本发明涉及基因组序列的修饰方法、及其使用的核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶的复合体，该基因组序列的修饰方法能够不伴随DNA的双链的切割(无切割或者切割一根链)也不进行外来DNA片段的插入，而修饰革兰氏阳性菌基因组的特定区域内的核酸碱基。
背景技术：
：革兰氏阳性菌是被革兰氏染色染色成深蓝色或紫色的细菌的总称，包括许多在传统的发酵生产、新生物技术中利用的有用细菌，如乳酸菌、放线菌等。革兰氏阳性菌与大肠杆菌等革兰氏阴性菌不同，不具有外膜，因此蛋白质等的分泌能力较高，另外，由于不产生内毒素，因此也适合于异种蛋白质的生产。因此，做出了许多为了修饰革兰氏阳性菌的基因，进一步改善有用细菌的性质的尝试。例如，某种梭菌属细菌(例如：糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)等)从过去就作为工业性的丁醇发酵细菌而利用，已经进行了以丁醇产率的提高为目标，通过基因重组来减少副产物(丙酮、乙醇、有机酸等)的研究。另外，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)作为以谷氨酸、赖氨酸为首的食品用、饲料用、医药用的氨基酸的工业生产细菌已被使用了历经50年以上，可以通过使控制催化从TCA循环的2-氧代戊二酸向琥珀酰-CoA的转变的ODHC的活性的pknG基因发生缺陷，而使谷氨酸的生产增大。以及，桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschoshinensis)已被减少了细胞外的蛋白质分解活性，作为异种蛋白质的高分泌生产体系被利用，但通过使编码细胞外蛋白酶的emp基因发生缺陷，可以进一步减少其细胞外的蛋白质分解活性。然而，常规法中的基因修饰是使用同源重组而插入外来基因、或使基因组基因缺失而通过靶破坏基因而进行，因此得到的微生物相当于基因重组微生物。因此，存在为了确保安全性而设备费用、废弃物质的处理费用变大，制造成本提高的问题。另一方面，近年来，作为在各种生物种类中修饰靶基因、基因组区域的技术，基因组编辑受到关注。目前，作为基因组编辑的方法，提出了利用具有序列非依赖的DNA切割能力的分子与具有序列识别能力的分子组合而成的人工核酸酶的方法(非专利文献1)。已有报告例如：使用由锌指DNA结合结构域与非特异性DNA切割结构域连接而成的锌指核酸酶(ZFN)，在作为宿主的植物细胞或昆虫细胞中，进行DNA中的靶基因座的重组的方法(专利文献1)；使用由作为植物病原菌黄单胞菌属具有的DNA结合模块的转录激活子样(TAL)效应子，与DNA核酸内切酶连接而成的TALEN，在特定的核苷酸序列内或其相邻位点进行切割、修饰靶基因的方法(专利文献2)；或者，利用由真细菌和古细菌具有的获得性免疫系统中起作用的DNA序列CRISPR(ClusteredRegularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，和与CRISPR一起具有重要的作用的核酸酶Cas(CRISPR-相关的)蛋白家族组合而成的CRISPR-Cas9系统的方法(专利文献3)。进一步，也报告了使用PPR蛋白质与核酸酶连接而成的人工核酸酶，在该特定序列的附近切割靶基因的方法(专利文献4)，其中，PPR蛋白质为利用包括35个氨基酸的并识别1个核酸碱基的PPR基序的连续，来识别特定的核苷酸序列的方式构建而成。迄今为止已提出的基因组编辑技术，基本上是以基于核酸酶的DNA双链切割(double-strandedDNAbreaks：DSB)为前提。换言之，基因组编辑技术是以促进DSB发生同源重组-的见解为基础而基于以下构思：如果可以切割基因组中特定的区域，则是否变得易于将外来基因插入期望的区域。然而，对DSB而言，由于伴随了意想不到的基因组修饰，因此存在强细胞毒性、染色体的重排等副作用，细胞存活数极其少，在单细胞微生物中，存在本来基因修饰本身就较为困难这样的课题。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第4968498号公报专利文献2：日本特表2013-513389号公报专利文献3：日本特表2010-519929号公报专利文献4：日本特开2013-128413号公报非专利文献非专利文献1：KelvinMEsvelt,HarrisHWang(2013)Genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology,MolecularSystemsBiology9:641技术实现要素：发明要解决的问题本发明的目的在于提供一种新型基因组编辑方法、及用于其的核酸序列识别模块及核酸碱基转变酶的复合体，其中，不伴随DSB，即，通过对双链DNA无切割或切割一根链，且不依赖于外来DNA片段的插入、基因组DNA片段的缺失，而修饰革兰氏阳性菌的基因组基因的特定序列的核酸碱基。解决问题的方法本发明人等为了完成上述的目标而进行了深入研究，结果构思了不伴随DSB及DNA片段的插入和/或缺失，采用基于DNA碱基的转变反应的碱基转变。虽然已经知晓基于DNA碱基的脱氨基反应的碱基转变反应本身，但尚未实现用其对DNA的特定的序列进行识别而使任意位点靶向化，并通过DNA碱基的碱基转变而特异性修饰被靶向化的DNA。因此，通过使用催化脱氨基反应的脱氨酶作为进行这样的核酸碱基的转变酶，将其与具有DNA序列识别能力的分子(核酸序列识别模块)形成复合体，在包含3种革兰氏阳性菌的特定的DNA序列的区域中进行基于核酸碱基转变的基因组序列的修饰。具体而言，使用CRISPR-Cas系统(CRISPR-突变Cas)进行。即，制作了用于编码包含与待修饰的基因的靶核苷酸序列互补的序列(靶向序列)的基因组特异性的CRISPR-RNA(crRNA)，与用于募集Cas蛋白质的RNA(trans-activatingcrRNA:tracrRNA)连接而成的嵌合RNA分子(指导RNA)的DNA，另一方面，制作了用于编码失活了双链DNA两者的链的切割能力的突变Cas蛋白质的DNA(dCas)与脱氨酶基因连接而成的DNA，使用在各宿主细胞中起作用的表达载体将这些DNA导入革兰氏阳性菌。其结果，可以将靶核苷酸序列内的目标的碱基顺利取代为其它碱基。本发明人等基于这些见解进一步反复研究，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。[1]一种修饰革兰氏阳性菌具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括：使由核酸碱基转变酶、和与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体，与该双链DNA接触，不切割该靶向位点中的该双链DNA的至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该双链DNA与该复合体的接触，通过向该革兰氏阳性菌导入编码该复合体的核酸来进行。[2]上述[1]所述的方法，其中，上述核酸序列识别模块选自Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统、锌指基序、TAL效应子及PPR基序。[3]上述[1]所述的方法，其中，上述核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。[4]上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，使用分别与不同的靶核苷酸序列特异性结合的两种以上的核酸序列识别模块。[5]上述[4]所述的方法，其中，上述不同的靶核苷酸序列存在于不同基因内。[6]上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，上述核酸碱基转变酶为脱氨酶。[7]上述[6]所述的方法，其中，上述脱氨酶为胞苷脱氨酶。[8]上述[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，上述革兰氏阳性菌为除了芽孢杆菌(Bacillus)属以外的微生物。[9]上述[8]所述的方法，上述革兰氏阳性菌为属于梭菌(Clostridium)属、短芽孢杆菌(Brevibacillus)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物。[10]上述[9]所述的方法，其中，属于梭菌属的微生物为糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)。[11]上述[9]所述的方法，其中，属于短芽孢杆菌属的微生物为桥石短芽孢杆菌(Brevibacilluschosinensis)。[12]上述[9]所述的方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。[13]上述[1]～[12]中任一项所述的方法，其包括：将以能够控制表达时期的形式包含有编码上述复合体的核酸的表达载体，导入所述革兰氏阳性菌的步骤，以及在为了固定双链DNA的靶位点的修饰所必需的时期，诱导该核酸的表达的步骤。[14]核酸修饰酶复合体，其为使由核酸碱基转变酶、和与革兰氏阳性菌具有的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体，其在该革兰氏阳性菌中起作用，不切割靶向位点中的该双链DNA的至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸。