包含核酸组装体的，其中所述核酸组装体包含：
(a)环状单链核酸分子，所述环状单链核酸分子为滚环扩增(rca)的模板；
(b)线性的结合分析物的单链核酸分子；以及
(c)包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子，所述第一核酸序列是所述rca模板的引物，所述第二核酸序列是被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化的序列，
其中，在不存在分析物的情况下，线性单链核酸分子的第一核酸序列与所述环状单链核酸分子的一部分结合，并且线性单链核酸分子的第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分结合；在存在分析物的情况下，线性单链核酸分子的第二核酸序列与所述结合分析物的单链核酸分子的一部分的结合被破坏，使得所述第二核酸序列能被所述具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化。
在一些实施方式中，(a)、(b)和(c)独立地选自于dna分子和rna分子。在一些实施方式中，(a)、(b)和(c)为dna分子。在一些实施方式中，(a)、(b)和(c)为rna分子。在一些实施方式中，(a)、(b)和(c)包含dna分子和rna分子的组合。
在一些实施方式中，借助t4核酸连接酶和环状核酸模板将5'-磷酸化的线性单链核酸分子前体环化来制备环状单链核酸分子。在一些实施方式中，所述5'-磷酸化的线性单链核酸分子前体为actgtaaccattcttgtttcgtatcattgcagaattctactaatttatctgaataccgtg(seqidno：1)。在一些实施方式中，作为滚环扩增(rca)模板的环状单链核酸分子为gttacagtcacggtat(seqidno：2)。
在一些实施方式中，线性的结合分析物的单链核酸分子(或结合序列)选自于核酸适配体、核酸酶和核酸分子的反义序列。在一些实施方式中，线性的结合分析物的单链核酸分子为对核酸酶消化具有抗性的序列。在一些实施方式中，通过发夹(hairpin)二级结构的存在赋予核酸序列对核酸酶消化的抗性。在一些实施方式中，所述线性单链核酸分子特异性地结合分析物。特异性地结合分析物意味着即使在其它分析物存在的情况下，至少在本传感器的检测极限内，所述线性单链核酸分子仅结合所检测的分析物。
在一些实施方式中，所述核酸适配体为dna适配体或rna适配体。在一些实施方式中，通过使用指数式富集配体的系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)来制备核酸适配体，该技术例如在a.d.ellington和j.w.szostak，nature346(6287)，818-822(1990)中所述。在一些实施方式中，所述核酸适配体为dna适配体。在一些实施方式中，所述dna适配体为cactgacctgggggagtattgcggaggaaggt(seqidno：7)。在一些实施方式中，所述dna适配体是caggctacggcacgtagagcatcaccatgatcctg/3invdt/(seqidno：8)。在一些实施方式中，所述dna适配体是caggctacggcacttttttcatttaaattataatt/3invdt/(seqidno：9)。
在一些实施方式中，所述核酸酶为脱氧核酶或核酶。
在一些实施方式中，所述核酸分子的反义序列为病毒核酸序列的反义序列或细菌核酸序列的反义序列。在一些实施方式中，所述核酸分子的反义序列为病毒核酸序列的反义序列。在一些实施方式中，所述病毒序列的反义序列为aacgtcggatcccgcgtcgcc/3invdt/(seqidno：10)。在一些实施方式中，所述病毒核酸序列为丙型肝炎(hepatitisc)病毒序列。在一些实施方式中，所述病毒核酸序列为ggcgacgcgggatccgacgtt(seqidno：11)。在一些实施方式中，所述病毒核酸序列为gccgatgggggatgttccgga(seqidno：12)。在一些实施方式中，所述病毒核酸序列为gttgacgcgcaaacctacgtc(seqidno：13)。
