本申请要求2015年10月8日提交的题为“neuralprecursorcellpopulationsandusesthereof”的美国临时申请62/239,042的优先权，其为了所有目的特此通过引用全文并入。
发明领域
本发明一般涉及细胞生物学、多能干细胞(pluripotentstemcells)和细胞分化的领域。本发明公开了神经前体细胞群体及其治疗用途。
发明背景
在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不得被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下证明，根据可适用的法定条文本文引用的文章和方法不构成现有技术的权利。
中枢和外周神经系统的状况、疾病和损伤的临床管理仍然是显著未满足的临床需求的领域。目前用于包括癫痫病(seizuredisorders)、帕金森病、创伤性脑损伤、疼痛和痉挛的各种紊乱的治疗通常集中于症状的管理，而不是解决该疾病或紊乱的根本原因。因此，仍然对能够修复或替换损害或受损的神经组织的中枢和外周神经系统的改进和有效的治疗存在迫切需要。
本发明通过提供具有在体内迁移并分化成功能性神经元的能力的新型神经前体细胞群体来解决这一需求。
发明概述
提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势将是从下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面明显的。
本发明提供了富集特定神经前体标志物的细胞群体和使用此类细胞群体用于治疗与抑制性神经元功能失调和/或兴奋性/抑制性神经元活性不平衡相关的紊乱的方法。具体地，本发明提供了用作基于细胞的治疗剂的细胞群体，和用于纯化并在移植中使用这些神经前体细胞以改善与异常神经功能相关的神经紊乱的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了神经前体细胞的富集群体，其表达关键因子，这些关键因子指示这些细胞在移植到哺乳动物中后有效地分化成抑制性中间神经元的能力。优选地，神经前体细胞富集表达由皮层中间神经元表达的标志物，皮层中间神经元是主要起源于mge的细胞。本发明的细胞群体可使用包括但不限于以下的方法富集：使用细胞表面标志物分离；使用神经前体中下调的细胞表面标志物消耗细胞群体；和使多能细胞分化以表达神经前体标志物等。
该群体中富集的示例性神经前体细胞标志物包括但不限于：as1、atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、elavl2、ensg00000260391、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gad1、gad2、gng2、gpd1、gria1、gria4、hmp19、ina、kalrn、kdm6b、kif21b、l1cam、lhx6、linc00340、linc00599、maf、mafb、mapt、miat、ncam1、nkx2-1、nmnat2、npas1、nrcam、nrxn3、nxph1、pdzrn4、pip5k1b、pls3、plxna4、rai2、robo1、robo2、rp11-384f7.2、rp4-791m13.3、runx1t1、scg3、scrt1、scrt2、siah3、slc32a1、sox6、srrm4、sst、st8sia5、stmn2、tagln3、tiam1、tmem2、ttc9b或wi2-1896o14.1。
在一些实施方案中，本发明提供了包括能够分化为gaba表达细胞的细胞的神经前体细胞群体，其中该细胞群体包括表达以下一种或更多种神经前体标志物的大多数细胞(50％或更多)：as1、atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、elavl2、ensg00000260391、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gad1、gad2、gng2、gpd1、gria1、gria4、hmp19、ina、kalrn、kdm6b、kif21b、l1cam、lhx6、linc00340、linc00599、maf、mafb、mapt、miat、ncam1、nkx2-1、nmnat2、npas1、nrcam、nrxn3、nxph1、pdzrn4、pip5k1b、pls3、plxna4、rai2、robo1、robo2、rp11-384f7.2、rp4-791m13.3、runx1t1、scg3、scrt1、scrt2、siah3、slc32a1、sox6、srrm4、sst、st8sia5、stmn2、tagln3、tiam1、tmem2、ttc9b或wi2-1896o14.1。在一些方面，神经前体细胞可分化以形成能够在体外产生gaba的神经元。在其他方面，神经前体细胞可分化以形成能够在移植到哺乳动物神经系统(例如，中枢神经系统或cns)后产生gaba的神经元。
本发明的神经前体细胞群体可以从人组织(例如，人胎儿皮层或人神经节隆起(ganglioniceminences))分离，或可以从干细胞或其他多潜能细胞(multipotentcells)分化。因此，在一些实施方案中，神经前体细胞群体从多能干细胞的来源分离。在一些实施方案中，神经前体细胞从人干细胞(例如人胚胎干细胞)分化。在其他实施方案中，神经前体细胞从诱导的多能干细胞分化。在又其他实施方案中，神经前体细胞从神经干细胞分化。在又其他实施方案中，神经前体细胞群体通过细胞的重编程创建，所述细胞例如，从mge、皮层、亚皮层、脑的其他区域获得的神经细胞、或非神经细胞。
因此，在特定的实施方案中，本发明提供了产生神经前体细胞群体的方法，包括在允许细胞增加在神经前体细胞中上调的一种或更多种细胞表面标志物表达的条件下从哺乳动物脑组织分离细胞，并富集表达神经细胞表面标志物的细胞以产生细胞表面标志物富集细胞的群体，其中富集的细胞群体包括在体外和/或在移植入哺乳动物神经系统(例如，cns)后能够形成产生gaba的神经元的神经前体细胞。在优选的实施方案中，细胞表面标志物是atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2。
在其他具体实施方案中，本发明提供了产生神经前体细胞群体的方法，包括提供多能哺乳动物干细胞的群体；在允许细胞增加在感兴趣的神经前体细胞中上调的一种或更多种细胞表面标志物表达的条件下使该干细胞分化；并富集该细胞群体的表达一种或更多种所述细胞表面标志物的细胞；其中富集的细胞群体包括在体外和/或在移植入哺乳动物脑后能够形成产生gaba的神经元的神经前体细胞。优选地，神经前体细胞表面标志物是atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2。
在一些实施方案中，富集的细胞还富集表达第二神经前体细胞标志物。例如，除了用于富集细胞的细胞表面标志物，细胞还可被富集以表达以下一种或更多种：as1、atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、elavl2、ensg00000260391、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gad1、gad2、gng2、gpd1、gria1、gria4、hmp19、ina、kalrn、kdm6b、kif21b、l1cam、lhx6、linc00340、linc00599、maf、mafb、mapt、miat、ncam1、nkx2-1、nmnat2、npas1、nrcam、nrxn3、nxph1、pdzrn4、pip5k1b、pls3、plxna4、rai2、robo1、robo2、rp11-384f7.2、rp4-791m13.3、runx1t1、scg3、scrt1、scrt2、siah3、slc32a1、sox6、srrm4、sst、st8sia5、stmn2、tagln3、tiam1、tmem2、ttc9b或wi2-1896o14.1。