[15]编码上述[14]所述的核酸修饰酶复合体的核酸。发明效果根据本发明的基因组编辑技术，由于不伴随外来DNA的插入或双链DNA切割，因此安全性方面优异，即使在常规方法中为基因重组微生物，从而在生物学上或者法律上存在争议的情况中，作为解决方案的可能也经常存在。例如，由于在使用革兰氏阳性菌的工业性发酵生产中，可以期待设备费用、废弃物质处理费用的减少，所以在经济学上有利。附图说明[图1]示意地示出破坏载体质粒的结构的图。具体实施方式本发明提供：不切割革兰氏阳性菌细胞内的待修饰双链DNA链，而是通过将该双链DNA中的靶核苷酸序列及其附近的核苷酸转变为其它核苷酸等，从而修饰该双链DNA的该靶向位点的方法(以下也称为“本发明的方法”)。该方法包括：通过使由核酸碱基转变酶、和可与该双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体，在宿主革兰氏阳性菌细胞内与该双链DNA接触，而使该靶向位点，即靶核苷酸序列及其附近的核苷酸转变为其它核苷酸的步骤。作为在本发明的方法中可使用的革兰氏阳性菌，只要是革兰氏染色阳性，且可取得在细菌体内能够复制的载体的细菌即可，没有特别限制，优选为传统的发酵生产、新生物技术中利用的有用细菌。可列举例如属于：梭菌属(Clostridium)属、芽孢杆菌属(Bacillus属)、链霉菌属(Streptmyces属)、棒状杆菌属(Corynebacterium属)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)、双歧杆菌属(Bifidobacterium属)、乳球菌属(Lactococcus属)、肠球菌属(Enterococcus属)、小球菌属(Pediococcus属)、明串珠菌属(Leuconostoc属)、链霉菌属(Streptomyces属)等的细菌等。优选为属于除了芽孢杆菌属以外的细菌。更优选可列举属于梭菌属、短芽孢杆菌属、棒状杆菌属的细菌。作为属于梭菌属的细菌，可例示糖丁酸梭状芽胞杆菌等，作为属于短芽孢杆菌属的细菌，可例示桥石短芽孢杆菌等，作为属于棒状杆菌属的细菌，可例示谷氨酸棒状杆菌等。在本发明中，对双链DNA的“修饰”是指使DNA链上具有的核苷酸(例如：dC)缺失或转变为其它核苷酸(例如：dT、dA或dG)、或者向DNA链上具有的核苷酸之间插入核苷酸或者核苷酸序列。这里，对待修饰的双链DNA而言，只要是存在于宿主細胞内的双链DNA即可，没有特别限制，优选为基因组DNA。另外，双链DNA的“靶向位点”是指，核酸序列识别模块可特异性识别并结合的“靶核苷酸序列”的全部或者一部分，或指其和该靶核苷酸序列的附近(5’上游及3’下游的任意一种或两种)。另外，“靶核苷酸序列”是指双链DNA中的核酸序列识别模块可结合的序列。在本发明中，“核酸序列识别模块”是指，具有对DNA链上的特定的核苷酸序列(即，靶核苷酸序列)进行特异性识别并结合的能力的分子或分子复合体。核酸序列识别模块可以通过与靶核苷酸序列结合，使与该模块连接的核酸碱基转变酶在双链DNA的靶向位点发挥特异性的作用。在本发明中，“核酸碱基转变酶”是指，可以通过催化DNA碱基的嘌呤或嘧啶环上的取代基转变为其它基团或原子的反应，不切割DNA链，将靶核苷酸转变为其它核苷酸的酶。在本发明中，“核酸修饰酶复合体”是指，包含由上述核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶连接而成的复合体，赋予了特定的核苷酸序列识别能力的具有核酸碱基转变酶活性的分子复合体。在此，“复合体”不仅包括由多个分子构成的形式，也包括像融合蛋白那样的，在单个分子内具有核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的形式。就用于用于本发明的方法的核酸碱基转变酶而言，只要可以催化上述反应即可，没有特别限制，可列举例如：催化氨基转变为羰基的脱氨基反应的，属于核酸/核苷酸脱氨酶超家族的脱氨酶。可列举优选：可以将胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶分别转变为尿嘧啶或胸腺嘧啶的胞苷脱氨酶，可以将腺嘌呤转变为次黄嘌呤的腺苷脱氨酶，可以将鸟嘌呤转变为黄嘌呤的鸟苷脱氨酶等。作为胞苷脱氨酶，更优选的可列举，作为在脊椎动物的获得性免疫中在免疫球蛋白基因中导入突变的酶的活化诱导的胞苷脱氨酶(以下，也称为AID)等。对核酸碱基转变酶的来源没有特别限制，只要是胞苷脱氨酶即可，可以使用例如：源自七腮鳗的PmCDA1(Petromyzonmarinuscytosinedeaminase1)、源自脊椎动物(例如：人、猪、牛、犬、黑猩猩等哺乳动物，鸡等鸟类，非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等两栖类，斑马鱼、香鱼、布氏鲶鱼等鱼类等)的AID(Activation-inducedcytidinedeaminase；AICDA)。对利用本发明的核酸修饰酶复合体的核酸序列识别模块进行识别的双链DNA中的靶核苷酸序列而言，只要可以与该模块特异性结合即可，没有特别限制，可以为双链DNA中的任意序列。就靶核苷酸序列的长度而言，只要足以与核酸序列识别模块进行特异性结合即可，根据革兰氏阳性菌的基因组尺寸，例如为12个核苷酸以上、优选为15个核苷酸以上、更优选为18个核苷酸以上。对长度的上限没有特别限制，优选为25个核苷酸以下，更优选为22个核苷酸以下。作为本发明的核酸修饰酶复合体的核酸序列识别模块，可以使用例如：Cas的至少1种DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统(CRISPR-突变Cas)、锌指基序、TAL效应子及PPR基序等，除此以外，包含限制酶、转录因子、RNA聚合酶等可与DNA进行特异性结合的蛋白质的DNA结合结构域且不具有DNA双链切割能力的片段等，但不限于这些。优选的可列举：CRISPR-突变Cas、锌指基序、TAL效应子、PPR基序等。锌指基序由3～6个Cys2His2不同型的锌指单元(1个手指识别约3个碱基)连接而成，可以识别9～18个碱基的靶核苷酸序列。锌指基序可以根据Modularassembly法(NatBiotechnol(2002)20:135-141)、OPEN法(MolCell(2008)31:294-301)、CoDA法(NatMethods(2011)8:67-69)、大肠杆菌单杂交法(NatBiotechnol(2008)26:695-701)等公知的方法制作。对于制作锌指基序的的细节，可以参照上述专利文献1。对TAL效应子而言，具有以约34氨基酸作为单位的模块的重复结构，利用1个模块的第12及13个氨基酸残基(称为RVD)确定结合稳定性和碱基特异性。由于各个模块的独立性较高，因此可以仅将模块相连来制作对靶核苷酸序列特异性的TAL效应子。TAL效应子可以利用Openresource的制作方法(REAL法(CurrProtocMolBiol(2012)Chapter12:Unit12.15)、FLASH法(NatBiotechnol(2012)30:460-465)、GoldenGate法(NucleicAcidsRes(2011)39：e82)等)进行构建，比较简便地设计相对于靶核苷酸序列的TAL效应子。对于制作TAL效应子的细节，可以参照上述专利文献2。对PPR基序而言，通过包含35个氨基酸的1个核酸碱基识别PPR基序的连续，以识别特定的核苷酸序列的方式构建而成，仅利用各基序的第1、4及第ii(倒数第2)的氨基酸识别靶向碱基。由于对基序构成没有依赖性，不受两侧的基序的干涉，因此与TAL效应子相同，可以仅将PPR基序相连，来制作对靶核苷酸序列特异性的PPR蛋白质。对于制作PPR基序的细节，可以参照上述专利文献4。另外，在使用限制酶、转录因子、RNA聚合酶等片段的情况下，由于它们的蛋白质的DNA结合结构域是众所周知的，因此可以容易地设计、构建包含该结构域，并且不具有DNA双链切割能力的片段。上述任意核酸序列识别模块也可以以上述核酸碱基转变酶的融合蛋白的形式提供，或者，也可以将SH3结构域、PDZ结构域、GK结构域、GB结构域等蛋白质结合结构域和它们的结合配偶体，分别与核酸序列识别模块和与核酸碱基转变酶融合，通过该结构域和它们的结合配偶体的相互作用而以蛋白质复合体的形式提供。或者，也可以将核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶和与内含肽(intein)分别融合，通过各蛋白质合成后的连接(Ligation)将两者连接。就包含核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶结合而成的复合体(包括融合蛋白)的本发明的核酸修饰酶复合体，与双链DNA的接触而言，通过向具有目标的双链DNA(例如，基因组DNA)的革兰氏阳性菌，导入编码该复合体的核酸来实施。因此，对核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶而言，以编码它们的融合蛋白的核酸的形式，或者，以使得利用结合结构域、内含肽等翻译成蛋白质之后，可以在宿主细胞内形成复合体的形态，以分别编码它们的核酸的形式进行制备。