本发明涉及牛血清组合物和通过使用所述牛血清组合物作为添加剂培养细胞的方法。[
背景技术：
：]已知向培养基中加入牛血清对于培养细胞的增殖是有效的。特别地，胎牛血清含有许多包括生长因子在内的体液因子，并已成为细胞培养的标准。然而，由于牛海绵状脑病(bse)的问题，在大洋洲(除了发生bse的那些国家之外的国家)生产的胎牛血清被广泛使用，因此导致价格飞涨。尽管不是来源于胎儿的成年牛血清也可以用于细胞培养，但已知成年牛血清不像胎牛血清那样含有那么多包括生长因子在内的体液因子。另一方面，据报道，加入富血小板血浆(prp)的培养基可用于细胞的培养和增殖，所述富血小板血浆(prp)通过在抗凝处理后对人全血进行离心等将血小板浓缩至高浓度制备(非专利文件1)。富血小板血浆含有大量的血小板衍生的转化生长因子-β(tgf-β)、血小板衍生的生长因子-bb(pdgf-bb)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、表皮生长因子(egf)等，其诱导细胞增殖(非专利文件2)。除了上述生长因子之外，血小板还含有称为血小板因子4(pf4)的嗜中性粒细胞和单核细胞的趋化因子，并诱导白细胞的活化(非专利文件3)。除了血小板之外，全血中含有的血细胞组分还包含白细胞。白细胞分泌血小板活化因子(paf)以及白细胞介素、干扰素和集落刺激因子，并且已知paf活化血小板(非专利文件4)。通过静置、简单离心处理等方法从抗凝人全血中获得白膜层。就人而言，由于白膜层的比重与血浆和红细胞的比重明显不同，所以它是一种含有高浓度血小板以及高浓度白细胞的白色层。因此，其中白膜层内的血小板和白细胞相互活化并且大量包含各种体液因子包括由上述血小板和白细胞分泌的生长因子、趋化因子、活化因子等的血清被认为适用于细胞培养。然而，就牛而言，如下所述，红细胞的比重比人红细胞比重小，并且白细胞的比重和红细胞的比重部分重叠。结果，白膜层含有较少的白细胞并形成模糊层。因此，为了回收白细胞和血小板二者，还必须收获比重比白膜层比重大的级分(就牛而言=含有白细胞的级分)，如本发明所阐明的。近年来，已期望将细胞制剂作为再生医学产品的治疗应用。另一方面，已报道了静脉内施用例如通常不存在的细胞诱导血液凝固(非专利文件5)。因此，实现再生医学很重要的是建立不太可能诱导血液凝固的细胞培养方法。专利文件1描述了含有凝固脐带血的液体组分的增殖刺激剂。所述刺激剂促进间充质干细胞的增殖。在专利文件1中，向未凝固的脐带血中添加红细胞沉降剂，以将血液分离为含有红细胞的级分和上清液级分。将上清液级分分离成含有造血干细胞的沉淀级分和含有血小板的液体级分。然后，使含有血小板的液体级分与玻璃珠接触以产生增殖刺激剂。也就是说，增殖刺激剂不含有其中存在白细胞和造血干细胞的沉淀级分。另一方面，如下所述，本发明提供了血清组分，其通过下列方式获得：在给定温度下激活白膜层中白细胞和血小板的相互作用达不少于给定的时间，并进行包含所得体液组分的血液组分的再凝固处理。因此，本发明与专利文件1中描述的发明完全不同。专利文件2描述了一种通过从含有抗凝剂的血液中除去富血小板血浆和材料组分并将由玻璃材料组成的吸附部件供给到所得血浆中以通过吸附除去血浆中的纤维蛋白原从而分离血清的方法。在专利文件2中，利用纤维蛋白原附着于玻璃材料的表面，使用玻璃材料作为吸附材料以除去血浆中的纤维蛋白原。在本发明中，如下所述，加入玻璃材料以进一步激活白膜层中白细胞和血小板的相互作用。因此，本发明与专利文件2中描述的发明完全不同。在专利文件3中，通过下列方式获得浓缩血清：在凝固前离心收集的人血而不添加抗凝剂，从上清液中除去80％的血浆，将包含血小板的剩余血液组分充分悬浮并添加玻璃珠作为血液凝固促进材料以活化血小板，凝固血液并从前述血小板释放生长因子。另外，在专利文件4中，将抗凝剂添加到收集的人血中，将血液离心，除去上清液中的80％血浆，将包含血小板的剩余血液组分充分悬浮，添加氯化钙水溶液作为血液凝固促进材料以活化血小板并凝固血液，同时从前述血小板释放生长因子，从而获得浓缩血清。在本发明中，如下所述，在加入了抗凝剂的牛血中，通过下列方式获得血清组分：收集比重范围相对宽的级分(包含白膜层)和比重比白膜层比重大的级分(包含白细胞，就牛而言)，在给定的温度下激活白细胞和血小板的相互作用达不少于给定的时间，并且进行包含所得体液组分的血液组分的再凝固处理。因此，本发明与专利文件3和4中描述的发明完全不同。[文件列表][专利文件]专利文件1:jp-a-2011-160799专利文件2:jp-a-2006-104106专利文件3:jp-a-2014-118362专利文件4:jp-a-2014-117347[非专利文件]非专利文件1:tissueengpartcmethods.2009sep;15(3):431-5.非专利文件2:plastreconstrsurg.2004;114:1502-1508.非专利文件3:procnatlacadsciusa.1981jul;78(7):4584-7.