在一些实施方案中，使用选择性地结合神经前体细胞表面标志物的剂(例如，抗体)富集表达细胞表面标志物的细胞。在具体实施方案中，表达神经前体细胞表面标志物的细胞通过荧光激活细胞分选(facs)分离。在其他具体实施方案中，表达神经前体细胞表面标志物的细胞使用磁激活细胞分选(macs)分离。
优选地，神经前体细胞能够形成功能性抑制性中间神经元，这些功能性抑制性中间神经元在移植后整合入哺乳动物的中枢或外周神经系统，并且功能性抑制性神经元的这种形成和整合与神经紊乱的治疗相关。
在另一方面，本发明以用于分离本发明的神经前体细胞群体的方法为特征。方法包括以下步骤：提供来自受试者的组织(例如，来自胎儿哺乳动物脑的组织)或从多能细胞来源分化的细胞，和使用选自以下的一种或更多种不同细胞表面蛋白富集选择的细胞群体：atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2，从而分离神经前体细胞群体。
在另一方面，本发明以用于使用在本发明的神经前体细胞中具有至少两倍抑制的一种或更多种细胞表面蛋白从不需要的细胞消耗分离的细胞群体的方法为特征。例如，神经前体细胞群体可通过使用选自以下的一种或更多种不同细胞表面蛋白消耗细胞群体来富集：atp1a2、bcan、cd271、cd98、cntfr、fgfr3、gja1、mlc1、notch1、notch3、pdpn、ptprz1、slc1a5、tmem158或ttyh1。
此外或可选地，该方法还可包括低温贮藏细胞的步骤。
该方法还可包括在支持细胞增殖的条件下培养神经前体细胞群体。
本发明还以由以上任何方法产生的神经前体细胞群体为特征。
本发明还提供了包括具有在移植到哺乳动物中枢或外周神经系统后分化为功能性抑制性中间神经元的能力的大多数细胞(大于50％)的神经前体细胞群体。
本发明已经鉴定了，表达细胞表面标志物plexina4的细胞在其移植到哺乳动物cns后成熟为功能性皮层中间神经元的能力方面被增强。因此，在某些实施方案中，神经前体细胞群体表达plexina4作为富集的神经前体标志物之一。
在具体实施方案中，本发明提供了神经前体细胞群体，其中该群体富集了包括以下的细胞：as1、atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、elavl2、ensg00000260391、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gad1、gad2、gng2、gpd1、gria1、gria4、hmp19、ina、kalrn、kdm6b、kif21b、l1cam、lhx6、linc00340、linc00599、maf、mafb、mapt、miat、ncam1、nkx2-1、nmnat2、npas1、nrcam、nrxn3、nxph1、pdzrn4、pip5k1b、pls3、plxna4、rai2、robo1、robo2、rp11-384f7.2、rp4-791m13.3、runx1t1、scg3、scrt1、scrt2、siah3、slc32a1、sox6、srrm4、sst、st8sia5、stmn2、tagln3、tiam1、tmem2、ttc9b或wi2-1896o14.1中一种或更多种的增加表达；和plexina4的增加表达。这些神经前体细胞能够在体外和/或在移植到哺乳动物神经系统(例如，哺乳动物cns)后形成产生gaba的神经元。
在另一实施方案中，本发明提供了神经前体细胞群体，其中该群体富集了包括以下的细胞：atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2中的一种或更多种细胞表面标志物的增加表达；和plexina4的增加表达。这些神经前体细胞能够在体外和/或在移植到哺乳动物神经系统(例如，哺乳动物cns)后形成产生gaba的神经元。
在一些实施方案中，提供了用于治疗具有与抑制性神经元功能失调和/或兴奋性-抑制性不平衡相关的神经系统状况、疾病或损伤的哺乳动物的方法，包括移植本发明的神经前体细胞群体到哺乳动物的神经系统。本发明的神经前体细胞的群体通过特定标识转录物(specificsignaturetranscripts)的表达和/或缺乏其他转录物的表达来区分，这将细胞鉴定为能够在功能上整合到宿主神经系统中，并且特别是宿主中枢神经系统中的迁移细胞，如本文更详细描述的。本发明的神经前体细胞能够从移植位置迁移至少0.5mm，并在治疗的期望位置成熟和功能性地整合入内源组织。
适合本发明的方法治疗的神经系统状况、疾病或损伤包括各种退行性疾病、发育疾病、遗传疾病、急性损伤和慢性损伤。细胞可以移植入中枢神经系统或外周神经系统。在一些实施方案中，神经系统状况、疾病或损伤包括但不限于，帕金森病、癫痫病(例如癫痫(epilepsy))、痉挛状态、脊髓损伤、脑损伤或外周神经损伤、疼痛(例如神经性疼痛)、阿尔茨海默病、焦虑症、自闭症、中风、慢性瘙痒、弱视/视觉可塑性、精神病(例如精神分裂症)、运动障碍和/或张力障碍。
因此，本发明还提供了用于治疗受试者中的神经紊乱的方法，所述方法包括将神经前体细胞群体移植入罹患神经紊乱的哺乳动物的神经系统，其中群体的至少50％包括富集了选自以下的一种或更多种转录物的细胞：as1、atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、elavl2、ensg00000260391、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gad1、gad2、gng2、gpd1、gria1、gria4、hmp19、ina、kalrn、kdm6b、kif21b、l1cam、lhx6、linc00340、linc00599、maf、mafb、mapt、miat、ncam1、nkx2-1、nmnat2、npas1、nrcam、nrxn3、nxph1、pdzrn4、pip5k1b、pls3、plxna4、rai2、robo1、robo2、rp11-384f7.2、rp4-791m13.3、runx1t1、scg3、scrt1、scrt2、siah3、slc32a1、sox6、srrm4、sst、st8sia5、stmn2、tagln3、tiam1、tmem2、ttc9b或wi2-1896o14.1，并允许移植的细胞迁移和整合入所述哺乳动物的中枢神经系统，从而治疗所述哺乳动物的神经紊乱。
在一些实施方案中，被治疗的神经系统状况是癫痫病(例如癫痫)，其中移植本发明的神经前体细胞导致自发电图癫痫发作活动(spontaneouselectrographicseizureactivity)的减少。在具体实施方案中，神经系统状况是癫痫，其中移植本发明的神经前体细胞导致癫痫发作强度和/或持续时间的减少。在一些实施方案中，神经系统状况是癫痫，其中移植本发明的神经前体细胞导致癫痫发作频率和/或强度的减少。在一些实施方案中，神经系统状况是癫痫，其中移植本发明的神经前体细胞导致接受移植的患者中所需的抗癫痫药物使用的减少。
在一些实施方案中，用本发明的方法治疗的神经系统疾病是帕金森病，其中移植本发明的神经前体细胞导致所需的抗帕金森药物使用的减少。在一些实施方案中，神经系统疾病是帕金森病，其中移植本发明的神经前体细胞导致静止时震颤、僵硬(rigidity)、运动不能、运动迟缓、姿势不稳定、姿势弯曲和/或僵硬(freezing)的减少。