在此，核酸既可以是DNA也可以是RNA。在为DNA时，优选为双链DNA，并且以在宿主细胞内，配置为在功能性的启动子的操纵下的表达载体的形态提供。在为RNA时，优选为单链RNA。由于核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶结合而成的本发明的复合体不伴随DNA双链切割(DSB)，因此，能够进行毒性较低的基因组编辑，本发明的基因修饰方法可以广泛适用于革兰氏阳性菌全体。对编码锌指基序、TAL效应子、PPR基序等核酸序列识别模块的DNA而言，针对各模块可以通过上述任意方法获得。对编码限制酶、转录因子，RNA聚合酶等序列识别模块的DNA而言，可以通过以下进行克隆：例如基于它们的cDNA序列信息，而合成使得覆盖编码该蛋白质的期望部分(包含DNA结合结构域的部分)的区域的寡DNA引物，并利用从产生该蛋白质的细胞制备的总RNA或者mRNA级分作为模板，通过RT-PCR法扩增。编码核酸碱基转变酶的DNA也可以同样地通过以下进行克隆：基于待使用的酶的cDNA序列信息来合成寡DNA引物，使用由产生该酶的细胞制备的总RNA或者mRNA级分作为模板，通过RT-PCR法扩增。例如，就编码七腮鳗的PmCDA1的DNA而言，可以基于NCBI数据库登记的cDNA序列(accessionNo.EF094822)、针对CDS的上游及下游设计适当的引物，通过RT-PCR法从源自七腮鳗的mRNA进行克隆。另外，就编码人AID的DNA而言，可以基于NCBI数据库登记的cDNA序列(accessionNo.AB040431)、针对CDS的上游及下游设计适当的引物，例如通过RT-PCR法从源自人淋巴结的mRNA进行克隆。其它源自脊椎动物的AID同源也可以基于公知的cDNA序列信息(例如：猪(accessionNo.CU582981)、牛(accessionNo.NM_110138682)、犬(accessionNo.NM_001003380)、黑猩猩(accessionNo.NM_001071809)、鸡(accessionNo.NM_001243222)、非洲爪蟾(accessionNo.NM_001095712)、斑马鱼(accessionNo.AAI62573)、香鱼(accessionNo.AB619797)、布氏鲶鱼(accessionNo.NM_001200185)等)，与上述同样地进行而克隆。经克隆的DNA，可以直接根据需要利用限制酶进行消化，或在加入适当的接头之后，与编码核酸序列识别模块的DNA进行连接(Ligation)，来制备编码融合蛋白的DNA。或者，编码核酸序列识别模块的DNA和编码核酸碱基转变酶的DNA可以分别与编码结合结构域或者其结合配偶体的DNA进行融合，或两种DNA也可以通过与编码分离内含肽的DNA进行融合，在宿主细胞内翻译为核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶后再形成复合体的方式。这些情况下，也可以根据需要在一方或者双方的DNA的适当的位置连接接头。对编码核酸序列识别模块的DNA和编码核酸碱基转变酶的DNA而言，可以化学合成DNA链，或者也可以通过将合成的部分重叠的寡DNA短链利用PCR法、GibsonAssembly法进行连接，从而构建编码其全长的DNA。利用组合化学合成或PCR法或者GibsonAssembly法来构建全长DNA的优点在于，可以在整个CDS全长上设计与待导入该DNA的宿主配合的使用密码子。通过在表达异种DNA时，将该DNA序列转变为在宿主生物中使用频率高的密码子，可以期待使蛋白质表达量增大。就使用的宿主中的密码子使用频率的数据而言，可以使用例如在(公财)KazusaDNA研究所的主页上公开的遗传密码使用频率数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)、还可以参照记载在各宿主中密码子的使用频率的文献。只要参照取得的数据和准备导入的DNA序列，将该DNA序列中使用的密码子中的在宿主中使用频率低的密码子，转变为编码同一氨基酸且使用频率高的密码子即可。包含编码核酸序列识别模块及/或核酸碱基转变酶的DNA表达载体，可以通过例如将该DNA连接至适当的表达载体中启动子的下游来制造。例如，作为在梭菌属中能够复制的载体，只要是大肠杆菌和梭菌属的穿梭载体即可，可列举例如：源自pIM13的pKNT19(JournalofGeneralMicrobiology,138,1371-1378(1992))、pJIR756、pNAK1。另外，作为在短芽孢杆菌属中能够复制的载体，可列举源自Brevibacillusbrevis的pUB110，作为在Corynebacterium属中能够复制的载体，可列举源自谷氨酸棒状杆菌的pCG100-pHSG398杂合质粒。进一步，作为在乳球菌属中能够复制的载体，可列举源自Lactobacilluslactis的pLAB1000等。作为启动子，只要是对应于基因表达的宿主的适当的启动子即可。由于伴随DSB的常规法的毒性的缘故，有时宿主细胞的存活率显著降低，因此期望通过使用诱导启动子增加诱导开始为止的细胞数量，但由于即使表达本发明的核酸修饰酶复合体也可得到充分的细胞增殖，因此也可以无限制地使用构成启动子。表达载体，可以根据需要含有终止子、阻遏物、药物抗性基因、营养缺陷型互补基因等选择标记、在大肠杆菌等中能够发挥功能的复制起点等。编码核酸序列识别模块及/或核酸碱基转变酶的RNA，可以通过例如以编码上述核酸序列识别模块及/或核酸碱基转变酶的DNA编码载体作为模板，利用本身已知的体外转录系统转录为mRNA来制备。可以通过将包含编码核酸序列识别模块及/或核酸碱基转变酶的DNA表达载体导入宿主细胞，通过培养该宿主细胞，在细胞内表达核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的复合体。对表达载体的导入而言，可以根据宿主的种类，按照公知的方法(例如：溶菌酶法、感受态法、PEG法、CaCl2共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、粒子枪法、脂质转化法、农杆菌法等)进行实施。对于已导入载体的革兰氏阳性菌的培养，可以根据其种类而按照公知的方法实施。作为用于培养的培养基，优选液体培养基。另外，培养基优选含有转化体的生长所必需的碳源、氮源、无机物等。这里，作为碳源，可以举出例如：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；作为氮源，可以举出例如：铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉浸膏、大豆饼、马铃薯提取液等无机或有机物质；作为无机物，可以举出例如：氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。另外，也可以向培养基添加酵母提取物、维生素类、生长促进因子等。培养基的pH优选为约5～约8。革兰氏阳性菌的培养通常在约30～约40℃进行。根据需要，可以进行通气、搅拌。如上所述操作，可以在细胞内表达核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的复合体，即核酸修饰酶复合体。编码核酸序列识别模块和/或核酸碱基转变酶的RNA向革兰氏阳性菌的导入，可以通过本身公知的方法进行。RNA的导入可以1次或者隔着适当的间隔多次(例如：2～5次)反复进行。由导入至细胞内的表达载体或RNA分子，表达核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的复合体时，该核酸序列识别模块特异性识别并结合目的的双链DNA(例如，基因组DNA)内的靶核苷酸序列，利用连接于该核酸序列识别模块的核酸碱基转变酶的作用，靶向位点(在靶核苷酸序列的全部或者一部分或它们的附近的个基)的有义链或者反义链发生碱基转变，在双链DNA内产生错配(例如：将PmCDA1、AID等胞苷脱氨酶作为核酸碱基转变酶使用的情况下，靶向位点的有义链或者反义链上的胞嘧啶被转变为尿嘧啶，产生U:G或者G:U错配)。通过以下导入各种突变：该错配未被正确修复，或修复使得相反链的碱基与已转变的链的碱基成对(上述的例子中，为T-A或者A-T)，修复时进一步取代为其它核苷酸(例如：U→A、G)，或者发生1个～数十个碱基的缺失或者插入。对锌指基序而言，由于与靶核苷酸序列特异性结合的锌指的制作效率不高，另外，结合特异性高的锌指的筛选较为复杂，因此，制作实际发挥功能的多个锌指基序并不容易。就TAL效应子、PPR基序而言，比锌指基序的靶核酸序列识别的自由度高，但需要每次根据靶核苷酸序列设计并构建巨大的蛋白质，因此在效率方面存在问题。与此相对，由于CRISPR-Cas系统是通过相对于靶核苷酸序列互补的指导RNA来识别目的的双链DNA的序列，因此可以通过仅合成可与靶核苷酸序列形成特异性的Hybrid的寡DNA，以任意序列为靶标。因此，在本发明更优选的实施方案中，使用了Cas的至少1种DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统(CRISPR-突变Cas)作为核酸序列识别模块。使用了CRISPR-突变Cas的本发明的核酸序列识别模块是以嵌合RNA(指导RNA)与突变Cas蛋白质的复合体的形式提供的，其中，所述嵌合RNA包括：包含与靶核苷酸序列互补的配列的CRISPR-RNA(crRNA)、对突变Cas蛋白质的募集必需的trans-activatingRNA(tracrRNA)。