非专利文件4:nature.1974jun7;249(457):581-2.非专利文件5:biochembiophysrescommun.2013feb8;431(2):203-9。[发明概述][本发明要解决的问题]本发明提供了一种生产牛血清组合物的非常规方法，具体而言，本发明的目的在于提供一种经济的牛血清组合物的制备方法，所述牛血清组合物含有许多可用于细胞增殖的因子和许多抑制细胞凝固血液的因子。[解决问题的方式]本发明的牛血清组合物的制备方法独特地包括：用抗凝剂进行牛全血的抗凝处理的步骤，从抗凝牛全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分的步骤，以及在给定的温度下激活获得的白细胞和血小板之间的相互作用达不少于给定的时间以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，并用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理的步骤。[发明效果]通过本发明的牛血清组合物的制备方法获得的牛血清组合物是经济的并含有许多细胞生长因子。根据本发明，例如，可以从牛全血制备具有与胎牛血清相当或更高的增殖促进作用的血清组合物。胎牛血清通过杀死胎儿获得。因此，考虑到窗口期(其间通过进行测试无法确认感染的空白期)，不能在之后进行感染的血液测试。但是，例如，就在种牛中窗口期为3个月的感染而言，通过在血清组合物制造后3个月进行血液测试，可以完全排除感染，由此可以获得安全性高的血清组合物。因此，通过本发明获得的牛血清组合物在低成本，安全性和细胞生长增强方面等同于或高于胎牛血清。而且，它不容易诱导细胞凝固血液。通过本发明获得的牛血清组合物作为细胞培养用添加剂非常优异。[附图简述]图1显示了人的各血液组分的比重。图2显示了牛和人的抗凝全血的离心结果。图3显示了在各比重下牛抗凝全血的离心结果。图4显示了牛抗凝全血的连续离心的结果。图5显示了来源于人骨髓的间充质干细胞的细胞增殖曲线。图6显示了来源于人羊膜的间充质干细胞的细胞增殖曲线。[实施方案描述](血清组合物的制备方法)下面参照附图具体解释本发明的实施方案。该实施方案旨在便于理解本发明的原理。本发明的范围不限于以下的实施方案，其中本领域技术人员适当地替换以下实施方案的组成的其他实施方案也包含在本发明的范围内。该实施方案的牛血清组合物通过以下方式获得：(i)抗凝处理步骤：用抗凝剂处理牛全血，(ii)白细胞和血小板获得步骤：从抗凝全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分，以及(iii)白细胞和血小板活化和再凝固处理步骤：在给定的温度下激活获得的白细胞和血小板的相互作用达不少于给定的时间，任选地添加或放置玻璃材料以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，以及用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理。下面解释每一步。(i)抗凝处理步骤全血来源于牛，并且任何成年牛、青少年牛、新生牛和胎牛都适用。通过将针插入血管中，可以将全血从针通过管收集到血液收集袋等中。全血由血细胞组分(红细胞、白细胞、血小板)和作为液体组分的血浆组成。虽然血浆含有凝固组分，但血清中即使有也几乎不含凝固组分或少量的液体。在收集牛全血期间或之后进行使用抗凝剂的抗凝处理。这目的在于从全血获得白膜层时防止血液凝固，如下所述，因为血液含有凝血因子例如纤维蛋白原(凝血因子i)、凝血酶原(凝血因子ii)、凝血因子v、凝血因子viii等。抗凝剂没有特别限制，例如可以提及柠檬酸钠、柠檬酸、肝素等。(ii)白细胞和血小板获得步骤例如，通过离心机或连续离心机从抗凝牛全血中获得白细胞和血小板。白膜层是当离心未凝固的血液时在红细胞层和血浆之间形成的白细胞和血小板层。然而，就牛而言，如下所述，红细胞比重比人红细胞比重小，并且白细胞比重和红细胞比重部分重叠。结果，白膜层含有较少的白细胞并形成模糊层。因此，为了回收白细胞和血小板二者，还必须收获比重比白膜层比重大的级分(就牛而言=含有白细胞的级分)，如本发明所阐明的。如下所述，牛血小板的比重例如为1.032-1.058，牛白细胞的比重例如为1.032-1.084，牛红细胞的比重例如为1.071-1.110。因此，就牛全血而言，存在于红细胞层和血浆之间的白膜层具有1.032-1.071的比重。由于该层含有较少的白细胞，因此也获得比重比白膜层比重大(例如1.071-1.084)的级分。因此，通过例如离心机或连续离心机从抗凝牛全血中除去血浆和具有大比重的红细胞，来制备含有大量白细胞以及血小板的血浆。在这样的调整中，在人中，各血液组分的比重存在明显的差异(参见下表1和图1)，基于该差异，容易通过长时间静置或简单的离心操作分离各血液组分，并且可以容易地获得漂浮在红细胞和血浆之间并含有大量白细胞和血小板的白膜层。