在一些实施方案中，被治疗的神经系统状况是痉挛状态，包括但不限于神经性膀胱痉挛状态，其中移植本发明的神经前体细胞减轻或消除对药物治疗或手术的需求。在一些实施方案中，神经系统状况是痉挛状态，其中移植本发明的神经前体细胞导致所需的抗痉挛药物使用的减少。
在其他实施方案中，使用本发明的方法治疗的神经系统状况是神经损伤(例如，脊髓或外周神经损伤)，其中移植本发明的神经前体细胞导致与神经损伤相关的生理学损害的改进。
在又其他实施方案中，被治疗的神经系统状况是疼痛(例如，慢性疼痛或神经性疼痛)，其中移植本发明的神经前体细胞群体导致被治疗的受试者的疼痛减少。
在又其他实施方案中，使用本发明的方法治疗的神经系统状况是阿尔茨海默病，其中移植本发明的神经前体细胞群体导致学习和记忆的能力增加。
在又其他实施方案中，使用本发明的方法治疗的神经系统状况是创伤性脑损伤(例如，中风)，其中移植本发明的神经前体细胞群体导致运动和/或协调的改进。
在又其他实施方案中，使用本发明的方法治疗的神经系统状况是神经发育或精神病学疾病，包括自闭症、精神分裂症或精神病，其中移植本发明的神经前体细胞群体改善这些患者的行为诸如社交困难和学习缺陷(learningdeficiencies)。
在以上每个治疗方案中，移植本发明的神经前体细胞导致受试者中疾病相关症状的至少10％改善、更优选地受试者中疾病相关症状的至少20％改善、甚至更优选地受试者中疾病相关症状的至少30％改善。
优选地，移植的神经前体细胞或从移植的细胞产生的细胞在移植到受试者之后存活至少1个月、优选地2个月、和更优选地6个月。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验确定，本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物意图被以下权利要求涵盖。
附图简述
图1是一系列图，说明使用apc-缀合的抗cxcr4抗体(图1b)和apc-缀合的抗erbb4抗体(图1d)、或各自的同种型阴性对照抗体(图1a和1c)facs分选皮层人中间神经元的效率。
图2是柱状图，说明在表面标志物阳性facs分选的细胞群体中，与各自的表面标志物阴性群体对照相比，通过定量rtpcr，mge-特异性标志物lhx、dlx2和sox6标志物的富集表达。
图3是柱状图，说明在表面标志物阳性facs分选的细胞群体中，与各自的表面标志物阴性群体对照相比，通过定量rt-pcr，其他非mge型gaba能中间神经元细胞类型的标志物的表达大大减少。
图4是一系列图，说明在分选前的细胞群体(上)对比使用apc-缀合的抗cxcr4抗体facs分选后的表面标志物阳性群体(下)中，细胞碎片/死细胞(左)和表达cxcr4的细胞纯度(右)中的差异的流式细胞术分析。
图5是一系列图，说明在分选前的细胞群体(上)对比使用apc-缀合的抗erbb4抗体facs分选后的表面标志物阳性群体(下)中，表达erbb4的细胞纯度中的差异的流式细胞术分析。
图6是一系列图，说明磁性macs分选前表面标志物阳性细胞的百分比(分选前，左)和使用macs分选(分选后，右)以分离macs阳性和macs阴性群体二者后的表面标志物阳性细胞的纯度的流式细胞术分析。macs分选用抗erbb4生物素化的一级抗体，随后是与磁珠缀合的抗生物素二级抗体进行。macs分选前和分选后的流式细胞术分析使用apc-缀合的抗errb4抗体进行。
图7是柱状图，总结通过分选后流式细胞术分析确定的macs分离的表面标志物阳性和阴性群体的作为表达表面标志物erbb4的细胞的百分比的可再现的分选后纯度。
图8是柱状图，通过分离的表面标志物阳性群体的免疫细胞-化学分析定量分选后蛋白表达，显示示例性gaba能中间神经元标志物(lhx6、dcx、erbb4)的富集的表达和非中间神经元细胞谱系的标志物的消耗的表达。
图9是表格，总结分选前的神经细胞群体的流式细胞术分析，显示表达各种中间神经元表面标志物的细胞的百分比。
图10是通过rna测序分析的富集的转录物表达的表格，显示通过使用抗cxcr4抗体的facs分离的表面标志物阳性群体中与阴性群体相比,上调最多的转录物以及选择的标志物的改变倍数。
图11是通过rna测序分析的富集的转录物表达的表格，显示通过使用抗cxcr7抗体的facs分离的表面标志物阳性群体中与阴性群体相比,上调最多的转录物以及选择的标志物的改变倍数。
图12是通过rna测序分析的富集的转录物表达的表格，显示通过使用抗erbb4抗体的facs分离的表面标志物阳性群体中与阴性群体相比,上调最多的转录物以及选择的标志物的改变倍数。
图14是通过facs分离的表面标志物阳性群体(与各自的表面标志物阴性群体相比)中，通过rna测序，可定义各种细胞谱系的标志物集和这些标志物的改变倍数的表格，显示富集的mge中间神经元标志物转录物表达和标记各种非中间神经元细胞谱系的转录物的极大消耗的表达。
图15是一组柱状图，显示来自通过facs(左)或macs(右)分选的、在分选后重新铺板的分离的表面标志物阳性和阴性细胞群体的收集的细胞培养基中gaba水平的hplc分析。
图16是显示通过移植前细胞分选分离的神经前体细胞表面标志物(npcsm+)阳性细胞注射后一个月时啮齿动物脑中人hna+神经前体细胞的迁移的图。
图17是显示通过移植前细胞分选分离的神经前体细胞表面标志物(npcsm+)阳性细胞注射后一个月时啮齿动物脑中共表达gaba能中间神经元标志物lhx6、cmaf和mafb的人hna+细胞的免疫组织化学定量的图。
图18是显示通过移植前细胞分选分离的神经前体细胞表面标志物(npcsm+)阳性细胞注射后90天和130天时啮齿动物脑中共表达皮层中间神经元亚型成熟标志物sst和calr的人hna+细胞的免疫组织化学定量的图。
图19是显示成年啮齿动物脑中注射部位的示意图。
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图22是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm+细胞中被上调的示例性转录物与plexina4-npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图23是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm+细胞中被下调的示例性转录物与plexina4-npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图24是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm+细胞中被上调的示例性转录物与plexina4+npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图25是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm+细胞中被下调的示例性转录物与plexina4+npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图26是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm-细胞中被上调的示例性转录物与plexina4-npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图27是rna测序分析的表格，显示通过facs分选分离的plexina4+npcsm-细胞中被下调的示例性转录物与plexina4-npcsm-细胞群体相比的改变倍数。