对本发明使用的Cas蛋白质而言，只要与指导RNA形成复合体，可识别并结合靶基因中的靶核苷酸序列和与其相邻的protospaceradjacentmotif(PAM)即可，没有特别限制，优选为Cas9。作为Cas9，可列举例如：源自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpCas9；PAM序列NGG(N为A、G、T或C。以下相同))、源自嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的Cas9(StCas9；PAM序列NNAGAAW)、源自脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)的Cas9(MmCas9；PAM序列NNNNGATT)等，但不限于这些。优选为基于PAM的限制较少的SpCas9(实质上为2个碱基，理论上可以靶向于基因组上的基本所有位置)。作为本发明使用的突变Cas，Cas蛋白质的双链DNA的两条链的切割能力已失活的、和仅失活一条链的切割能力的具有切口酶活性的均可以使用。例如，在为SpCas9的情况下，可以使用第10位的Asp残基转变为Ala残基的、欠缺对形成与指导RNA互补的链的链的相反链的切割能力的D10A突变体，或者，第840位的His残基转变为Ala残基的、欠缺对与指导RNA互补的链的切割能力的H840A突变体，进一步可使用其双突变体，但也可以使用其它突变Cas。对核酸碱基转变酶而言，通过与上述锌指等之间的连接方式相同的方法，以突变Cas的复合体的形式提供。或者，核酸碱基转变酶和突变Cas也可以利用与作为RNA适体的MS2F6、PP7等和由它们的结合蛋白质构成的RNA支架进行结合。指导RNA中的靶向序列与靶核苷酸序列形成互补链，在附于其的tracrRNA中募集突变Cas来识别PAM，不切割一方或者两者的DNA，利用连接于突变Cas的核酸碱基转变酶的作用，使靶向位点(可以在包含靶核苷酸序列的全部或者一部分的几百个碱基的范围内适当调节)产生碱基转变，在双链DNA内产生错配。通过以下导入各种突变：该错配未被正确修复，修复使得相反链的碱基与已转变链的碱基成对，修复时进一步被转变为其它核苷酸，或者发生1个～数十个碱基的缺失或者插入。在将CRISPR-突变Cas用作核酸序列识别模块的情况下，也与将锌指等用作核酸序列识别模块的情况相同地，优选将核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶，以编码它们的核酸的形态导入具有目的的双链DNA的革兰氏阳性菌。编码Cas的DNA可以通过与对于编码核酸碱基转变酶的DNA的上述方法同样的方法，从产生该酶的细胞进行克隆。另外，突变Cas可以通过以下获得：在已克隆的Cas编码DNA中，使用本身公知的位点特异性的突变诱发法，以将对DNA切割活性重要的位点的氨基酸残基(例如：在为Cas9的情况下，可列举第10位的Asp残基、第840位的His残基，但不限于这些)转变为其它氨基酸的方式导入突变。或者，对编码突变Cas的DNA而言，也可以针对编码核酸序列识别模块的DNA、编码核酸碱基转变酶的DNA，通过与上述相同的方法和化学合成或PCR法或GibsonAssembly法进行组合，构建成具有适于使用的宿主细胞的表达的密码子使用的DNA形式。对编码突变CasDNA和编码核酸碱基转变酶的DNA而言，可以连接成使得作为融合蛋白表达，也可以设计成使得使用结合结构域、内含肽等分别进行表达，通过蛋白质间相互作用、蛋白质连接在宿主细胞内形成复合体。对得到的编码突变Cas及/或核酸碱基转变酶的DNA而言，可以根据宿主不同，插入至与上述相同的表达载体的启动子的下游。另一方面，编码指导RNA的DNA可以设计成，将包含相对于靶核苷酸序列的“目标链(targetedstrand)”互补的核苷酸序列(也称为“靶向序列(targetingsequence)”)的crRNA序列与已知的tracrRNA序列(例如：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt；序列号1)连接而成的寡DNA序列，并用DNA/RNA合成仪进行化学合成。在此“目标链”是指与靶核苷酸序列的crRNA杂交的链，将其的相反链而通过目标链与crRNA的杂交而成为一条链状的链称为“非目标链(non-targetedstrand)”。另外，由于推定核酸碱基转变反应通常大多情况在已成为一条链状的非目标链上发生，所以在将靶核苷酸序列以一条链的形式表现时(例如在标记PAM序列时，表示靶核苷酸序列与PAM的位置关系时等)，用非目标链的序列进行代表。对靶向序列的长度而言，只要是可相对于靶核苷酸序列特异性结合即可，没有特别限制，例如为15～30核苷酸、优选为18～25个核苷酸。靶核苷酸序列的选择受到与该序列的3’侧相邻的PAM的存在所限制，根据CRISPR-突变Cas和胞苷脱氨酶组合而成的本发明的系统，不论靶核苷酸序列的长度如何，也存在对容易位于从其5’端7个核苷酸以内的位置的C导入突变的规律性，所以可以通过适当选择靶核苷酸序列(作为其互补链的靶向序列)的长度来使可导入突变的碱基的位点移位。由此，也可以至少部分解除基于PAM(在SpCas9中，为NGG)的限制，进一步提高突变导入的自由度。靶向序列的设计例如可以通过以下进行：使用公开的指导RNA设计网站(CRISPRDesignTool，CRISPRdirect等)，从靶基因的CDS序列中列表出与PAM(例如：NGG)在3’侧相邻的20mer的序列，在将从其5’端7个核苷酸以内的C转变为T的情况下，选择使得靶基因所编码的蛋白质发生氨基酸变化的序列。进一步，在使靶向序列的长度在例如18～25个核苷酸的范围中变化的情况下，同理选择存在从其5’端7核苷酸以内的通过变为T的碱基转变而发生氨基酸变化的C的序列。可以从这些候选中，将目标的革兰氏阳性菌基因组中脱靶位点数量较少的候选序列用作靶向序列。虽然在CRISPRDesignTool、CRISPRdirect中，目前没有检索革兰氏阳性菌基因组的脱靶位点的功能，但例如可以通过针对候选序列的3’侧的8～12个核苷酸(靶核苷酸序列的识别能力高的seed序列)，对作为宿主的革兰氏阳性菌基因组进行Blast检索来检索脱靶位点。编码指导RNA的DNA也可以根据宿主而插入与上述相同的表达载体，作为启动子，优选使用polIII类的启动子(例如，SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U6、H1启动子等)及终止子(例如T6序列)。在使用polIII类启动子的情况下，应该使得不将有连续4个以上的T的核苷酸序列选择为靶向序列。对编码突变Cas及/或核酸碱基转变酶的RNA而言，可以通过例如，以对编码上述突变Cas及/或核酸碱基转变酶的DNA进行编码的载体作为模板，通过本身公知的体外转录系统转录为mRNA来制备。指导RNA(crRNA-tracrRNA)可以设计成将相对于靶核苷酸序列的目标链互补的序列与已知的tracrRNA序列连接而成的寡RNA序列，并用DNA/RNA合成仪进行化学合成。对编码突变Cas及/或核酸碱基转变酶的DNA或者RNA、指导RNA(crRNA-tracrRNA)或编码其的DNA而言，可以根据宿主不同，通过与上述相同的方法导入革兰氏阳性菌。常规型的人工核酸酶中，由于伴随DNA双链切割(DSB)，因此，对基因组内的序列进行靶向时，发生染色体的无序的切割(脱靶切割)导致的增殖障碍和细胞死亡。该影响在众多的微生物、原核生物中是特别致命的，阻碍了适用性。在本发明中，由于通过不切割DNA的对DNA碱基上的取代基的转变反应(特别是脱氨基反应)进行突变导入，因此，可以实现毒性的大幅降低。需要说明的是，在本发明的双链DNA的修饰中，除了靶向位点(可以在包含靶核苷酸序列的全部或者一部分的几百个碱基的范围内适当调节)以外，不会妨碍该双链DNA的切割的产生。然而，考虑到本发明的最大的一个优点是避免了由脱靶切割导致的毒性，则在优选的一种实施方案中，本发明的双链DNA的修饰，不仅在选择的双链DNA的靶向位点，在其以外的位点中也不伴随DNA链的切割。另外，虽然在后述的实施例中使用了双重突变型Cas9，但本发明人发现：在使用芽殖酵母、大肠杆菌等其它微生物作为宿主，作为突变Cas使用了具有仅可切割双链DNA中的一条链的切口酶(nickase)活性的Cas的情况下，与使用不能切割两条链的突变Cas的情况相比，突变导入效率升高了，因此，例如，通过除了核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶以外，进一步连接具有切口酶活性的蛋白质而仅在靶核苷酸序列的附近切割DNA一条链，可以避免基于DSB的强毒性，同时提高突变导入效率。进一步，对具有切割不同链的两种切口酶活性的突变Cas的效果进行比较的结果显示：一种的突变部位集中于靶核苷酸序列的中央附近，相对于此，另一种向从靶核苷酸序列到几百个碱基的区域随机导入了多种突变。因此，在本发明中也通过选择切口酶待切割的链，可以向革兰氏阳性菌具有的双链DNA的特定的核苷酸或核苷酸区域导入针点突变，或者向比较宽的范围随机导入多种突变，可以根据目的不同而分开使用。本发明人另外使用芽殖酵母确认了：与以单独的核苷酸序列为靶相比，通过相对于邻近的多个靶核苷酸序列而制作序列识别模块并同时使用，突变导入效率大幅升高。对其效果而言，由使得两个靶核苷酸序列的一部分发生重复的情况可知，即使在两者分开600bp左右的情况下，也实现相同的突变诱导。