表1比重血浆1.025-1.029血小板1.032白细胞1.063-1.085红细胞1.090-1.120另一方面，就各种血液组分之间比重差异小的牛而言，通过与人类似的操作仅回收白细胞和血小板是困难的。例如，就牛而言，如下所述，红细胞和白细胞的比重范围在许多部分重叠，并且它们难以分离。但是，即使在血液组分之间的比重差异很小时，也可以使用能够连续离心更多血液的连续离心机来获得它们。离心条件不受特别限制，例如，离心条件可以为，2900-11760m/s2(300-1200×g)的离心加速度，4-37℃的温度，3min或更长的时间。(iii)白细胞和血小板活化、再凝固处理步骤然后，将获得的含有大量白细胞和血小板的血浆在环境温度至40℃下静置给定时间以促进白细胞和血小板之间的相互作用。如本文所用，环境温度意指10℃至30℃。在这种情况下，通过与玻璃材料等接触进一步激活白细胞和血小板之间的相互作用，并且从白细胞和/或血小板分泌或释放大量体液因子。玻璃材料是具有由钠钙玻璃、铅玻璃、硼硅酸盐玻璃或它们的混合物制成的部件的玻璃。白细胞和血小板与玻璃材料的接触是包括下列的概念：(i)将玻璃材料加入白膜层，(ii)将由玻璃材料形成的玻璃棒加入白膜层并用玻璃棒搅拌白膜层，(iii)将白膜层加入由玻璃材料作为原料形成的玻璃材料容器中。尽管期望活化的温度，时间条件为37℃达1hr或更多，但其可以是例如环境温度至40℃达5min或更多，或者37℃至40℃达1至3hr，另外，38℃至40℃达1至3hr。也可以在活化时间内通过添加再凝固剂同时进行下一个再凝固处理步骤。待添加的玻璃材料的形状不受特别限制，并且例如其可以是粒状材料、片、块等的形状。粒状材料可以是例如标准形状，例如玻璃珠形状、大理石形状、扁平大理石形状、骰子形状、圆柱形状、棱柱形状、中空圆柱形状、圆环形状、泪滴形状、板形状等，或者非标准形状，例如碎玻璃等。优选的是玻璃珠。粒状材料的粒度没有特别限定，例如可以为1-20mm，优选为5-9mm。通过添加玻璃材料在浓度增加后分泌和释放的体液因子包括源自血小板、源自白细胞或源自这两者的那些。血小板衍生的体液因子包括例如tgf-β1、碱性fgf、g-csf、ifn-γ、il-10、il-1ra、il-1b、il-4、il-6、il-8、tnf-α等。白细胞衍生的体液因子包括例如嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、il-12(p70)等。源自血小板和白细胞二者的体液因子包括例如il-5、il-9、ip-10、mcp-1、pdgf-bb等。同时，为了获得作为上清液的血清组分，用再凝固剂对前述包含体液因子的血液组分进行再凝固处理。再凝固剂没有特别限制，可以根据抗凝剂的种类适当确定。例如，可以提及氯化钙、鱼精蛋白等。当抗凝剂是柠檬酸时，再凝固剂优选为例如钙溶液如氯化钙溶液等。当抗凝剂是肝素时，再凝固剂优选为例如鱼精蛋白等。通过前述步骤获得的牛血清组合物含有许多细胞生长因子，并且可以获得具有优异细胞生长增强作用的血清组合物。此外，抑制由所得细胞诱导的血液凝固并且安全性更高。(细胞培养方法)本发明的细胞培养方法包括以下步骤：通过在含有作为添加剂的由本发明的牛血清组合物的制备方法获得的牛血清组合物的培养基中培养细胞来促进细胞增殖和抑制血液凝固诱导。细胞没有特别限制，并且例如是间充质干细胞或间充质细胞，其来源于骨髓、脂肪组织或包括羊膜和脐带的胎儿附属物。细胞的来源没有特别限制，例如可以提及人和啮齿动物、家畜、非人类哺乳动物，例如除人以外的灵长类动物等，等等。含有作为添加剂的牛血清组合物的培养基没有特别限制，并且是例如可用于培养间充质干细胞的培养基。具体而言，例如，可以提及a-最小必需培养基(amem培养基)、dulbecco改良eagle培养基(dmem培养基)等。培养基中牛血清组合物的浓度没有特别限制。包含在血清组合物中的体液因子的浓度可以是例如0.01–20v/v%。每1ml培养基的细胞数可以是例如1000-100000。细胞培养条件没有特别限制，例如，温度为37℃，时间为2-10天。优选地，例如每1至5天用新培养基替换培养基。培养基替换方法例如是每隔给定时间变更培养基的方法，连续或间歇地供应新培养基的方法等。在后一种情况下，例如，当供应新培养基时，优选地将一部分旧培养基连续或间歇地丢弃。[实施例](实施例1)使用血液组分离心机(组分收集系统：ccs，由haemonetics制造)，从抗凝血液收集各种浓度的白细胞和血小板级分，白细胞和血小板相互活化，通过再凝固处理制备血清组合物，并分析其中的体液因子。具体而言，安装用于离心机的专用血液回路(971j，由haemonetics制造)，将抗凝剂acd-溶液a(柠檬酸钠水合物2.20％，柠檬酸水合物0.80％，葡萄糖2.20％，由terumocorporation制造)和供体血液以1:10的比例混合，使用配备至血液回路的离心滚筒(centrifugationbowl)将获得的抗凝血液连续离心，随时间单独收集得到的各种浓度的白细胞和血小板级分。