在一些实施方式中，所述核酸适配体、核酸酶和核酸分子的反义序列通过结构识别与其各自的分析物相互作用并结合。一旦结合分析物，所述核酸适配体、核酸酶和核酸分子的反义序列经历构象变化，从而引发所述核酸适配体、核酸酶或核酸分子的反义序列从所述核酸组装体中释放。
在一些实施方式中，所述分析物选自于但不限于：无机小分子、有机小分子、金属离子、激素生长因子、生物分子、毒素、生物聚合物(例如糖类、脂质、肽和蛋白质)、细胞、组织和微生物(包括细菌和病毒)。在一个实施方式中，所述分析物是从天然来源中分离的或者是合成的。术语分析物还包括化合物或试剂的混合物，例如但不限于：组合库和来自生物体或天然环境的样品。在一些实施方式中，本申请的生物传感器用于检测的分析物为小分子、蛋白质或dna。
在一些实施方式中，结合dna适配体的分析物为核苷三磷酸(ntp)。在一些实施方式中，所述核苷三磷酸选自于三磷酸腺苷(atp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸5-甲基尿苷(m5utp)、三磷酸尿苷(utp)和一磷酸腺苷(amp)。在一些实施方式中，所述ntp选自于脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)和脱氧尿苷三磷酸(dutp)。
在一些实施方式中，线性单链核酸序列的所述第一核酸序列和所述第二核酸序列为引物前体序列。在一些实施方式中，所述引物前体序列为gttacagtcacggtatatttacccaggtcagtg(seqidno：3)。在一些实施方式中，所述引物前体序列为gttacagtcacggtatatttagccgtagcctg(seqidno：4)。在一些实施方式中，所述引物前体序列为gttacagtcacggtatatttaggatccgacgtt(seqidno：5)。在一些实施方式中，所述引物前体序列为gttacagtcacggtatatttacccaggtcagtg/3invdt/(seqidno：6)。
在一些实施方式中，所述rca为等温酶促程序，其中，使用环状dna模板和适当的dna聚合酶或rna聚合酶对短的dna引物或rna引物进行扩增以形成长的单链dna或rna。在一些实施方式中，所述rca为hrca，其为源自滚环扩增并通过使用正向引物和反向引物来提高rca的灵敏度的技术。正向引物产生多聚的单链dna(ssdna)或单链rna(ssrna)，其随后成为多个反向引物的模板。然后在延伸程序中所述dna聚合酶或rna聚合酶延伸反向引物，并且下游的dna或rna被置换以生成分支或分叉的dna复合物或rna复合物。当所有的ssdna链和ssrna链均转换为双链dna(dsdna)或双链rna(dsrna)时，该程序终止。
在一些实施方式中，本申请的生物传感器进一步包括核酸聚合酶。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶为具有3'至5'核酸外切酶活性的dna聚合酶或具有3'至5'核酸外切酶活性的rna聚合酶。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶为dna聚合酶。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶为φ29dp。
在一些实施方式中，作为rca模板的环状单链核酸分子与作为rca模板的引物序列的线性单链核酸分子的第一核酸序列形成核酸双链体。
在一些实施方式中，线性单链核酸分子的被具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶消化的第二核酸序列与线性的结合分析物的单链核酸分子形成核酸双链体。
在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于纳摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于皮摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于飞摩尔(femtomolar)的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于渺摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为渺摩尔至纳摩尔的分析物浓度。