另外，在靶核苷酸序列存在于相同方向(目标链为相同链)、以及对向(以双链DNA的两条链为目标链)的两种情况下，均可发生。本发明人还使用芽殖酵母确认了，根据本发明的基因组序列的修饰方法，如果选择适当的靶核苷酸序列，则可以在表达本发明的核酸修饰酶复合体的基本全部的细胞中导入突变。因此，在常规基因组编辑中所必需的选择标识基因的插入和选择不再必要。其在使基因操作显著地变得简便的同时，由于没有了外来DNA的重组微生物，因此对有用微生物的分子育种等的适用性大幅变宽。另外，由于突变导入效率极高，且不需要利用标识的选择，因此在本发明的基因组序列的修饰方法中，可以对完全不同的位置的多个DNA区域作为靶进行修饰。因此，在本发明优选的一种实施方式中，可以使用与不同的靶核苷酸序列(可以在1个1个靶基因内，也可以在不同的2个以上的靶基因内。)分别特异性结合的、两种以上的核酸序列识别模块。在这种情况下，这些核酸序列识别模块的各1个，与核酸碱基转变酶形成核酸修饰酶复合体。在此，核酸碱基转变酶可以使用共通的酶。例如，在使用CRISPR-Cas系统作为核酸序列识别模块的情况下，可以对于Cas蛋白质和核酸碱基转变酶的复合体(包含融合蛋白)使用共通的物质，制作并使用两种以上的嵌合RNA作为指导RNA(crRNA-tracrRNA)，所述嵌合RNA是由与不同的靶核苷酸序列分别形成互补链的2种以上的crRNA的每一种分别与tracrRNA形成的。另一方面，在使用锌指基序、TAL效应子等作为核酸序列识别模块的情况下，例如可以将与不同的靶核苷酸特异性结合的各核酸序列识别模块，与核酸碱基转变酶进行融合。为了使本发明的核酸修饰酶复合体在宿主细胞内表达，因此如上所述将包含编码该核酸修饰酶复合体的DNA的表达载体、编码该核酸修饰酶复合体的RNA导入革兰氏阳性菌，但为了有效地导入突变，因此优选能保持规定时期以上、规定水平以上的核酸修饰酶复合体的表达。从该观点出发，确保在宿主细胞内导入能够自主复制的表达载体(质粒等)，但由于该质粒等为外来DNA，因此，优选在顺利实现了导入突变后，迅速地将其除去。或者，在依次修饰多个靶基因时，在能够使用的质粒即使为一种或者两种以上也为不相容性的情况下，需要在导入之后的质粒前去除首先导入的质粒。因此，虽然是根据宿主细胞的种类等不同而改变的，但优选例如：从导入表达载体到经过6小时～2天后，使用在本
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周知的各种质粒除去法，从宿主细胞除去已导入的质粒。或者，只要可得到足以进行突变导入的核酸修饰酶复合体的表达，也优选使用在宿主细胞内不具有自主复制能力的表达载体(例如：缺乏在宿主细胞中发挥功能的复制起点及/或编码对复制必需的蛋白质的基因的载体等)、RNA，通过一过性地表达向目的的双链DNA导入突变。由于在使本发明的核酸修饰酶复合体利用革兰氏阳性菌进行表达，并进行核酸碱基转变反应期间，靶基因的表达被抑制，因此迄今为止难以将对宿主细胞的生存所必需的基因作为靶基因直接进行编辑(产生宿主的生长障碍、突变导入效率不稳定、对与靶标不同的位点的突变等副作用)。本发明通过在为了期望的时期发生核酸碱基转变反应、固定靶向位点的修饰，而仅在必需的期间一过性地使本发明的核酸修饰酶复合体在宿主细胞内表达，可以有效地实现必需基因的直接编辑。对发生核酸碱基转变反应、固定靶向位点的修饰的必需的时期而言，虽然根据宿主细胞的种类、培养条件等不同，但认为通常需要2～20代。本领域技术人员可以基于使用的培养条件下的宿主细胞的倍增时间，适当确定适宜的表达诱导期。就本发明的编码核酸修饰酶复合体的核酸的表达诱导期而言，在对宿主细胞不产生副作用的范围，也可以超出上述“固定靶向位点的修饰的必需的时期”并延长。作为将本发明的核酸修饰酶复合体在期望的时期进行一过性地表达的方法，可列举制作以能够控制表达期的形态，包含编码该核酸修饰酶复合体的核酸(在CRISPR-Cas系统中，编码指导RNA-的DNA、和编码突变Cas及核酸碱基转变酶的DNA)的构建体(表达载体)，并导入革兰氏阳性菌的方法。“作为能够控制表达期的形态”，具体而言，可列举将编码本发明的核酸修饰酶复合体的核酸，置于诱导性的调节区的操纵下的形态。对“诱导性的调节区域”没有特别限制，可列举例如：温度敏感性(ts)突变阻遏物和操纵其的操纵基因的操纵子。作为ts突变阻遏物，可列举例如源自λ噬菌体的cI阻遏物的ts突变体，但不限于这些。在为λ噬菌体cI阻遏物(ts)的情况下，在30℃以下(例如，28℃)与操纵基因结合而抑制下游的基因表达，但在37℃以上(例如，42℃)的高温从操纵基因解离，因此可诱导基因表达。因此，通过将已导入编码核酸修饰酶复合体的核酸的宿主细胞，通常在30℃以下培养，在适当的时期将温度升高至37℃以上并培养一定时期，使其进行核酸碱基转变反应，并在向靶基因导入突变后迅速降回30℃以下，从而可以使得抑制靶基因表达的时期最短，即使在对宿主细胞所必需的基因进行靶向的情况下，也可以压抑副作用并有效地进行编辑。在利用温度敏感性突变的情况下，可以通过例如，将对载体的自主复制所必需的蛋白质的温度敏感性突变体，搭载于包含编码本发明的核酸修饰酶复合体的DNA载体，从而在该核酸修饰酶复合体表达之后，该载体不能迅速地自主复制，随着细胞分裂自然脱落。因此，通过与上述λ噬菌体的cI阻遏物(ts)组合使用，可以同时进行本发明的核酸修饰酶复合体的一过性地表达和质粒除去。以下，根据实施例对本发明进行说明。但是，本发明并不限于这些实施例。实施例实施例1糖丁酸梭状芽胞杆菌中的基因修饰(1)破坏载体质粒的构建-修饰CRISPR向pKNT19的导入将大肠杆菌和梭菌属微生物中能够复制的质粒pKNT19利用限制酶BamHI和KpnI进行切割，在之间插入下述必要基因序列而构建了破坏载体质粒。向包含双向启动子区域的StreptococcuspyogensCas9基因导入D10A及H840A的氨基酸突变(dCas9)，通过接头序列构建以与PmCDA1的融合蛋白的形式表达的构建体，进一步制作了同时搭载编码与糖丁酸梭状芽胞杆菌的pta基因(序列号2及3)内的各靶核苷酸序列互补的序列(靶向序列)的嵌合gRNA的质粒(全长核苷酸序列示于序列号4。向序列中n20的部分(核苷酸编号5560-5579)插入各靶向序列)(图1)。(2)破坏载体质粒向糖丁酸梭状芽胞杆菌的导入上述(1)中制作的破坏载体质粒中，将11757或1269+AatII转化至糖丁酸梭状芽胞杆菌ATCC27021株及ATCC27021δptb1株(参考日本特开2014-207885的实施例1)。将破坏载体质粒11757、1269+AatII的靶向序列等示于表1。[表1]破坏载体质粒11757、1269+AatII的概况a)括号中的数字表示序列号b)pta基因的核苷酸序列参考序列号2方法作为前培养，将糖丁酸梭状芽胞杆菌ATCC27021株及ATCC27021δptb1株的丙三醇储备液0.5mL接种于TYA培养基5mL，于30℃培养24小时。将TYA培养基的组成示于表2。[表2]TYA培养基组成葡萄糖40g酵母提取物2g植物蛋白胨6gCH3COONH43gKH2PO40.5gMgSO4·7H2O0.3gFeSO4·7H2O0.01g蒸馏水1L将该前培养液以OD＝0.1的方式接种于TYA培养基10mL，利用15mL容积Falcon管于37℃进行培养。在到达OD＝0.6的阶段离心分离发酵液而除去上清，添加经置于冰冷却的65mMMOPS缓冲液(pH6.5)10mL，通过吹打而再悬浮，进行离心分离。将基于MOPS缓冲液的洗涤重复2次。通过离心分离除去MOPS缓冲液后，将菌体粒再悬浮于经置于冰冷却的0.3M蔗糖100μL中，制成了感受态细胞。将感受态细胞50μL取于Eppendorf管，与质粒1μg混合。置入经冰冷却的电穿孔用室，于Exponentialdcay模式、2.5kV/cm、25μF、350Ω施加电压。使用的电穿孔装置为Genepulserxcell(Bio-rad)。之后将全部量接种于5mLTYA培养基，于30℃恢复培养2小时左右。之后，将恢复培养液涂布至含有红霉素10ppm的MASS固体培养基，于30℃进行数天培养，从出现的菌落进行选择，获得导入了质粒的红霉素抗性的株。下面进行确认了得到的株中保持有质粒。每各4菌落，接种细菌至含有红霉素10ppm的TYA培养基，以源自生长的转化体菌落的培养液为模板，利用PCR而扩增质粒特有的区域，从基于电泳的扩增物质的分析确认了有无质粒保持。结果全部得到了质粒特有的区域的扩增物质。因此可知，在丁醇发酵细菌内保持有破坏载体质粒。(3)使用破坏载体质粒的糖丁酸梭状芽胞杆菌的pta基因序列转变使用破坏载体质粒进行了丁醇发酵细菌的pta基因的DNA序列转变。由于破坏载体质粒不具有对破坏工具的控制机构，单纯仅以传代的方式发挥功能。方法将作为上述(2)中制作的11757保持株的11757/ATCC27021δptb1株、作为1269+AatII保持株的1269+AatII/ATCC27021δptb1及1269+AatII/ATCC27021株，接种细菌至含有红霉素10ppm的TYA培养基进行培养后，稀释涂布于含有红霉素10ppm的TYA固体培养基，形成了单一菌落。在11757/ATCC27021δptb1株及1269+AatII/ATCC27021株中取该单一菌落8个菌落，1269+AatII/ATCC27021δptb1中取该单一菌落16个菌落，以其为模板进行了基因组上的pta基因全长的扩增。