将获得的白细胞和血小板级分(白膜层)应用于自动血细胞计数器(lc-660，由fukudadenshi制造)以测量白细胞和血小板数。结果显示在表2中。表2如表2所示，通过一次使用血液组分离心机可从抗凝血液获得各种浓度的白细胞和血小板级分。向获得的白细胞和血小板级分中加入(有玻璃)或不加入(没有玻璃)玻璃珠(每50ml血液组分一个：bz-6,由asone制造)，进一步加入1m氯化钙水溶液至10mm的最终添加浓度，并将混合物在环境温度下静置不少于1hr。确认凝固后，将混合物以3000rpm离心10min，将上清液(血清组合物)回收并保存于-80℃。解冻血清组合物，通过tgf-β1elisa试剂盒(＃88-8350-22，由affimetrix制造)测量tgf-β1浓度。结果显示在表3中。表3如表3所示，即使没有玻璃，tgf-β1浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现与表2中血小板数的数据高度相关，因此表明血清组合物中的许多tgf-β1来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和tgf-β1浓度的数字几乎相同，这强烈提示tgf-β1来源于血小板。此外，使用bio-plexpro人细胞因子27-plex测定(#m50-0kcaf0y,由bio-rad制造)对血清组合物进行综合细胞因子分析(碱性fgf、嗜酸性粒细胞趋化因子、g-csf、gm-csf、ifn-γ、il-10、il-12(p70)、il-13、il-15、il-17、il-1ra、il-1b、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、ip-10、mcp-1、mip-1a、mip-1b、pdgf-bb、rantes、tnf-α、vegf)(排除gm-csf、il-15、il-17、il-2、mip-1a，因为几乎所有样品都低于检测灵敏度)。结果显示在表4-25中。[表4]如表4所示，当使用玻璃时，碱性fgf浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，在有玻璃的情况下，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的碱性fgf主要来源于血小板。通过比较样品a和c(有玻璃)，血小板计数和碱性fgf的浓度的数字几乎相同，这强烈提示tgf-β1来源于血小板。[表5]如表5所示，即使没有玻璃，嗜酸性粒细胞趋化因子浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现与表2中白细胞数据高度相关，因此提示血清组合物中的嗜酸性粒细胞趋化因子主要来源于白细胞。通过比较样品b和c(有玻璃)，白细胞计数和嗜酸性粒细胞趋化因子浓度的数字几乎相同，这强烈提示嗜酸性粒细胞趋化因子来源于白细胞。[表6]如表6所示，当使用玻璃时，g-csf浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，在有玻璃的情况下，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的g-csf主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和g-csf浓度的数字几乎相同，这强烈提示g-csf来源于血小板。[表7]如表7所示，当使用玻璃时，ifn-γ浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，在有玻璃的情况下，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的ifn-γ主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和ifn-γ浓度的数字几乎相同，这强烈提示ifn-γ来源于血小板。[表8]如表8所示，当使用玻璃时，il-10浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，在有玻璃的情况下，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-10主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-10浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-10来源于血小板。[表9]如表9所示，即使没有玻璃，il-12(p70)浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现与表2中白细胞数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-12(p70)主要来源于白细胞。