iii.本申请的方法
本申请还包括利用本申请的生物传感器的测定法。在一些实施方式中，所述测定是检测样品中分析物的方法，其中，所述样品包含或疑似包含所述分析物，所述方法包含将所述样品与本申请的生物传感器进行接触，然后监测来自rca模板的核酸产物的存在，其中所述来自rca模板的核酸产物的存在表明所述样品中存在所述分析物。
所述样品来自于任何来源，例如：任何的生物来源(例如人类或动物医学样品)、环境来源(例如水或土壤)或天然来源(例如植物)、或者来自任何的制造来源或合成来源(例如食品或饮料)。最为方便的是样品处于液态或者将其溶于合适的溶剂中制成溶液。对定量分析而言，溶液中的样品量应当是已知的。所述样品是包含或疑似包含一种或多种分析物的样品。
在一个实施方式中，所述分析物是从天然来源中分离的或者是合成的。术语分析物还包括化合物或试剂的混合物，例如但不限于：组合库以及来自生物体或天然环境的样品。在一些实施方式中，本申请的生物传感器用于检测的分析物是小分子、蛋白质或dna。
在一些实施方式中，所述分析物选自于：无机小分子、有机小分子、金属离子、激素生长因子、生物分子、毒素、生物聚合物(例如糖类、脂质、肽和蛋白质)、微生物(包括细菌和病毒)、细胞和组织。在另一个实施方式中，所述分析物选自于：无机小分子、有机小分子、激素生长因子、生物分子、肽、蛋白质、细菌、病毒和细胞。在一些实施方式中，所述分析物选自于：激素生长因子、病毒和生物分子。在一些实施方式中，所述分析物为生物分子。在一些实施方式中，所述分析物为激素生长因子。在一些实施方式中，所述分析物是细菌或病毒基因组的核酸序列。在一些实施方式中，所述分析物为三磷酸腺苷。在一些实施方式中，所述分析物为血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactor)。在一些实施方式中，所述分析物为丙型肝炎病毒基因组的dna序列。
在一些实施方式中，来自rca模板的核酸产物为单链dna分子或单链rna分子。在一些实施方式中，来自rca模板的核酸产物为包含重复核酸序列的长的单链dna分子或单链rna分子。在一些实施方式中，术语“长”是指包含数千个重复序列单元的核酸序列。
在一些实施方式中，来自rca模板的核酸产物通过滚环扩增生成。所述滚环扩增反应在存在本申请的生物传感器、rca反应缓冲液、脱氧核苷酸(dntp)、核酸聚合酶和合适的溶剂的情况下进行。将环状单链核酸分子、线性的结合分析物的单链核酸分子、包含第一核酸序列和第二核酸序列的线性单链核酸分子在足以形成生物传感器的核酸组装体的温度和时间下孵育。非限制性反应温度的实例包括但不限于：10℃至约30℃或约20℃至约25℃。非限制性反应时间的实例包括但不限于：5min至约1h或约15min至约30min。
随后，通过加入rca反应缓冲液、dntp、核酸聚合酶和合适的溶剂来触发rca反应。将反应混合物在第一温度和第一时间下孵育，然后经历足以完成rca程序的第二温度和第二时间。就第一温度而言，温度的非限制性实例包括但不限于：10℃至约40℃或约20℃至约30℃。就第一时间区间而言，反应时间的非限制性实例包括但不限于：30分钟至约3小时或约1小时至约2小时。就第二温度而言，温度的非限制性实例包括但不限于：50℃至约120℃或约70℃至约90℃。就第二时间区间而言，反应时间的非限制性实例包括但不限于：1min至约30min或约5min至约20min。在一些实施方式中，所述合适的溶剂为水性溶剂。在一些实施方式中，所述水性溶剂为水。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶是具有核酸外切酶活性、特别是3'-5'核酸外切酶活性的dna聚合酶。在一些实施方式中，所述dna聚合酶为φ29dp。
每轮rca程序生成核酸产物。所述核酸产物是多聚的单链核酸产物。在一些实施方式中，所述多聚的单链核酸产物进一步用作rca模板。