图28是一系列直方图，显示分选前(未分选的)和macs分选后以从朝向mge类型中间神经元谱系分化的四种不同人esc细胞系分离npcsm+和npcsm-群体的npcsm+细胞的百分比的流式细胞术分析。
图29是免疫细胞化学分析的一系列柱状图，显示通过磁性macs从朝向mge类型中间神经元谱系分化的四种不同人esc细胞系分离的npcsm+群体中，与npcsm-和未分选的群体相比，表达皮层中间神经元标志物转录物的细胞的富集，以及表达olig2、ki67、isl1的其他细胞类型的消耗。
图30是共表达各种标志物的人hna+细胞的免疫组织化学分析和百分比的定量的一系列柱状图，显示用从hesc衍生的培养物分选的npcsm+细胞移植后一个月和两个月时啮齿动物脑中的人中间神经元成熟。
图31是显示用通过从两种不同人esc细胞系的细胞分选分离的npcsm+细胞注射后一个月时啮齿动物脑中人hna+神经前体细胞的迁移的图。
图32是显示来自从人esc衍生的培养物分离并在分选后重新铺板的分选的plxna4和/或一种其他npcsm表面标志物阳性和阴性细胞群体的收集的细胞培养基中的gaba水平的hplc分析的图。
定义
本文使用的术语倾向于具有如本领域的技术人员理解的简单和普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制此类术语的含义，除非特别地指示。
如本文所用，术语“分离的”是指包含具有特定转录物标识的细胞的细胞群体的纯化或基本上纯化，例如，具有指示细胞迁移和/或分化能力的转录物表达的细胞的表达。
“干细胞”通常被定义为这样的细胞：(i)能够自我更新；和(ii)可以通过不对称细胞分裂产生多于一种类型的细胞(watt等人,science,284:1427-1430,2000)。干细胞通常产生一种称为祖细胞的多潜能细胞。
“前体细胞”是一种能够分化为填充人体的谱系定向细胞的细胞。这样的细胞可以是有丝分裂前或有丝分裂后的，并且包括但不限于祖细胞和具有已建立的神经结局的细胞，其尚未完全分化和/或整合到内源宿主组织中。
所描述的术语“神经前体细胞”和“感兴趣的神经前体细胞”是指能够在体外或体内迁移并分化为产生gaba的抑制性中间神经元的细胞。本发明的这种前体细胞优选地是具有从移植部位迁移至所需治疗部位的能力的迁移细胞。这样的细胞可以来自，例如，mge、cge、lge或哺乳动物大脑的另一部分。这样的细胞也可以从其他细胞类型分化或重编程。用于本发明方法的神经前体细胞通过它们的表达模式和体外和体内活性进一步定义，如本文更详细描述的。
发明详述
除非另外指出，本文描述的技术的实践可以采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、生物化学、治疗制剂、干细胞分化的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术包括与本文所述的方法互补或对本文所述的方法有用的分化技术；用于包含细胞群体的治疗制剂的技术，可用于递送本发明的细胞群体的递送方法等。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。
这样的常规技术和说明可以在标准实验室手册中找到，诸如参见例如，molecularcloningalaboratorymanual,2nded.,ed.bysambrook,fritsch和maniatis(coldspringharborlaboratorypress:1989)；dnacloning,volumesiandii(d.n.glovered.,1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.,1984)；mullis等人.美国专利第4,683,195号；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；thetreatise,methodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.miller和m.p.caloseds.,1987,coldspringharborlaboratory)；methodsinenzymology,vols.154and155(wu等人.eds.),immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker,eds.,academicpress,london,1987)；和handbookofexperimentalimmunology,volumesi-iv(d.m.weir和c.c.blackwell,eds.,1986)，出于所有目的，所有这些通过引用整体并入本文。
本文提及的转录物和基因使用命名约定，例如在weitzmaninstitutes
应该注意，除非另外明确指出，如本文和所附的权利要求中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包含复数指代物。因而，例如，提及“一个细胞”指的是具有多种多能性和表达模式的一个或更多个细胞，且提及“方法”包括对本领域的技术人员已知的等价步骤和方法的提及，等等。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述的所有的出版物为了描述和公开可以联合目前描述的发明使用的设备、配方和方法的目的，以引用方式并入。
当提供值的范围时，应该明白，在该范围的上限和下限之间的每一个中间值和该规定的范围中的任何其他规定的值或中间值包括在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，且也被包括在本发明内，受制于规定的范围中的任何特异性排除的限值。在规定的范围包含限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的一个或两个的范围也被包括在本发明内。
在以下的描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，对于本领域技术人员在阅读本说明书后将明显的是，本发明可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下被实践。在其他情况下，为了避免使本发明晦涩，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
本发明提供了神经前体细胞的群体，产生神经前体细胞群体的方法，以及使用所述神经前体细胞群体的治疗方法。这些细胞的特有特征是在哺乳动物的内源组织中迁移并分化为功能性抑制性中间神经元的能力。这样的细胞群体可以通过指示神经前体细胞的某些标识转录物或标志物的表达水平来鉴定。这样的细胞群体也可以通过指示其他神经细胞类型其他转录物表达水平降低来鉴定。本发明的神经前体细胞群体具有移植后迁移和分化为功能性抑制中间神经元的能力。
富集的神经元前体细胞标志物通常将展示比其他细胞类型高至少两倍的水平，所述其他细胞类型例如星形胶质细胞、内皮细胞、兴奋性皮层神经元的中间祖细胞、小胶质细胞、兴奋性皮层投射神经元、少突胶质细胞、和兴奋性皮层神经元的放射状神经胶质祖细胞。在其他实施方案中，富集的神经元前体细胞标志物通常将展示与多能细胞例如未分化的人es细胞相比至少两倍高的水平的标志物表达。