通过比较样品a和d，白细胞计数和il-12(p70)浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-12(p70)来源于白细胞。[表10]如表10所示，当使用玻璃时，il-13浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，当使用玻璃时，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-13主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-13浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-13来源于血小板。[表11]如表11所示，当使用玻璃时，il-1ra浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例(有玻璃)，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-1ra主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-1ra浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-1ra来源于血小板。[表12]如表12所示，当使用玻璃时，il-1b浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，在有玻璃的情况下，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-1b主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-1b浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-1b来源于血小板。[表13]如表13所示，当使用玻璃时，il-4浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例(有玻璃)，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-4主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-4浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-4来源于血小板。[表14]如表14所示，当使用玻璃时，il-5浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例，发现不论是否使用玻璃，都与表2中的白细胞数和血小板数的数据弱相关。作为趋势，与血小板数密切相关。但是，(1)没有玻璃时，与其他样品相比，样品b显示更高的血小板数和更低的il-5浓度；(2)有玻璃时，样品a和c的比较显示几乎相同的血小板数和样品c中最高的il-5浓度。由此，il-5非常可能来源于白细胞和血小板二者。作为从玻璃使用引起的相互作用推导的基础，观察到下列事实：在样品c中的高白细胞数，和样品c的血小板数与样品a和b的血小板数相等，但是可以指出样品c的il-5浓度(1)没有玻璃时比其他样品小，和(2)有玻璃时比其他样品相对较高。[表15]如表15所示，当使用玻璃时，il-6浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例(有玻璃)，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-6主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-6浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-6来源于血小板。[表16]如表16所示，即使没有玻璃，il-7浓度也是足够的，但当使用玻璃时未显示出浓度的增加。然而，参照与样品a的比例，发现与表2中血小板数的数据相关，因此提示血清组合物中的il-7主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-7浓度的数字几乎相同，这提示il-7来源于血小板。[表17]如表17所示，当使用玻璃时，il-8浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例(有玻璃)，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的il-8主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-8浓度的数字几乎相同，这强烈提示il-8来源于血小板。