在一些实施方式中，通过超分支滚环扩增(hrca)生成来自rca模板的核酸产物。在存在本申请的生物传感器、rca反应缓冲液、脱氧核苷酸(dntp)、嵌入的饱和荧光染料、反向引物序列、核酸聚合酶和合适的溶剂的情况下进行hrca反应。在一些实施方式中，hrca程序在放置于设定为恒定温度的荧光计的比色杯中进行，其中，以足够达到荧光最大值稳定水平的时间间隔对荧光强度进行测量。非限制性反应温度的实例包括但不限于：10℃至约50℃或约20℃至约30℃。在一些实施方式中，以1分钟的时间间隔对hrca反应进行监测。在一些实施方式中，所述合适的溶剂为水性溶剂。在一些实施方式中，所述水性溶剂为水。在一些实施方式中，所述核酸聚合酶是具有核酸外切酶活性，特别是3'-5'核酸外切酶活性的dna聚合酶。在一些实施方式中，所述dna聚合酶为φ29dp。
在一些实施方式中，通过监测核酸产物的存在来实施对分析物的检测。在该实施方式中，形成的核酸产物具有不同于任何起始试剂信号的可检测信号(例如荧光、分子量)。
在一些实施方式中，核酸产物的存在包含检测系统。在一个实施方式中，所述检测系统选自于荧光系统、比色系统、电泳系统和电化学系统。
在一些实施方式中，使用电泳系统监测来自rca模板的核酸产物的存在，然后通过检测单一分子量条带来确认分析物的存在。制备样品、制备凝胶和随后电泳系统的可视化技术的方法在现有技术中是众所周知的。
在一些实施方式中，使用核酸电泳来测量来自rca模板的核酸产物。在一些实施方式中，所述核酸电泳在变性条件下进行。在一些实施方式中，所述电泳系统选自于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dpage)和琼脂糖凝胶电泳。
在一些实施方式中，使用荧光系统监测来自rca模板的核酸产物的存在，然后通过检测荧光信号来确认分析物的存在。
在一些实施方式中，所述荧光系统包含监测核酸产物扩增进程的荧光报道分子。取决于信号生成的模式，所述荧光报道分子是荧光基因标记的寡核苷酸(被称为探针)或荧光发生核苷酸结合染料。
在一个实施方式中，用于生物传感器的荧光报道分子的选择基于以下一个或多个参数，包括但不限于：(i)最大激发波长和发射波长；(ii)消光系数(extinctioncoefficient)；(iii)量子产率(quantumyield)；(iv)寿命；(v)斯托克斯位移(stokesshift)；(vi)荧光团的极性以及(vii)大小。
在一些实施方式中，所述荧光报道分子是高分辨率熔解(hrm)染料或探针。hrm分析提供了实时监测核酸产物存在的能力。所述hrm染料是嵌入的饱和荧光染料，其一旦大量地结合至双链核酸，产生明亮的荧光信号。在一些实施方式中，所述荧光系统包含饱和嵌入式核酸荧光染料。在一些实施方式中，所述饱和嵌入式核酸荧光染料为花青染料(cyaninedye)，例如选自于lcgreentm、p2、syto9tm、evagreentm、chromofytm、bebotm、sybrgoldtm和boxtotm。在一些实施方式中，所述饱和嵌入式核酸荧光染料为evagreentm。
在一些实施方式中，当所述样品包含所述分析物时，将所述样品与本申请的生物传感器进行接触从而诱导：
(a)所述分析物与所述结合分析物的单链核酸分子结合，从而引起所述结合分析物的单链核酸序列从线性单链核酸分子的所述第二核酸序列上释放；
(b)所述核酸聚合酶对所述第二核酸序列进行核酸外切消化，产生包含所述第一核酸序列的成熟引物核酸序列；以及
(c)所述核酸聚合酶与所述成熟引物核酸序列结合，触发借助所述环状单链核酸分子的滚环扩增(rca)，从而产生所监测的单链核酸产物。
在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于纳摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于皮摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于飞摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为低于渺摩尔的分析物浓度。在一些实施方式中，本申请的生物传感器的检测范围为渺摩尔至纳摩尔的分析物浓度。