在一些实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少50％的细胞群体包含富集两种或更多种神经前体细胞标志物的细胞。在其他实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少60％的细胞群体包含富集两种或更多种神经前体细胞标志物的细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少70％的细胞群体包含富集两种或更多种神经前体细胞标志物的细胞。在某些其他实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少80％的细胞群体包含富集两种或更多种神经前体细胞标志物的细胞。在又其他实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少90％的细胞群体包含富集两种或更多种神经前体细胞标志物的细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少55％的细胞群体包含与其他神经细胞类型相比在表达神经元前体细胞标志物方面表达增加至少两倍或更多的细胞。在一些实施方案中，至少80％的细胞群体包含与其他神经细胞类型相比在表达神经元前体细胞标志物转录物方面表达增加至少两倍或更多的细胞。在其他具体实施方案中，至少90％的细胞群体包含与其他神经细胞类型相比在表达神经元前体细胞标志物方面表达增加至少两倍或更多的细胞。
在一些优选的实施方案中，神经前体细胞标志物的表达与其他神经细胞类型相比表达增加至少10倍。
在其他实施方案中，本发明提供了一种神经前体细胞群体，其中至少55％的细胞群体表达指示细胞迁移并分化成中间神经元、和特别是表达gaba的中间神经元的能力的神经前体标志物的两种或更多种、优选地3种或更多种、甚至更优选地5种或更多种。在一些实施方案中，至少70％的细胞群体表达指示细胞迁移并分化成中间神经元、和特别是表达gaba的中间神经元的能力的神经前体标志物的两种或更多种、优选地3种或更多种、甚至更优选地5种或更多种。在又其他实施方案中，至少80％的细胞群体表达指示细胞迁移并分化成中间神经元、和特别是表达gaba的中间神经元的能力的神经前体标志物的两种或更多种、优选地3种或更多种、甚至更优选地5种或更多种。
优选地，本发明的神经前体细胞群体包括在移植到哺乳动物后能够有效地分化成抑制性中间神经元的至少55％神经前体细胞、更优选地在移植到哺乳动物后能够有效地分化成抑制性中间神经元的至少80％神经前体细胞、更优选地在移植到哺乳动物后能够有效地分化成抑制性中间神经元的至少90％神经前体细胞、和甚至更优选地在移植到哺乳动物后能够有效地分化成抑制性中间神经元的至少95％细胞。
如本文更详细描述的，本发明的细胞特别适合大规模用于各种适应症。优选地，神经前体细胞群体的至少50％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元，更优选地神经前体细胞群体的至少60％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元，甚至更优选地神经前体细胞群体的至少70％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元，仍更优选地神经前体细胞群体的至少80％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元，神经前体细胞群体的至少90％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元，仍更优选地神经前体细胞群体的至少95％细胞在移植到哺乳动物中枢后外周神经系统后成熟为gaba能抑制性中间神经元。
神经前体细胞群体的产生
在某些实施方案中，使用在mge衍生的人中间神经元上表达的一种或更多种细胞表面蛋白富集本发明的神经前体细胞群体。此类标志物在人皮层中间神经元中比在兴奋性神经元的群体或其他细胞类型诸如放射状神经胶质细胞或非分化的人多能干细胞中更丰富。用于分离和/或富集本发明的神经前体细胞群体的细胞表面标志物包括但不限于，atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2。
在其他实施方案中，使用更通用的神经元细胞表面蛋白分离或富集细胞群体，并使用一种或更多种如本文所述用于富集神经前体细胞的具体方法来进一步富集。例如，包括但不限于cd24、cd56、cd200、l1cam和ncam、psancam的泛神经元标志物可用于分离细胞群体，所述细胞群体被进一步富集以提供本发明的神经前体细胞。
本发明的神经前体细胞群体也可以使用基于非抗体的纯化方法分离和/或富集，优选地联合用于富集细胞的另一方法以提供具有在移植后分化为功能性抑制性中间神经元、迁移和/或功能性整合的能力的大多数前体细胞。此类纯化方法包括但不限于大小选择(例如通过密度梯度、facs或macs)，将标记的配体用于细胞表面受体，或通过使用增强子-启动子报道基因表达或使用标记的表面标志物。
例如，细胞群体最初可以使用针对细胞表面标志物的抗体从来源诸如胎儿神经组织或从多能或神经干细胞分化的细胞分离，所述细胞表面标志物例如，atrnl1、cd200、celsr3、chrm4、cntnap4、cxcr4、cxcr7、dscaml1、epha5、erbb4、fam5b、fam65b、fndc5、gria1、gria4、l1cam、ncam1、nrcam、nrxn3、nxph1、plxna4、robo1、robo2或tmem2。然后可使用基于指示细胞进一步分化为功能性抑制性中间神经元的能力的神经前体细胞表面标志物的另外细胞选择来进一步富集细胞群体。
用于从生物样品分离神经前体的方法包括但不限于，通过大小和密度的细胞分级；高选择性基于亲和力的技术，诸如亲和层析、荧光激活细胞分选(facs)和磁性细胞分选；基于增强子-报道基因的分离；基于加标签的配体的分离；和基于神经前体细胞的功能特性的分离。参见例如，dainiakmb等人,advbiochemengbiotechnol.2007；106:1-18；grossa.等人,curropinchemeng.2013feb1；2(1):3-7；swiersg等人.natcommun.2013；4:2924；bonnetd等人,bioconjugchem.2006nov-dec；17(6):1618-23.，和wo2013155222a2，所有这些通过引用整体并入。
在其他实施方案中，本发明的神经前体可以从多能干细胞或神经干细胞群体分化。特定多能干细胞和可用于分化的神经分化的各种方法被公开于例如，美国专利申请第20150004701、20140335059、20140308745、20140113372、20130004985、20120328579、20120322146、2011031883、20110070205、20110002897、20100291042、20100287638、20090263361、20090220466、20080254004、20070231302、20070020608、20060270034、20060211111、20060078545、20060008451和20050095702号中，所有这些通过引用整体并入。
在一些实施方案中，神经前体细胞群体通过细胞的重编程创建，所述细胞例如，从mge、皮层、亚皮层、脑的其他区域获得的神经细胞、或非神经细胞。在本发明中可以有用的用于重编程的方法被公开于例如，美国专利申请第20150087594、20150086649、20130109090和20130109089号；还参见takahashi,k.,等人.cell131,861-872(2007)和美国申请第20130022583号。
在一些实施方案中，神经前体细胞群体通过非神经细胞的直接重编程创建，所述非神经细胞例如，多能干细胞、成纤维细胞、血细胞或非神经元胶质细胞(colasanteg等人,cellstemcell,2015,17,719-34；shiz,等人,journalofbiologicalchemistry,2016,291(26),13560-70；suna等人,cellreports,2016,16,1942-53)。