[表18]如表18所示，即使没有玻璃，il-9浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现不论是否使用玻璃，都与表2中的白细胞数和血小板数的数据弱相关。作为趋势，(1)没有玻璃时，与白细胞数密切相关，但样品b比样品a显示更高的血小板数，样品b的il-9浓度与样品a相等；(2)有玻璃时，与血小板数密切相关，但样品a和b的比较显示几乎相同的血小板数和样品b中最高的il-9浓度。由此，il-9非常可能来源于白细胞和血小板二者。作为从玻璃使用引起的相互作用推导的基础，观察到下列事实：在样品b中的较高白细胞数和最高血小板数，但是可以指出样品b的il-9浓度(1)没有玻璃时小，和(2)有玻璃时最高。[表19]如表19所示，即使没有玻璃，ip-10浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，几乎没有发现与表2中白细胞数和血小板数的数据相关。作为趋势，(1)没有玻璃时，与白细胞数密切相关，但样品d显示一半的血小板数和约80%的ip-10浓度，与样品a相比；(2)有玻璃时，与白细胞数密切相关，但样品b和c的比较显示相等的血小板数和ip-10浓度的差异。由此，ip-10非常可能来源于白细胞和血小板二者。作为从玻璃使用引起的相互作用推导的基础，观察到下列事实：在样品b中的较高白细胞数和最高血小板数，但是可以指出样品b的ip-10浓度(1)没有玻璃时不超过平均值，和(2)有玻璃时最高。[表20]如表20所示，即使没有玻璃，mcp-1浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现不论是否使用玻璃，都与表2中的白细胞数和血小板数的数据弱相关。(1)没有玻璃时，样品d的mcp-1浓度最高，并且没有显示与白细胞数和血小板数相关；(2)有玻璃时，作为趋势，与血小板数密切相关，但样品a和c的比较显示相同的血小板数和mcp-1浓度的25%差异。由此，mcp-1非常可能来源于白细胞和血小板二者。作为从玻璃使用引起的相互作用推导的基础，观察到下列事实：在样品b中的较高白细胞数和最高血小板数，但是可以指出样品b的mcp-1浓度(1)没有玻璃时最低，和(2)有玻璃时最高。[表21]如表21所示，当使用玻璃时，mip-1b浓度未显示浓度增加。然而，参照与样品a的比例，发现与表2中的血小板数的数据相关，因此提示血清组合物中的mip-1b主要来源于白细胞。通过比较样品a和d，白细胞计数和mip-1b浓度的数字几乎相同，这提示mip-1b来源于白细胞。[表22]如表22所示，即使没有玻璃，pdgf-bb浓度也是足够的，但当使用玻璃时显示出浓度的增加。参照与样品a的比例，发现不论是否使用玻璃，都与表2中的白细胞数和血小板数的数据弱相关。(1)没有玻璃时，样品b的pdgf-bb浓度最低，并且没有显示与白细胞数和血小板数相关；(2)有玻璃时，作为趋势，与白细胞数密切相关，但与样品a相比，样品d显示一半的血小板数和相等的pdgf-bb浓度。由此，pdgf-bb非常可能来源于白细胞和血小板二者。作为从玻璃使用引起的相互作用推导的基础，观察到在样品b中的较高白细胞数和最高血小板数，但是可以指出样品b的pdgf-bb浓度(1)没有玻璃时最低，和(2)有玻璃时最高。[表23]如表23所示，当使用玻璃时，rantes浓度未显示浓度增加。参照与样品a的比例，未发现与表2中的白细胞数和血小板数的数据相关。由此，不能排除rantes来源于白细胞和血小板二者的可能性。[表24]如表24所示，当使用玻璃时，tnf-α浓度显示出显著增加。参照与样品a的比例(有玻璃)，发现与表2中的血小板数的数据高度相关，因此提示血清组合物中的tnf-α主要来源于血小板。通过比较样品a和c，血小板计数和il-8浓度的数字几乎相同，这强烈提示tnf-α来源于血小板。[表25]如表25所示，当使用玻璃时，vegf浓度未显示浓度增加。参照与样品a的比例，几乎没有发现与表2中的白细胞数和血小板数的数据相关。没有玻璃时，趋势是与白细胞数密切相关。例如，比较样品a和d时，血小板数和vegf浓度之间没有发现相关性。由此不能排除vegf来源于白细胞和血小板二者的可能性。这些结果总结在表26中。[表26]如表26所示，在含有白细胞和血小板的血细胞组分中添加玻璃珠增强了白细胞和血小板之间的相互作用，并且阐明了许多体液因子被分泌和释放。(实施例2)此外，研究了获得的白细胞和血小板级分的相互活化的温度和时间条件的优化。具体而言，以与实施例1相同的方式安装离心机专用的血液回路(971j，由haemonetics制造)，将抗凝剂acd-溶液a(柠檬酸钠水合物2.20％，柠檬酸水合物0.80％，葡萄糖2.20％，由terumocorporation制造)和供体血液以1:10的比例混合，使用配备至血液回路的离心滚筒(centrifugationbowl)通过连续离心所得抗凝血液来收集白细胞和血小板级分。