本申请进一步包括包含本申请的生物传感器的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括所述生物传感器和使用所述生物传感器实施测定的任何其它试剂(例如具有核酸外切酶活性的核酸聚合酶)。在一些实施方式中，所述试剂包括rca反应缓冲液、脱氧核苷酸(dntp)、饱和嵌入式核酸荧光染料和水。在一些实施方式中，所述dntp为datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括在测定中使用该生物传感器的说明书以及实施该测定所需的任何对照。所述对照可处于所述生物传感器自身，或者可选地，所述对照在单独的基底上。在一些实施方式中，对照反应缺少环状单链核酸分子、线性的结合分析物的单链核酸分子、包含第一核酸序列或第二核酸序列的线性单链核酸分子或它们的组合。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括实施本申请的任何测定法所需的全部组分。
实施例
以下非限制性实施例用以对本申请进行说明：
实施例1：开发包含核酸组装体的生物传感器
寡核苷酸和其它材料
全部dna分子序列在表1中提供。dna寡核苷酸从integrateddnatechnologies(idt，coralville，ia，usa)获得，然后通过10％变性(8m尿素)聚丙烯酰胺凝胶电泳(dpage)纯化。t4多核苷酸激酶(pnk)、t4dna连接酶、φ29dp、atp和dntp购自thermoscientific(ottawa，on，加拿大)。α-[32p]atp从perkinelmer(woodbridge，on，加拿大)获得。水为经milli-qsynthesisa10水纯化系统纯化。所有的其它化学品购自sigma-aldrich(oakville，加拿大)，不经进一步纯化而使用。
仪器
使用typhoon9200多模式成像系统(gehealthcare)获得dpage和琼脂糖凝胶的放射自显影图像和荧光图像，使用imagequant软件(moleculardynamics)进行分析。使用caryeclipse荧光分光光度计(varian)进行荧光测量，激发波长为500nm，发射波长为530nm。
制备环状模板ct1
借助t4dna连接酶和环状dna模板cdt1将5'-磷酸化的线性模板lt1环化来制备环状模板(ct)。为了在5'末端处磷酸化lt1，将200pmollt1与处于50μl的1xpnk缓冲液a(50mmtris-hcl、25℃时ph7.6、10mmmgcl2、5mmdtt、0.1mm亚精胺)中的2mmatp和10u(u：单位)pnk混合，在37℃孵育40min，然后在90℃加热5min。为了环化5'-磷酸化的lt1，将300pmolcdt1加入上述反应混合物中。将该混合物在90℃加热5min，然后在室温下(～23℃)冷却20min。随后加入15μl10×t4dna连接酶缓冲液(400mmtris-hcl、100mmmgcl2、100mmdtt、5mmatp、25℃时ph7.8)和10ut4dna连接酶。将获得的混合物(共150μl)在室温孵育2h，然后在90℃加热5min以使连接酶失活。通过乙醇沉淀对混合物中的dna进行浓缩，然后通过10％dpage对混合物中的ct1进行纯化。
pp1、pp2和pp3的核酸外切消化
就仅消化引物前体(pp)1而言(图1b)，在50μl1×rca反应缓冲液(33mmtris乙酸盐、10mm乙酸镁、66mm乙酸钾、0.1v/v％tween-20、1mmdtt、25℃时ph7.9)中，将1μm5'-32p标记的pp1与1μlφ29dp储液(5u/μl)在30℃下孵育。在1min、5min、10min、20min、30min和60min时取5μl反应混合物，与5μl基于尿素的2×变性凝胶上样缓冲液合并，在90℃加热5min，然后用20％dpage进行分析。