治疗施用方法
将本公开内容的本发明的神经前体细胞施用于动物，特别是人的方法在本文中详细描述，并且包括将本发明的神经前体细胞注射或植入到受试者的靶部位。本公开内容的细胞可被插入递送装置中，所述递送装置便于通过注射或植入将细胞引入动物。此类递送装置包括管，例如导管，用于将细胞和流体注射入接受者动物体内。在一个优选的实施方案中，管另外地具有针头，例如注射器，细胞可通过所述针头在期望的位置被引入动物。本发明的神经前体细胞可以以不同的形式被插入这样的递送装置，例如注射器。例如，当被包含在此类递送装置中时，细胞可以悬浮在溶液中或嵌入支撑基质中。如本文所用，术语“溶液”包括细胞在其中保持活力的药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域公知的。溶液优选地是无菌和流体的以方便递送。优选地，溶液在生产和储存的条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。本公开内容的溶液可如本文所述在药学上可接受的载体或稀释剂以及根据需要的上文列举的其他成分中制备，随后过滤灭菌。
在人体中，注射通常将使用具有23-27号针头的灭菌的10μlhamilton注射器进行。装有细胞的注射器直接安装在立体定位框架(stereotaxicframe)的头部。通过颅骨中的小毛刺孔将注射针头降低至预定坐标，以约1-2μl/分钟的速率沉积40-50μl的悬浮液，并且允许再扩散2-5分钟，随后缓慢回缩针头。通常，两次或更多次单独的沉积将沿相同的针入度间隔1-3mm进行，并且可以容易地在同一操作中进行分散在目标区域上的最多5次沉积。注射可以手动进行或通过输液泵进行。在回缩针头后手术完成后，将患者从框架中取出并缝合伤口。可根据需要施用预防性抗生素或免疫抑制疗法。
顺从于治疗的治疗适应症
在一些实施方案中，本公开内容可用于治疗退行性疾病。退行性疾病是一种特定细胞类型例如神经元的衰退(例如，功能、结构、生物化学)的疾病，导致不良临床状况。例如，帕金森病是中枢神经系统中例如基底神经节的退行性疾病，其特征是节律性肌肉震颤、行动僵硬、慌张步态、下垂姿势和面具相。可用本公开内容的基本上同质的细胞群体治疗的退行性疾病包括例如，帕金森病、多发性硬化、癫痫、亨廷顿舞蹈病、肌张力障碍(变形性肌张力障碍)和舞蹈手足徐动症(choreoathetosis)。
在一些实施方案中，本公开内容可用于治疗急性损伤引起的状况。急性损伤状况是一个事件或多个事件导致不利临床状况的状况。导致急性损伤状况的事件可以是外部事件诸如钝力或压迫(例如，某些形式的创伤性脑损伤)或内部生理事件诸如突发性缺血(例如，中风或心脏病)。可以用本发明的细胞群体治疗的急性损伤状况包括但不限于，脊髓损伤、创伤性脑损伤、由心肌梗塞和中风引起的脑损伤。
在一些实施方案中，施用的细胞包含基本上同质的细胞群体，其可以通过从主要来源分离或从多能或多潜能干细胞来源衍生得到。在一些实施方案中，基本上同质的群体包含细胞，其中至少25％的细胞成为gaba表达细胞。在一些实施方案中，基本上同质的群体包含细胞，其中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞成为表达gaba的抑制性中间神经元。在一些实施方案中，构成基本上同质的细胞群体的至少25％的细胞从注射部位迁移至少0.5mm。在一些实施方案中，构成基本上同质的细胞群体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞从注射部位迁移至少0.5mm。在一些实施方案中，构成基本上同质的细胞群体的大多数细胞从注射部位迁移至少1.0、1.5、2.0、3.0、4.0或5.0mm。在一些实施方案中，基本上同质的细胞群体的至少25％成为功能性gaba能中间神经元。在一些实施方案中，细胞的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％成为功能性gaba能中间神经元。在一些实施方案中，基本上同质的细胞群体的至少25％成为与内源神经元整合的功能性gaba能中间神经元。在一些实施方案中，基本上同质的细胞群体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％成为与内源神经元整合的功能性gaba能中间神经元。
选择的细胞可直接从培养物中使用或储存备用，例如，通过在液氮中低温贮藏。低温贮藏的其他方法也是本领域已知的，例如，美国专利申请第20080057040号。如果被低温贮藏，在将本发明的神经前体细胞置于移植培养基中之前,必须先解冻本发明的神经前体细胞。冷冻和解冻低温贮藏材料使得它们在解冻过程之后具有活性的方法是本领域普通技术人员熟知的。
在一些实施方案中，本公开内容包括药物组合物，所述药物组合物包含神经前体细胞的基本上同质的细胞群体。在一些实施方案中，药物组合物具有至少约10^3或105个基本上同质的细胞。在一些实施方案中，药物组合物具有至少约106、107、108、109或1010个基本上同质的细胞。组成药物组合物的细胞可还表达至少一种神经递质、神经营养因子、抑制性因子或细胞因子。
本发明的神经前体细胞群体可被，例如，移植或放置在中枢神经系统，例如，脑或脊髓，或外周神经系统。神经系统中用于本公开内容的细胞的放置位置基于特定的神经状况确定，例如直接注射到损伤的纹状体，脊髓实质或背神经节中。例如，本公开内容的细胞可以放置在患有帕金森病的患者的纹状体中或附近。类似地，本公开内容的细胞可以放置在患有脊髓损伤的患者的脊髓(例如，颈部、胸部、腰部或骶骨)中或附近。本领域技术人员将能够确定最适合放置细胞的方式(例如，针头注射或放置、更有创性的手术)，取决于神经状况的位置和患者的医学状况。
本发明的神经前体细胞群体可单独施用或作为与常规赋形剂的混合物施用，所述常规赋形剂例如适用于肠内或肠胃外应用的药学上或生理学上可接受的有机或无机载体物质，其不会与本公开内容的细胞有害地反应。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(诸如林格氏溶液)、醇、油、明胶和碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。此类制品可以被灭菌且如果期望的话，可与辅助剂相混合，所述辅助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和/或芳香物质等，其不与本公开内容的细胞有害地反应。
当需要或期望肠胃外应用时，特别适合于细胞的混合物是可注射的、无菌溶液，优选地油性或水性溶液，以及悬浮液、乳液或植入物。特别地，用于肠胃外施用的载体包括右旋糖的水溶液、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油和聚氧乙烯嵌段聚合物。适合用于本公开内容的药物混合物是本领域技术人员公知的并且被描述于例如pharmaceuticalsciences(第17版,mackpub.co.,easton,pa.)和wo96/05309中，这两者的教导通过引用特此并入。
神经前体细胞群体在施用于患有神经状况的人时可以单独使用或与其他疗法联合使用。例如，类固醇或药学合成药物可与本公开内容的细胞共施用。类似地，脊髓损伤的治疗可以包括在脊柱已被物理固定的人中施用/移植本公开内容的细胞。