向获得的白细胞和血小板级分中加入氯化钙水溶液至5mm的最终添加浓度，并将混合物(1)在4℃、20℃、37℃、40℃、50℃的每一条件下静置5分钟，(2)在37℃的条件下静置5mn、1hr、6hr。确认凝固后，将混合物以3000rpm离心10min，将上清液(血清组合物)回收并保存于-80℃。解冻血清组合物，通过tgf-β1elisa试剂盒(#88-8350-22,由affimetrix制造)测量tgf-β1浓度。结果显示在下表中。[表27]温度时间tgf-β1浓度(ng/ml)4℃5min10.520℃5min60.737℃5min67.240℃5min69.850℃5min46.520℃1hr86.937℃1hr92.140℃1hr83.437℃6hr90.2如表27所示，在20℃至40℃的温度下和不少于1hr的时间内tgf-β1浓度高。由以上认为白细胞和血小板级分相互活化的温度和时间条件为环境温度至40℃达不少于1hr。(实施例3)研究了来自抗凝全血的一批白细胞和血小板级分中由于动物物种导致的差异。具体而言，将通过以1:10的比例混合抗凝剂acd-溶液a(柠檬酸钠水合物2.20％，柠檬酸水合物0.80％，葡萄糖2.20％，由terumocorporation制造)与人或牛血得到的抗凝血液(14ml)加入到15ml聚丙烯管(2325-015,由agctechnograssco.ltd.制造)中，在200xg，环境温度下离心(通用冷却离心机5922，由kubotacorporation制造)20min，并且拍摄状态。结果显示在图2中。在图2中，左边显示牛，右边显示人。在正常的离心中，牛被判断为具有较低红细胞比重，且红细胞不容易形成沉淀。人具有高红细胞比重，且红细胞容易形成沉淀。也就是说，在牛中，通过静置或简单的离心操作，红细胞不容易形成沉淀，因此假定相对较轻的白细胞和血小板级分不容易出现。(实施例4)因此，研究了牛中各血液组分的比重。将适当剂量的percoll原液(1.130g/ml,由gehealthcarebioscience制造,17-0891-01)，1.5mnacl和无菌水混合以制备比重为1.123、1.110、1.097、1.084、1.071、1.058、1.045、1.032、1019、1.006的等渗percoll溶液。将这些等渗percoll溶液各3ml加入到15ml聚丙烯管(2325-015,由agctechnograssco.ltd.制造)中。将3ml通过以1:10的比例混合抗凝剂acd-溶液a(柠檬酸钠水合物2.20％，柠檬酸水合物0.80％，葡萄糖2.20％，由terumocorporation制造)与牛血得到的抗凝血液(3ml)叠加在加入了等渗percoll溶液的15ml聚丙烯管(2325-015,由agctechnograssco.ltd.制造)上，在400xg，环境温度下离心(通用冷却离心机5922，由kubotacorporation制造)10min，并拍摄状态。结果显示在图3中。如上所述，发现牛血含有比比重1.071小的许多红细胞，其漂浮在比重为1.071的等渗percoll溶液中。此外，将各管(6ml)分成上部(3ml)和下部(3ml)，通过自动血细胞计数器(procytedx，由idexxlaboratories制造)测量其各自中的血细胞组分。结果显示在表28中。[表28]根据表28的结果，牛的各血细胞组分的比重显示在表29中。[表29]比重牛血小板1.032-1.058牛白细胞1.032-1.084牛红细胞1.071-1.110这样，阐明了基于图2的结果的调查是正确的，即在牛中，因为红细胞具有相对小的比重，因此，通过静置或简单的离心操作，红细胞不容易形成沉淀。此外，阐明了在人中，通过简单的操作就出现了白细胞和血小板级分(所谓的白膜层)，而在牛中，由于白细胞和红细胞的比重范围在很多部分重叠，所以难以通过静置或简单的离心操作分离全部白细胞。(实施例5)因此，针对来自牛全血的白细胞和血小板级分的稳定收集，研究使用连续离心机。具体而言，在血液组分离心机(ccs，由haemonetics制造)上安装专用的血液回路(971j，由haemonetics制造)，将抗凝剂acd-溶液a(柠檬酸钠水合物2.20％，柠檬酸水合物0.80％，葡萄糖2.20％，由terumocorporation制造)和牛全血以1:10的比例混合，使用配备至血液回路的离心滚筒(centrifugationbowl)将获得的抗凝血液连续离心，并拍摄出现的白细胞和血小板级分。结果显示在图4中。如图4所示，在离心滚筒外侧的红细胞和其内侧的血浆之间明显存在描绘白色带状圆圈的白膜层(白细胞和血小板级分)。当使用连续离心机时，一次处理大量血液(>250ml)。因此，假定即使当比重稍有差别时，白膜层也相对容易出现。