就引物前体1(pp1)-适配体1(ap1)杂交体的消化而言(图1c)，在含有50pmol5'-32p标记的pp1和各含量的5'-fam标记的ap1的40μl杂交缓冲液(50mmtris-hcl、25℃时ph7.4、100mmnacl、5mmmgcl2和0.02％tween-20)中进行dna的杂交。将混合物在90℃加热5min然后冷却至室温20min。为了启动消化，加入1μlφ29dp储液、5μl10×rca反应缓冲液和4μl水。pp1的终浓度为1μm，而ap1的终浓度为0.2μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm或2.5μm。将反应混合物在30℃孵育30min，随后加入等体积的2×变性凝胶上样缓冲液，然后在90℃加热5min。所获得的混合物用20％dpage进行分析。除了用ct1替代ap1之外，以相同的方式对pp1-ct1杂交体进行消化和分析(图2a)。
为了在存在atp或gtp的情况下消化pp1-ap1和pp1-ap1-ct1(图1d、图2b、图2c、图7)，使用与上述相同的步骤，在含有50pmol5'-32p标记的pp1和75pmolap1(就pp1-ap1而言)以及50pmolct1(就pp1-ap1-ct1而言)的40μl杂交缓冲液中进行杂交反应。然后加入5μl10×rca反应缓冲液、1μl25mmatp或gtp、3μl水和1μlφ29dp储液。以相同的方式建立缺少ap1、ct1、atp、gtp或这些的组合的各对照反应。将各反应混合物在30℃温育30min，然后使用与上述完全相同的步骤进行20％dpage分析。
就仅消化pp2或者在具有以及不具有pdgf下消化i-ap2-pp2和i-ap2-pp2-ct1杂交体中pp2而言(图4a)，步骤与在atp系统中使用的步骤类似。反应混合物含有1μm放射性pp2、1μmct1、1.5μmi-ap2、100nmpdgf以及0.1u/μlφ29dp的各种组合。各反应混合物在30℃孵育30min，然后通过20％dpage进行分析。
同样类似地实施仅消化pp3或在具有以及不具有hcv-1dna下消化i-dp1-pp3和i-dp1-pp3-ct1杂交体中的pp3(图10)。反应混合物含有1μm放射性pp3、1μmct1、1.5μmi-dp1、100nmi-hcv-1dna和0.1u/μlφ29dp的各种组合。将各反应混合物在30℃下孵育30min，然后通过20％dpage进行分析。
rca反应
就利用atp传感系统的rca反应而言(图3)，在40μl杂交缓冲液中50pmolpp1、50pmolct1和75pmolap1的杂交反应之后，加入1μl25mmatp，然后将所获得的混合物在室温孵育30min。随后通过加入5μl10×rca反应缓冲液、2μldntp(各10mm的datp、dctp、dgtp和dttp)、1μlφ29dp储液和2μl水启动rca反应。反应混合物在30℃孵育1h，然后在90℃加热5min。以相同的方式建立缺少pp1、ct1、atp或这些的组合的各种对照反应。通过0.6％琼脂糖凝胶电泳对来自这些反应的rca产物进行分析。
对于以pdgf传感系统进行的rca反应(图4b和图4c)，除了用i-ap2替代ap1、pp2替代pp1以及pdgf(最终浓度100nm)替代atp之外，步骤与用于atp诱导的反应的步骤完全相同。bsa、凝血酶和igg也被用作非靶向对照。测试了0.001nm、0.005nm、0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm和50nm的pdgf浓度。
使用hrca反应检测pdgf和hcv-1dna
在30μl杂交缓冲液中进行50pmolpp2、50pmolct1和75pmoli-ap2的杂交，之后加入5μl10×rca反应缓冲液、1μl指定的pdgf储液、1μlφ29dp储液、2μldntp(各10mm)、2μlfp1(10μm)、2μlrp1(10μm)、2.5μl25×evagreen和4.5μl水。这些反应在置于荧光计(设置为30℃恒温)中的比色杯中进行，并且每隔1min记录荧光强度。
除了使用以下的试剂之外，使用与用于检测pdgf的步骤类似的步骤检测hcv-1dna：50pmolpp3和75pmoli-dp1、浓度在2am-20nm之间改变的hcv-1。
结果和讨论
适配体ap1