细胞向人的施用或移植的剂量和频率(单次或多次剂量)，包括移植入人的细胞的实际数目，可以根据各种因素变化，所述因素包括被治疗的具体状况，例如，退行性状况、急性损伤、神经状况；尺寸；年龄；性别；健康；体重；体重指数；饮食；被治疗的神经状况的症状的性质和程度，例如，早发性帕金森病相比晚期帕金森病；脊髓创伤相比部分或完全切断脊髓)；并行治疗的种类，例如类固醇；来自神经状况的并发症；对治疗的耐受程度或其他健康有关的问题。可以用本公开内容的细胞例如约106个细胞在相同或不同的部位一次或重复治疗具有退行性状况、急性损伤或神经状况的人。治疗可以每月、每六个月、每年、每半年、每5年、10年或15年一次，或医学上视为必要的任何其他适当的时间段进行。
本公开内容的方法可用于治疗人哺乳动物以外的哺乳动物的神经状况。例如，需要兽医学治疗的非人哺乳动物，例如，伴侣动物(例如狗、猫)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马)和实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意图限制发明人认为是他们的发明的范围，实施例也不意图代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域的技术人员应该明白，可以在对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，所列出的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。
作出了努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度，等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，份数为重量份数，分子量为加权平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压或临近大气压。
实施例1：感兴趣的神经前体从人皮层的细胞富集
已经证明小鼠抑制性中间神经元前体移植物在包括癫痫、帕金森氏症、自闭症、阿尔茨海默氏病和神经性疼痛的多种临床前模型的脑和脊髓中是有效的(美国专利申请第20090311222号、美国专利申请第20130202568号)。使用rna测序检查了发育中的人胎儿脑的总基因表达谱系分析以鉴定在人中间神经元和人中间神经元的前体中的新的转录物表达以鉴定具有在体内迁移并分化为抑制性中间神经元的能力的细胞。检查的这些标志物包括细胞内标志物和在细胞表面上表达的标志物二者。
在一个特定的例子中，利用三种细胞表面标志物从胎儿人体组织富集神经前体。将人胎儿脑组织置于冷hibe(thermofisher,carlsbad,ca)中，并使用高压灭菌的手术工具在立体显微镜下解剖。将解剖的组织(1-2cm2)置于含有冷hbss(thermofisher,carlsbad,ca)的新平板中。
通过将脑组织放入冷hbss缓冲液中并将其切成小块，进一步分离解剖的脑组织。用冷pbs洗涤切下的组织两次，并在37℃与预热的(4ml)tryple(thermofisher,carlsbad,ca)温育10分钟。使用大体积(25-40ml)的hbss中的100μg/mldna酶(rochemolecularsystems,pleasanton,ca)和140μg/ml卵类粘蛋白(worthington,lakewood,nj)猝灭反应。然后使用10ml移液管从消化的组织机械地解离细胞，并将混合物通过40um细胞过滤器。将细胞悬液以300xg离心5分钟，并将所得的细胞沉淀物在冷hbss中洗涤两次。然后将细胞重悬于含1％bsa、0.1％葡萄糖的冷hbss(facs缓冲液)中并用台盼蓝计数。也可以使用其他形式的组织解离，例如使用分散酶、accutase、木瓜蛋白酶或其他酶促和/或机械方法。
使用方法诸如使用其他梯度离心和/或基于磁珠的分离实现组织减积(tissuedebulking)。在本实验中使组织如下减积：使用4ml冷facs缓冲液中的大约2000万人解离的皮层细胞小心地层放在8ml冷的10％percoll(sigma,st.louis,mo)上并在500xg离心20分钟。然后沉淀物用10ml冷hbss洗涤两次并将细胞重悬于冷facs缓冲液中。
由mge衍生的皮层中间神经元表达的三种神经细胞表面标志物，cxcr4、cxcr7和erbb4，用于细胞群体的富集，使用细胞从胎儿脑的基于抗体的纯化，包括使用apc-缀合的抗cxcr4抗体(图1a和1b)和apc-缀合的抗erbb4抗体(图1c和1d)。未染色的细胞和同种型对照抗体用作门控对照。
将大约500万人解离的皮层细胞重悬于250μlfacs缓冲液中，并与人bdfcblocktm(bdpharmigen,1:50稀释)一起在4℃温育10分钟。然后将apc-缀合的一级抗体以1:25的最终稀释度加入到细胞，并在4℃温育30-40分钟。在用冷facs缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于500μl含有5umsytoxblue(thermofisher,carlsbad,ca)的facs缓冲液中，收集在具有细胞过滤器盖(falcon)的5ml聚苯乙烯管中并使用bdfacs-ariacellsorter(becktondickonson,franklinlakes,nj)分析。sytoxblue用于区分死细胞(sytox阳性)和活细胞(sytox阴性)。将apc阳性和阴性细胞级分收集到含有5mlns培养基(neurobasala,b27(补充有维生素a)、青霉素/链霉素和谷氨酰胺)的15ml试管(corning,corningny)中。然后将细胞级分在500xg离心5分钟并重悬于300μl含有β-巯基乙醇的rlt缓冲液(qiagen,hilden,germany)中并储存在-80℃。可选地，在用matrigel(生长因子减少)包被的96孔板中收集5000-10000个apc阳性和阴性细胞，并在37℃在150μlns培养基中培养48小时。
使用体外测定诸如rt-pcr和免疫细胞化学法以使用对mge谱系细胞特异性的标志物的表达证实纯化的细胞的身份。使用rneasymicro试剂盒(qiagen,hilden,germany)分离分选的细胞(收集在rlt缓冲液中)的rna并使用superscriptiii反转录酶(thermofisher,carlsbad,ca)合成cdna。使用sybrgreen进行rt-pcr。用针对lhx6、dlx2和sox6的引物检测mge中间神经元。
如图2所示，在facs纯化的细胞群体中富集mge特异性标志物lhx6、dlx2和sox6。分别使用针对olig2、scgn、csf1r、neurod2、aq4、vamp1和foxc1的引物检测少突胶质细胞、cge中间神经元、小胶质细胞、兴奋性皮层神经元、星形胶质细胞、周细胞和内皮细胞的污染性群体。如图3所示，由于分离的细胞具有少突胶质细胞(olig2)、cge中间神经元(scgn)、小胶质细胞(csf1r)、兴奋性神经元(neurod2)、星形胶质细胞(aq2)和内皮细胞(foxc1)的标志物的减少表达，facs纯化主要针对污染性细胞群体选择。例外的是使用cxcr4纯化的细胞，其表达scgn、aq4和foxc1，和使用erbb4纯化的细胞，其表达scgn。后者的细胞被排除在进一步表征之外。