随时间单独收集出现的白膜层前后的级分(样品1至8，各约5ml)，并且通过自动血细胞计数器(procytedx，由idexxlaboratories制造)测量其各自中的血细胞组分。结果显示在表30中。[表30]证实位于白膜层的样品6是白细胞+血小板级分。还阐明了比重比白膜层比重大的样品6含有最大量的白细胞。因此证实，还需要收集比重比白膜层比重大的级分(就牛而言=含有白细胞)，以从抗凝牛全血中获得许多白细胞和血小板。(实施例6)因此，使用血液组分离心机(ccs，由haemonetics制造)从抗凝牛全血中收集白细胞和血小板级分，通过添加玻璃珠将其激活，通过再凝固处理制备血清组合物(下文的本发明的血清组合物)，并研究了作为针对细胞培养的添加剂的可能性。具体而言，安装离心分离机专用的血液回路(970e,由haemonetics制造)，以1:16的比例混合抗凝剂citramin溶液“fuso”4%(柠檬酸钠水合物4％，由fusopharmaceuticalindustries,ltd.制造)和牛血，通过使用配备至血液回路的离心滚筒(centrifugationbowl)连续离心所得的抗凝血液来收集白细胞和血小板级分。向得到的白细胞和血小板级分中加入玻璃珠(每50ml血液组分一个：bz-6，由asone制造)，进一步加入氯化钙水溶液至5mm的最终添加浓度，将混合物在37℃下静置不少于6hr。确认凝固后，将混合物以3000rpm离心10min，将上清液(血清组合物)回收并保存于-20℃。解冻血清组合物，以10％的比例添加到amem培养基(由lifetechnologies制造,41061)中以得到细胞培养用培养基。作为对照，使用添加有为培养基10％的胎牛血清(由moregatebiotech制造)的amem培养基。为了评价细胞培养用培养基，使用来源于人骨髓的商购间充质干细胞(由lonza制造,pt-2501)和由我们建立的来源于人羊膜的间充质干细胞来绘制增殖曲线。按照以下步骤培养来源于人羊膜的间充质干细胞。即，在35℃下用胶原酶和嗜热菌蛋白酶对通过剖腹产手术获得的羊膜进行酶处理30min，使酶处理的羊膜通过孔径为100μm的网来收集细胞，并培养收集的细胞。胶原酶浓度为500cdu/ml，嗜热菌蛋白酶浓度为400pu/ml。结果分别显示在图5和图6中。如图5和图6所示，在来源于骨髓和羊膜的间充质干细胞的任何培养物中，发现本发明的血清组合物为在细胞生长增强方面更好的血清组合物，与通常用于细胞培养的胎牛血清相比。(实施例7)此外，研究了本发明的血清组合物对细胞直径的影响。以与上述实施例6相同的方式，使用添加有为培养基10%的本发明血清组合物(添加有10％胎牛血清的amem培养基作为对照)的amem培养基培养由我们建立的来源于人羊膜的间充质干细胞，并适当传代。测量每次传代的平均细胞直径(μm)，并检查两者之间的差异。结果显示在表31中。[表31]传代数34567胎牛血清24.317.618.719.225.1本发明的血清组合物18.717.115.318.115.9与胎牛血清相比，来源于人羊膜且在本发明的血清组合物中培养的间充质干细胞显示出每次传代的细胞直径总是小的。在实施例6中，与胎牛血清相比，本发明的血清组合物显示具有强烈的细胞生长增强作用，而细胞分裂前的时间短被认为是原因。(实施例8)在静脉内施用使用培养的间充质干细胞的细胞制剂时，通过施用细胞促进血液凝固常常成为问题。因此，研究了本发明血清组合物中培养的细胞是否诱导血液凝固。以与实施例6和7相同的方式，用盐水将来源于人羊膜并在添加有为培养基10％的本发明血清组合物的amem培养基中培养的间充质干细胞调节至1x105个细胞/ml。作为对照，使用在添加有为培养基10％的胎牛血清的amem培养基中培养的相同细胞。向这些细胞悬液(160μl)中加入人血浆(40μl)，并将混合物在37℃孵育5min。向其中加入20μmcacl2(100μl)，并通过血液凝固自动测量仪(kc1delta,由tcoag制造)测量凝固时间。结果显示在表32中。[表32]凝固时间(秒)胎牛血清24.5本发明的血清组合物44.7±0.5与胎牛血清相比，来源于人羊膜且在本发明血清组合物中培养的间充质干细胞延长了凝固时间。发现他们不容易诱导血液凝固。(实施例9)因此，进行了研究以寻找在本发明血清组合物中培养的细胞不容易诱导血液凝固的原因。使用elisa试剂盒(人tfpiquantikineelisa试剂盒)(dtfp10,r&dsystems)测量在来源于人羊膜(传代数4)并在添加有为培养基10％的本发明血清组合物的amem培养基中培养的间充质干细胞的培养上清液中组织因子途径抑制剂(tfpi)的浓度，所述tfpi是由细胞分泌并与质膜结合的强抗凝因子。作为对照的是在添加有为培养基10％的胎牛血清的amem培养基中培养的相同细胞的培养上清液和细胞培养之前的这些培养基。结果显示在表33中。[表33]与胎牛血清相比，在本发明的血清组合物中培养的来源于人羊膜的间充质干细胞分泌更多的tfpi。因此，发现他们不容易诱导血液凝固。[工业实用性]他们可以用于制备血清组合物。当前第1页12