使用众所周知的抗atpdna适配体[13]，对存在和不存在适配体(ap)的情况下的pp(引物前体)的消化进行评估。将用于检测atp的ap和pp分别命名为ap1和pp1(用于该工作的dna分子的序列提供于表1中)。如图1b所示，在30min内，超过90％的pp1(1μm)被φ29dp(0.1单位/μl)降解。然而，在存在2.5μmap1的情况下，pp1的降解被降低至3％(图1c)。该结果表明ap1确实能够通过形成ap1-pp1双链体而阻止φ29dp对pp1的核酸消化。
鉴于在60min后ap1的核酸消化<5％(图6)，而在相同条件下，pp1的消化率为96％(图1a)，ap1对由φ29dp进行的核酸消化是相当具有抗性的。这表明该适配体具有的结构对φ29dp核酸外切消化有抗性，这与所报道的该适配体的发夹结构模型一致[13b]。
随后评估了atp对pp1消化的影响，预期atp将通过结构切换诱导ap1从ap1-pp1双链体中释放[12]。实际上，在存在ap1的情况下，添加atp(0.5mm)使得pp1切割的显著增加(45％，相对于没有atp的4％；图1d)。相反，当提供gtp时，未观察到pp1消化的显著变化(图7)。这个结果展示了ap1的释放是atp依赖性的。
接下来研究了在存在ct1(0μm-2.5μm)的情况下pp1(1μm)的消化(图2a)。当提供ct1时，pp1的消化模式发生改变：随着ct1浓度的增加，小的消化产物的量减少，而中等片段(称为mrf)的量增加(图2a)。这一观察结果与pp1的未配对区域被φ29dp剪切的预期一致。
然后研究了在pp1-ap1-ct1组装体内pp1的消化模式。在缺少atp的情况下，pp1受保护免于被φ29dp核酸外切消化，因此没有观察到mrf(图2b，第4泳道，方框)。然而，加入atp导致暴露的3'末端的剪切，体现为mrf的出现(图2b，泳道8，方框)。当用gtp替代atp时，mrf消失了(图2c，泳道4，方框)。
图1和图2说明了：(1)φ29dp可消化sspp1；(2)pp1-ap1双链体的形成阻止pp1的消化；(3)加入atp促进ap1从三重组装体中释放；以及(4)φ29dp剪切暴露pp1的ss片段，从而将其转化为成熟引物。
为了说明pp1的核酸剪切可获得能够启动rca的成熟引物，用pp1-ct1杂交体进行rca反应。用i-pp1-ct1(在3'末端含有反向dt的被修饰的pp1)进行相同的反应作为对照。这种修饰应使i-pp1能够完全抵抗φ29dp的消化。实际上，发现φ29dp不能降解i-pp1(图8a)。琼脂糖凝胶分析表明，当pp1与ct1、dntp和φ29dp一起孵育时，产生了rca产物(rp)(图8b)。然而，当使用i-pp1替代pp1时并没有观察到rp。这些结果表明，φ29dp成功对pp1进行剪切是rca的先决条件。
接下来评估了由atp推动的pp1-ap1-ct1组装体的rca反应。预计将发生以下三个事件：(1)atp推动的结构切换；(2)由φ29dp对pp1进行的核苷酸外切剪切；(3)通过φ29dp进行rca。将结构切换事件(将dna组装体与atp混合)从引物剪切和rca事件(将atp/dna溶液与φ29dp/dntp混合)中分开。结果如图3所示(面板a：-atp；面板b：+atp)。每个面板的前6个泳道作为阴性对照(当省略pp1或ct1时，rca应不会发生)。各泳道7作为阳性对照(当提供pp1和ct1而省略ap1时，rca应该发生)。每个面板的最后一条泳道用于atp依赖性测试。如所预期的，在任何阴性对照中都没有观察到rp，而在两个阳性对照中发现了rp。更重要的是，atp的存在的确导致产生了更多的rp：面板b的泳道8的rp条带比面板a中的相同的条带强度更大(由方框表示)。不希望受理论约束地，在缺少atp的情况下不应观察到rp。但是，已知dna适配体同样可以结合datp[13]。因此，在缺少atp的情况下，少量的rp可能来源于核酸剪切-rca步骤(其中提供datp作为dna扩增所需的dntp的一部分)。这也是将结构切换步骤与剪切和rca步骤分开的原因。
适配体ap2
为了证明配体响应式的rca是结构切换适配体的通用特征，研究了另一种适配体系统。研究了一种新型dna适配体探针ap2，该ap2基于已报道的结合人类血小板源性生长因子(pdgf)的适配体[14]。因为该适配体不具有抵抗φ29dp的核酸消化的内在结构，为了防止被φ29dp降解，在ap2的3'末端处用反向dt进行修饰(命名为i-ap2)。