PCR组成(1样品份)2×KODFXbuffer25μL2mMdNTPS10μL20μmF引物0.75μL(NS-150414-i02)20μmR引物0.75μL(NS-150304-i04)D.W.11.5μLKODFX1μLNS-150414-i02的序列5’-GCCCTTTATGAAAGGGATTATATTCAG-3’(序列号7)NS-150304-i04的序列5’-GCTTGTACAGCAGTTAATGCAAC-3’(序列号8)每份分注49μL之后，作为模板加入单一菌落的悬浊液1μL，以下述条件进行PCR。94℃2min98℃10sec→50℃30sec→68℃2min×30个循环10℃保持接着将PCR产物利用Wizard(注册商标)SVGelandPCRClean-UpSystem进行纯化，以该纯化物为模板进行了测序反应。测序反应组成(1样品份)TerminatorReadyReactionMix1μL5×Sequencingbuffer3.5μL3.2pmol引物1μL模板DNA0.35μLD.W.14.15μL模板DNA和引物为下述的组合。1269+AatII保持株F侧NS-150414-i02/R侧NS-150304-i0411753保持株F侧NS-150525-i01/R侧NS-150304-i04NS-150525-i01的序列5’-GGTGTTACAGGAAATGTTGCAG-3’(序列号9)将上述组合物以下述条件进行PCR。96℃1min96℃10sec→50℃5sec→60℃4min×25个循环10℃保持反应结束后，反应物质的序列通过DNA测序仪ABIPRISM3101进行了分析。结果在源自11757/ATCC27021δptb1的菌落的序列分析结果中，将pta基因的DNA序列的第916～935位示于表3。[表3]源自11757/ATCC27021Δptb1的菌落的序列分析结果a)括号中的数字表示序列号。该结果为使序列可以分析的8株全部导入了某些突变。由该结果确认了：载体质粒11757对于糖丁酸梭状芽胞杆菌作为破坏工具质粒起作用。作为突变导入的位置，c.932G>A(pta基因的第932位的碱基G修饰为A)突变株为6株、c.934G>A为1株、c.932G>A、c.934G>A及c.935G>A的突变株为1株。由于c.932G>A的突变，作为PTA蛋白质，第311位的氨基酸精氨酸(以AGA编码)变为赖氨酸(以AAA编码)，同样地由于c.934G>A及c.935G>A的突变而变为G312K。尤其是R311被推定为PTA的活性中心，期待由于c.932G>A的突变而大幅降低酶活性。下面在源自1269+AatII/ATCC27021及1269+AatII/ATCC27021δptb1菌落的序列分析结果中，将pta基因的DNA序列的第6～30位的结果分别示于表4及5。[表4]源自1269+AatII/ATCC27021的菌落的序列分析结果a)括号中的数字表示序列号。[表5]源自1269+AatII/ATCC27021Δptb1的菌落的序列分析结果a)括号中的数字表示序列号。在序列可以分析的22株中的21株中导入了某些的突变。由该结果确认了：1269+AatII对于糖丁酸梭状芽胞杆菌作为破坏工具质粒起作用。作为突变导入的位置，在导入了突变的株中全部pta基因第25位的G改变为A，除此之外，具有c.24G>A或c.28G>A的突变的株也存在多个。由于c.24G>A的突变导入，作为PTA蛋白质，第8位的氨基酸色氨酸(以UGG编码)改变为终止密码子(以UGA编码)，期待蛋白质合成在此终止，因此使功能丧失。实施例2谷氨酸棒状杆菌中的基因修饰(1)穿梭载体的制作利用WO2007/013695的实施例1中记载的方法，获得了源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13058株的pCG100质粒。为了进行与pHSG398的连接，利用限制酶BglII切割处理pCG100，pHSG398利用BamHI进行切割，进行脱磷酸化处理使得不发生自连接。连接pCG100(利用BglII切割)和pHSG398(利用BamHI切割)，导入大肠杆菌。(2)pknG基因修饰质粒的制作在修饰CRISPR的DNA片段(序列号18的HindIII-XhoI约6kbp片段)的两末端添加PstI位点，使其插入pCG100-pHSG398质粒利用PstI所切割的位置，制作成在谷氨酸棒状杆菌中起作用的修饰CRISPR质粒。设计用于修饰谷氨酸棒状杆菌的pknG基因(序列号19及20)的靶向序列(表6)，其中将No.6、7、8及10插入至该修饰CRISPR质粒的靶向序列插入位点(n20)(序列号18的核苷酸编号8773-8492)，制作成pknG基因修饰质粒。[表6]X：终止密码子a)括号中的数字表示序列号。(3)pknG基因修饰质粒向谷氨酸棒状杆菌的导入和基因修饰的确认利用WO2007/013695的实施例2中记载的方法，向谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株导入了(2)中制作成的pknG基因修饰质粒。转化后利用LBCm60ppm琼脂培养基形成了菌落。将该菌落接种至LBCm60ppm液体培养基，进行2次传代培养后，稀释而利用LB琼脂培养基形成了菌落。生长的菌落利用LB培养基进行培养，使用下述引物利用PCR而扩增pknG基因片段，分析该序列时，确认了在推测的位置导入了终止密码子。PCR引物Fatgaaggataatgaagatttcgatccagattcac(序列号41)PCR引物Rgaaccaactcagtggccgc(序列号42)(4)其它pknG基因修饰质粒向谷氨酸棒状杆菌的导入和基因修饰的确认另外，制作了将表6中记载的其它靶向序列插入至上述(2)的修饰CRISPR质粒的靶向序列插入位点而成的pknG基因修饰质粒，利用与上述(3)同样的方法转化了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株，形成了菌落。利用生长的菌落LB培养基进行培养，使用下述引物利用PCR而扩增pknG基因片段，分析该序列时，在使用了No.2的靶向序列的情况下，第203位的C改变为T，虽然没有形成终止密码子，但可以得到编码的氨基酸从苏氨酸改变为异亮氨酸的株。PCR引物Fcagcaaccgaagctgttgcc(序列号72)PCR引物Rgccatcagcaactgggcg(序列号73)实施例3桥石短芽孢杆菌中的基因修饰(1)emp基因修饰质粒的制作将桥石短芽孢杆菌能够使用的pBIC1质粒利用限制酶XhoI和HindIII切割，在其之间插入必要的修饰CRISPR的DNA片段(上述的序列号18的HindIII-XhoI约6kbp片段)，制作成对转化桥石短芽孢杆菌起作用的修饰CRISPR质粒。设计用于修饰桥石短芽孢杆菌的emp基因(序列号43及44)的靶向序列(表7)，其中将No.5、6及7插入至该修饰CRISPR质粒的靶向序列插入位点(n20)(序列号18的核苷酸编号8773-8792)，制作成emp基因修饰质粒。[表7]X：终止密码子a)括号中的数字表示序列号。(2)emp基因修饰质粒向桥石短芽孢杆菌的导入和基因修饰的确认桥石短芽孢杆菌的转化基于TAKARABrevibacillusExpressionsystemHB300进行。转化后，在MTNm50ppm板中形成了菌落。将菌落接种至MTNm50ppm液体培养基，进行2次传代培养后，稀释而利用MT板形成了菌落。培养基MTNm板向MT培养基添加新霉素并使其成为50ppmMT培养基葡萄糖10g/L植物蛋白胨10g/LEhrlichBonito提取物5g/L粉末酵母提取物S2g/LFeSO4·7H2O10mg/LMnSO4·4H2O10mg/LZnSO4·7H2O1mg/L调节至pH7.0生长的菌落利用MT液体培养基进行培养，使用下述引物利用PCR而扩增emp基因片段，分析该序列时，可确认成为终止密码子的导入的修饰。PCR引物Fgggacatgattcgccggttg(序列号59)PCR引物Rgcgtccatcgtagtaccagatc(序列号60)(3)其它rmp基因修饰质粒向桥石短芽孢杆菌的导入和基因修饰的确认另外，制作了表7中记载的其它靶向序列插入至上述(1)的修饰CRISPR质粒的靶向序列插入位点的emp基因修饰质粒，利用与上述(2)同样的方法，转化了桥石短芽孢杆菌，形成了菌落。生长的菌落利用MT液体培养基进行培养，使用下述引物利用PCR而扩增emp基因片段，分析该序列时，在使用了No.3的靶向序列的情况下，454第位的C改变为T，伴随于此，可以得到从谷氨酰胺改变为终止密码子的株。PCR引物Fccggaagccatacaggtaagatc(序列号74)PCR引物Rcctgagtcgacatcaatcacgttc(序列号75)由以上的结果，显示根据本发明的方法，能够不伴随基因的插入、缺失及DSB，而进行广泛的革兰氏阳性菌的基因修饰。实施例4糖丁酸梭状芽胞杆菌中的基因修饰(2)(1)多个基因破坏用宿主的制作使用作为实施例1(2)中制作的11757保持株的11757/ATCC27021，进行了ATCC27021株的pta基因的DNA序列转变。接着，为了制作多个基因被破坏的株，从得到的突变株R311K(pta基因的第932位的碱基G修饰为A)及G312R(pta基因的第934位的碱基G修饰为A)除去质粒11757。方法使用作为实施例1(2)中制作的11757保持株的11757/ATCC27021，利用与实施例1(3)同样的方法进行了pta基因的DNA序列转变及序列分析。