三重组装体由i-ap2-pp2-ct1制成。在各种条件下对放射性pp2进行消化，而结果与atp系统几乎相同(图4a)。简而言之，在缺少i-ap2和ct1时，pp2被完全消化(泳道1和泳道5)。当提供i-ap2但省略ct1时，在缺少pdgf的情况下，pp2被保护地非常好(泳道2)，但是在存在pdgf的情况下，pp2被大量消化(泳道6)。然而，当提供ct1但省略i-ap2时，在pdgf不存在(泳道3)和存在(泳道7)的情况下，pp2被部分消化为mrf。更重要的是，当提供i-ap2和ct1时，在缺少pdgf的情况下，pp2被充分地保护(泳道4)，但是在存在pdgf的情况下，pp2被剪切成mrf(泳道8，方框)。
i-ap2-pp2-ct1组装体的rca反应的结果示于图4b和图4c中。与atp系统不同的是，结构切换、核酸剪切和rca反应可同时进行。如所预期的，在缺少pdgf的情况下，rca反应被停止(图4b，泳道8；泳道1-7作为各种对照，如在atp系统的情况下)。然而，加入pdgf后观察到了rp(图4c；泳道8)。利用其它蛋白质(bsa、凝血酶和igg)和突变型dna适配体(i-ap2m)进行的对照实验证明，rca反应既取决于与适配体匹配的靶标(图9a)又取决于特异性的适配体序列(图9b)。这些结果表明刺激-应答、消化-引发的rca可普遍适用于结构切换适配体。此外，对rp的产量对于pdgf浓度增加的响应进行了分析。如图5a所示，通过琼脂糖凝胶分析可检测到低至10pm。
为了进一步提高检测的灵敏度，采用超分支rca(hrca)[15]。在hrca中(如图5b所示)，使用正向引物(fp1)从rca产生的dna产物进一步地使用第二引物(反向引物，rp1)，由φ29dp复制成dna产物，而其可进一步使用fp1进行扩增。这个程序的结果是指数式扩增[16]。这种策略是通过使用fp1和rp1作为交叉扩增引物而被采用的。使用dna嵌入染料evagreentm来实现对hrca产物的实时监测。在存在pdgf的情况下，荧光强度随着反应时间逐渐增加，表明了pdgf确实可启动hrca(图5c)。使用这种方法，可在低至1fm的浓度下检测到pdgf(图5d)。值得注意的是，hrca提供了比常规rca(10pm)高4个数量级的检测灵敏度。pdgf适配体具有～0.1nm的解离常数(kd)[14]，并且之前报道的结构切换的荧光适配体生物传感器仅能够实现～2nm的检测极限[17]。因此，本申请所教导的生物传感策略提供了显著提高的检测极限。就本申请人所知，1fm的检测极限代表pdgf适配体所能实现的最低检测浓度[7b,17]。
dna探针dp1
为了将消化引发的rca方法延伸至基于适配体的检测之外，将相同的策略应用于dna检测(图10和11)。dna探针i-dp1具有特定的dna序列以识别hcv-1dna，其表示了丙型肝炎病毒基因组的互补dna序列的一部分[18]。再次采用了hrca策略，同时使用evagreentm对dna扩增子进行实时检测。荧光强度以时间依赖性的方式响应于hcv-1dna而增加(图11a和图11b)。通过对180min获得的荧光强度相对于dna浓度(图11c)作图，发现检测极限为20am，相应于在50μl中600个拷贝的dna。除了突出的检测极限以外，该方法还表现出优异的选择性。当使用非预期的dna靶标(如hcv-m1和hcv-m2(分别含有7个和9个错配的核苷酸；图11d))对系统进行测试时，没有观察到荧光增加。
尽管已经参照实施例对本申请进行了描述，但应当理解的是，权利要求的范围不应被实施例中阐述的实施方式所限制，而应该被给予与以说明书作为整体相一致的最广泛的解释。
以引用的方式将所有的出版物、专利和专利申请整体并入本文，该并入的程度为如同以引用的方式整体并入的各个出版物、专利或专利申请具体且独立地指出的程度。在发现本申请中的术语与以引用的方式并入本文的文件中具有不同的定义的情况下，以本文提供的定义作为该术语的定义。
表1：dna寡核苷酸的序列
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