将得到序列分析的结果的突变株R311K(pta基因的第932位的碱基G修饰为A)及G312R(pta基因的第934位的碱基G修饰为A)株，利用不含有抗生素的TYA培养基进行培养后，稀释涂布于固态培养基，以生长的单一菌落作为模板，利用实施例1(2)示出的方法确认有无质粒保持，选择没有质粒特有的区域的扩增物质的菌落。PCR组成(1样品份)2×KODFXbuffer25μL2mMdNTPS10μL20μmF引物0.75μL(NS-150410-i01)20μmR引物0.75μL(NS-150410-i02)D.W.11.5μLKODFX1μLNS-150410-i01的序列5’-CCGATAGCTAAGCCTATTGAG-3’(序列号61)NS-150410-i02的序列5’-TCATCCTGTGGAGCTTAGTAG-3’(序列号62)每份分注49μL之后，作为模板加入单一菌落的悬浊液1μL，以下述条件进行PCR。94℃2min98℃10sec→50℃30sec→68℃2min×30个循环10℃保持？结果电泳得到的PCR产物，将源自各突变株(R311K及G312R)的没有质粒特有的区域的扩增物质的菌落，分别制成了11757脱落株ATCC27021R311K及ATCC27021G312R。(2)破坏载体质粒向糖丁酸梭状芽胞杆菌的导入将实施例1(1)中制作的破坏载体质粒的靶向序列部分[序列号4表示的核苷酸序列中n20的部分(核苷酸编号5560-5579)；相当于图1的“靶”]，替换成与糖丁酸梭状芽胞杆菌的ptb1基因(序列号63及64)内的各靶核苷酸序列互补的序列，构建了4种ptb1破坏载体质粒64G>A、655G>A、442C>T及745G>A。将这些破坏载体质粒的靶向序列等示于表8。[表8]破坏载体质粒64G>A、442C>T、655G>A、745G>A的概况a)括号中的数字表示序列号。b)ptb1基因的核苷酸序列参考序列号63对64G>A而言，向靶基因ptb1导入了64G>A和/或66G>A和/或67G>A的突变，在氨基酸水平中导入V22I或V22和/或A23T的突变。442C>T为使P148突变为L或S的破坏载体。已知脯氨酸为亚氨基酸且使蛋白质的自由度局部性降低，通过将其变化为亮氨酸而使结构的保持变困难，期待活性的降低或者消失。655G>A、745G>A分别为将A219突变为T、将A249突变为T的破坏载体。通过将非极性且侧基团小的丙氨酸突变-为极性且具有体积大的侧基团的苏氨酸，PTB1蛋白质的结构发生变化，期待活性的降低或者消失。745G>A还可以导入751G>A的突变(V251突变为I)。方法利用上述ptb1破坏载体质粒64G>A、442C>T、655G>A或745G>A，将糖丁酸梭状芽胞杆菌ATCC27021株以及上述(1)中制作的ATCC27021R311K及ATCC27021G312株进行转化。破坏载体质粒的导入和质粒保持的确认，以实施例1(2)示出的方法进行。结果以得到的株为模板进行的质粒保持确认PCR的结果，在全部宿主中可得到质粒特有的区域的扩增物质，确认了转化体。(3)使用了破坏载体质粒的糖丁酸梭状芽胞杆菌ptb1基因序列转变使用破坏载体质粒进行了丁醇发酵细菌的ptb1基因的DNA序列转变。方法将作为上述(2)中制作的64G>A保持株的64G>A/ATCC27021株、64G>A/ATCC27021R312K株及64G>A/ATCC27021G312株、作为442C>T保持株的442C>T/ATCC27021株、442C>T/ATCC27021R311K株及442C>T/ATCC27021G312株、作为655G>A保持株的655G>A/ATCC27021株、655G>A/ATCC27021R311K株及655G>A/ATCC27021G312R株、作为745G>A保持株的745G>A/ATCC27021株、745G>A/ATCC27021R311K株及745G>A/ATCC27021G312R株，接种细菌至含有红霉素10ppm的TYA培养基进行培养后，稀释涂布于含有红霉素10ppm的TYA固体培养基，形成单一菌落。取该单一菌落，以其为模板进行了基因组上的ptb1基因全长的扩增。PCR组成、条件按照实施例1(3)，仅引物使用了ptb1用的NS-150819-i01及NS-150819-i02。NS-150819-i01的序列5’-GCAAGAAATGAGCAAAAACTTTGACG-3’(序列号69)NS-150819-i02的序列5’-GCTGCAACTAATGCTGCTAAAGC-3’(序列号70)接着将PCR产物利用Wizard(注册商标)SVGelandPCRClean-UpSystem进行纯化，以纯化物为模板进行了测序反应。测序反应组成、条件按照实施例1(3)，仅引物对于64G>A保持株使用了NS-150819-i01(序列号69)，对其他株使用了NS-150324-i01。NS-150324-i01的序列5’-CTCTGACTGTGCAGTTAACC-3’(序列号71)结果源自64G>A保持株的菌落的序列分析的结果，得到了在ptb1基因内具有64G>A和/或67G>A的突变导入的株。得到了通过64G>A和/或67G>A的突变，作为PTB1蛋白质变为V22I和/或A23T的株。在这次的分析中没有导入了V22M突变的株。源自442C>T保持株的菌落的序列分析的结果，得到了具有442C>T和/或443C>T的突变导入的株。得到了通过442C>T和/或443C>T的突变，作为PTB1蛋白质变为P148L或P148S的株。源自655G>A保持株的菌落的序列分析的结果，得到了具有655G>A的突变导入的株。得到了通过655G>A的突变，作为PTB1蛋白质变为A219T的株。源自745G>A保持株的菌落的序列分析的结果，得到了具有745G>A和/或751G>A的突变导入的株。得到了通过745G>A和/或751G>A的突变，作为PTB1蛋白质变为A249T和/或V251I的株。工业实用性根据本发明，可以不伴随外来DNA的插入也不伴随DNA双链切割，安全地向任意革兰氏阳性菌导入部位特异性的突变。由于认为这样得到的基因修饰株不符合基因重组微生物，所以在使用了革兰氏阳性菌的工业性发酵生产中，可以期待设备费用、废弃物质处理费用的减少，在能够削减制造成本的方面极其有用。本申请基于2015年9月9日在日本提交的日本特愿2015-178022，通过引用将其内容全部并入本说明书。序列表<110>国立大学法人神户大学(NATIONALUNIVERSITYCORPORATIONKOBEUNIVERSITY)株式会社日本触媒(NIPPONSHOKUBAICO.,LTD.)<120>用于特异性转变靶向DNA序列的核酸碱基的革兰氏阳性菌的基因组序列的转变方法、及其使用的分子复合体<130>092525<150>JP2015-178022<151>2015-09-09<160>75<170>PatentInversion3.5<210>1<211>83<212>DNA<213>化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)<400>1gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagt60ggcaccgagtcggtggtgctttt83<210>2<211>1002<212>DNA<213>糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)<220><221>CDS<222>(1)..(1002)<400>2atggaccttatgaaaaaaatatgggcagcagctcaatctgataaaaga48MetAspLeuMetLysLysIleTrpAlaAlaAlaGlnSerAspLysArg151015agaatcgttcttccggagggaaatgaagaaagaaatattgaggctgca96ArgIleValLeuProGluGlyAsnGluGluArgAsnIleGluAlaAla202530ggaaaaatacaagaattaggactagcatatccaattttaattggtggg144GlyLysIleGlnGluLeuGlyLeuAlaTyrProIleLeuIleGlyGly354045aaagacgaaatagaagctaaagcaaaggaattggatgtagacttatct192LysAspGluIleGluAlaLysAlaLysGluLeuAspValAspLeuSer505560ggaattgaaattatagatccagagaaatcggaaaacttaaacaagtat240GlyIleGluIleIleAspProGluLysSerGluAsnLeuAsnLysTyr65707580attacagccttttatgaattaagaaaaagtaaaggcgtaactatggaa288IleThrAlaPheTyrGluLeuArgLysSerLysGlyValThrMetGlu859095aaggctgataaaattgtaagagatcctctatatttcgctacaatgatg336LysAlaAspLysIleValArgAspProLeuTyrPheAlaThrMetMet100105110gttaaactagatgatgcagatggaatggtatctggagcagttcataca384ValLysLeuAspAspAlaAspGlyMetValSerGlyAlaValHisThr115120125actggagatttattaagaccaggattacaaataataaagacagcacca432ThrGlyAspLeuLeuArgProGlyLeuGlnIleIleLysThrAlaPro130135140ggtgtatctgtagtttcaagtttctttataatgcaagtgccaggatct480GlyValSerValValSerSerPhePheIleMetGlnValProGlySer145150155160acttatggagaacaaggaactcttatattctctgactgtgcagttaac528ThrTyrGlyGluGlnGlyThrLeuIlePheSerAspCysAlaValAsn165170175ccaaatccaaatgaagaccaattagccgctattgctattgcaacggct576ProAsnProAsnGluAspGlnLeuAlaAlaIleAlaIleAlaThrAla180185190gaaacagcaaagagattatgtaacatggatcctaaagtagcaatgctg624GluThrAlaLysArgLeuCysAsnMetAspProLysValAlaMetLeu195200205tcattctccacaatgggaagtgcagataatgaattggttgataaagtt672SerPheSerThrMetGlySerAlaAspAsnGluLeuValAspLysVal210215220agaaatgcaacacaaaaagcaaaagaaatgagaccagatttagatatt720ArgAsnAlaThrGlnLysAlaLysGluMetArgProAspLeuAspIle225230235240gatggtgaacttcaattagatgcagcaattgttaaaaaagtagctgat768AspGlyGluLeuGlnLeuAspAlaAlaIleValLysLysValAlaAsp245250255caaaaggcaccaaatagtaaagtagcaggaaaagctaatgttttagta816GlnLysAlaProAsnSerLysValAlaGlyLysAlaAsnValLeuVal260265270ttcccagatttacaagctggaaacataggttataaattagtccaaaga864PheProAspLeuGlnAlaGlyAsnIleGlyTyrLysLeuValGlnArg275280285tttgcaaatgcagaagctattgggcctatttgtcaaggctttgataaa912PheAlaAsnAlaGluAlaIleGlyProIleCysGlnGlyPheAspLys290295300ccaataaatgatttatcaagaggatgtagttcagatgatatcgtaaat960ProIleAsnAspLeuSerArgGlyCysSerSerAspAspIleValAsn305310315320gttgttgcattaactgctgtacaagcgcaaaacaataaatag1002ValValAlaLeuThrAlaValGlnAlaGlnAsnAsnLys325330<210>3<211>333<212>PRT<213>糖丁酸梭状芽胞杆菌<400>3MetAspLeuMetLysLysIleTrpAlaAlaAlaGlnSerAspLysArg151015ArgIleValLeuProGluGlyAsnGluGluArgAsnIleGluAlaAla202530GlyLysIleGlnGluLeuGlyLeuAlaTyrProIleLeuIleGlyGly354045LysAspGluIleGluAlaLysAlaLysGluLeuAspValAspLeuSer505560GlyIleGluIleIleAspProGluLysSerGluAsnLeuAsnLysTyr65707580IleThrAlaPheTyrGluLeuArgLysSerLysGlyValThrMetGlu859095LysAlaAspLysIleValArgAspProLeuTyrPheAlaThrMetMet100105110ValLysLeuAspAspAlaAspGlyMetValSerGlyAlaValHisThr115120125ThrGlyAspLeuLeuArgProGlyLeuGlnIleIleLysThrAlaPro130135140GlyValSerValValSerSerPhePheIleMetGlnValProGlySer145150155160ThrTyrGlyGluGlnGlyThrLeuIlePheSerAspCysAlaValAsn165170175ProAsnProAsnGluAspGlnLeuAlaAlaIleAlaIleAlaThrAla180185190GluThrAlaLysArgLeuCysAsnMetAspProLysValAlaMetLeu195200205SerPheSerThrMetGlySerAlaAspAsnGluLeuValAspLysVal210215220ArgAsnAlaThrGlnLysAlaLysGluMetArgProAspLeuAspIle225230235240AspGlyGluLeuGlnLeuAspAlaAlaIleValLysLysValAlaAsp245250255GlnLysAlaProAsnSerLysValAlaGlyLysAlaAsnValLeuVal260265270PheProAspLeuGlnAlaGlyAsnIleGlyTyrLysLeuValGlnArg275280285PheAlaAsnAlaGluAlaIleGlyProIleCysGlnGlyPheAspLys290295300ProIleAsnAspLeuSerArgGlyCysSerSerAspAspIleValAsn305310315320ValValAlaLeuThrAlaValGlnAlaGlnAsnAsnLys325330<210>4<211>10558<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向糖丁酸梭状芽胞杆菌的基因的携带dCas9-PmCDA1融合蛋白和嵌合RNA的质粒(PlasmidcarryingdCas9-PmCDA1fusionproteinandchimericRNAtargetingageneofC.saccharoperbutylacetonicum.)<220><221>misc_feature<222>(174)..(179)<223>KpnI位点<220><221>misc_feature<222>(250)..(879)<223>PmCDA1(反义链)<220><221>misc_feature<222>(1243)..(5346)<223>dCas9(反义链)<220><221>misc_feature<222>(5560)..(5579)<223>靶向序列插入位点<220><221>misc_feature<222>(6083)..(6088)<223>BamHI位点<400>4atcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctctt60cgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgc120cagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtaccc180ggccgcaaacaacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatt240tgatgcctgtcaagtaacagcaggactcttagtggtgtggagtatttttacctgaatcat300aatggacaactcgctccgtcgtttttcagctcgcttcaaagtcttctcaagccatctatt360ctcattcaattgattgtgcgacgattggatgaatattttcctgcaacattggtagtgttc420acttaccattacattcaacccaaccccgttatctctgaggttccacagcccaatttgatt480cctcgcatttttctcgtaatagagtttgcaagcccagattttcaaagtgtggccgttccc540ccgcagctcctggttataccattctaagatcttttcagcgcaatctgcacaaggactcca600ggatgagtaccaatttatcgtgaattgtccggggttgtcgcgcaggtattcttcgacttt660tctaatgctaaagatttcggcgtgaatgccacgttctgtcccgctctgtggtttattcac720agcatagccccaaaaacacgctctacgttcaccccgtcgttttaattcaaagagaacgta780gcatctatgcgacacggattttttgttgttgaaaaactgtttcttaaacgtgtagatgtc840caacttctcatggattctca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