然后通过免疫组织化学验证纯化的皮层中间神经元群体。培养48小时后，将96孔板中的分选细胞在室温在4％pfa(affimetrix,santaclara,ca)中固定7分钟，并用pbs洗涤。然后用封闭溶液(10％驴血清(sigma,stlouis,mo)、1％bsa(sigma,stlouis,mo)、0.1％tritonx100、0.1％叠氮化钠和pbs)封闭含有细胞的孔1小时。将固定的细胞与一级抗体在4℃温育过夜，然后在室温与alexafluor荧光缀合的二级抗体(thermofisher,carlsbad,ca)温育2小时。用于鉴定中间神经元的抗体为：gaba(sigma,stlouis,mo)、vgat(synapticsystems,goettingen,germany)、gad65/67(millipore,temecula,ca)和dlx2。针对lhx6(santacruz,dallastx)、mafb(sigma,stlouis,mo)和cmaf(santacruz,dallastx)的抗体用于鉴定mge衍生的中间神经元。其他抗体对应于：sp8、dcx、olig2(millipore,temecula,ca)、gfap(millipore,temecula,ca)、iba1和pu1(millipore,temecula,ca)、ki67、和裂解的胱天蛋白酶3(millipore,temecula,ca)，以分别检测cge衍生的中间神经元、未成熟神经元、少突胶质细胞、放射状胶质细胞/星形胶质细胞、小胶质细胞、增殖细胞和凋亡细胞。分析染色的细胞并在leicadmi8显微镜中成像。
cxcr4+细胞表达人核抗原(hna)、神经母细胞标志物dcx和mge标志物lhx6，且大部分表达mge标志物mafb和囊泡gaba转运蛋白(vgat)。使用erbb4和cxcr7抗体分离的细胞也主要表达vgat。这些结果表明，facs纯化的细胞群体具有被增殖细胞和少突胶质细胞的极小污染。
显示纯化的细胞群体具有比分选前细胞群体更少的碎片和显著更少的死细胞。来自妊娠18周(gw18)脑的皮层组织被解离。用cxcr4抗体分选解离的细胞，并将分选的细胞移植入新生(p0-p2)小鼠幼崽。如图4所示，分选前的细胞具有大量细胞碎片(p5)和死(bv421-a+)细胞(图4a和4b)，但使用cxcr4标志物分选的细胞仅具有少量细胞碎片(p5)并且几乎没有死(bv421-a+)细胞(图4c和4d)。对使用erbb4神经细胞表面标志物分选的细胞观察到如此(图5a和5b)。
为了确保细胞特征没有受到富集方法以某种方式偏倚，然后使用磁激活细胞分选(macs)分离细胞。将1000万人解离的皮层/mge细胞重悬于500μl缓冲液中，并与人bdfcblocktm在4℃温育10分钟。然后将生物素化的一级抗体加入到细胞并在4℃温育30-40分钟。用冷缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于含有抗生物素微珠的facs缓冲液中，并在4℃温育30分钟。用缓冲液洗涤两次后，将细胞重悬于500μl缓冲液中并加入保持在磁体上的ls柱。将流通物(flow-through)收集为“阴性分选”，并将结合材料洗涤三次。然后将柱从磁体中取出并加入5mlfacs缓冲液并收集“阳性级分”。然后通过流式细胞术或免疫染色分析细胞级分。
图6显示了阐明使用磁珠缀合的抗神经前体细胞表面抗体的人皮层中间神经元的macs分选和分离细胞标志物阳性和阴性群体、随后分选后流式细胞术分析来确定磁分离的纯度的磁柱分选的效率的图。来自人皮层样品(“分选前”)的erbb4+细胞在阳性磁柱结合级分(“分选后阳性”)中被富集，而在流通物(“分选后阴性”)中被消耗。图7是显示来自人皮层样品(n＝7)的细胞的细胞表面标志物分选的macs分离效率总结的图。
通过免疫细胞化学(icc)分析来分析来自人皮层组织的macs分选的群体。培养48小时后，将96孔板中的分选细胞在室温在4％pfa(affimetrix,santaclara,ca)中固定7分钟，并用pbs洗涤。然后用封闭溶液(10％驴血清(sigma)、1％bsa(sigma)、0.1％tritonx100、0.1％叠氮化钠和pbs)封闭含有细胞的孔1小时。将固定的细胞与一级抗体在4℃温育过夜，然后在室温与二级抗体温育2小时。使用的抗体包括lhx6(santacruz)、sp8、dcx、olig2、gfap、neurod2、sox10(millipore)和erbb4。二级抗体包括alexafluor缀合的抗体(thermofisher)。分析染色的细胞并在leicadmi8显微镜中成像。使用dapi染色确定总细胞数目。
图8是显示对于中间神经元标志物(lhx6、sp8、dcx、erbb4)富集的和对于其他细胞谱系的标志物消耗的macs分选的erbb4+群体的icc分析的图(n＝4个独立实验)，所述其他细胞谱系诸如投射神经元(neurod2)、少突胶质细胞(olig2、sox10)和星形胶质细胞/放射状胶质细胞(gfap)。
实施例2：来自人皮层的细胞中感兴趣的神经前体的标志物的表达增加
在从人皮层分离的细胞中检查了感兴趣的神经前体细胞的特定标志物的表达。然后进行按照实施例1制备的来自人皮层的中间神经元的facs分选的群体的rna序列分析。使用标准技术从三个纯化的细胞群体(cxcr4选择的、cxcr7选择的和erbb4选择的)的每个以及从未选择的每个样品中的细胞中分离mrna，使用rneasyrna纯化试剂盒(qiagen,hilden,germany)纯化mrna，且rna测序根据s.wang,等人,plantcellrep.(2014)33(10):1687-96描述的方法进行。在衔接子连接和pcr扩增后，然后将文库聚类并测序。
将各组的mrna–来自facs选择的和未选择的细胞群体的mrna–进行大量细胞rna测序(wang等人,同上)，并进行表达分析以鉴定在facs选择的细胞中与来自相应样品的未选择的细胞相比表达变化最大的转录物。简言之，将样品在illuminahiseq2500上测序，修剪低质量读段，并将剩余的高质量读段映射到以下参考基因组-homosapienshg19grch37：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html#human。计算每个基因的rpkm值并在组间比较。
示例性细胞表面标志物的表达示于图9中。图10-12显示了对于每个单独的细胞表面标志物cxcr4(图10)、cxcr7(图11)和erbb4(图12)，最富集的三十种转录物和选择的中间神经元标志物富集的转录物。cxcr4选择的、cxcr7选择的和erbb4选择的细胞群体中最富集的表面标志物转录物分别显示在
为了评估分选的群体的细胞类型组成，显示了各种细胞谱系的标志物组，以及在npcsm阳性群体中与其各自的阴性群体相比的转录物改变倍数。mge-和cge-型中间神经元标志物转录物在npcsm+群体中被富集，而标记非中间神经元细胞谱系的转录物主要被消耗(图14)。
实施例3：选择的神经前体中的gaba表达
在通过facs分选或macs分选和培养富集后，从人皮层组织制备的表达细胞表面标志物(例如，crcx4、crcx7或erbb4)的神经前体细胞显示在体外表达并分泌gaba。在从人皮层组织分选细胞后5天，通过hplc分析来分析神经前体细胞标志物阳性和神经前体细胞标志物阴性细胞培养物的gaba分泌。图15显示使用facs(左图)或macs(右图)时来自人皮层样品的培养的神经前体细胞标志物阳性群体中增加的gaba分泌。
实施例4：移植入小鼠脑中的来自人皮层的细胞表面标志物阳性细胞的前后迁移和命运
为了确定从人皮层组织富集的神经前体细胞标志物阳性细胞在体内迁移和分化为中间神经元的能力，将通过facs或macs分选的神经前体细胞标志物阳性细胞浓缩并移植入新生小鼠皮层。将浓缩的细胞悬液装载到安装在液压注射器上的斜面玻璃微量移液管(wiretrol5μl,drummondscientificcompany)中。通过低温麻醉p0-p2新生scid幼崽并将其定位在注射平台上的粘土头部模具中。使用立体定向(stereotax)，将每个注射部位的预定数目的细胞经头盖骨注射到每只幼崽距离中线(矢状窦)1.0mm、距人字点2.6mm和距皮肤表面0.3mm深的大脑皮层中。允许细胞在动物体内迁移和分化，随后免疫组织化学分析。
人神经前体细胞在啮齿动物脑中的迁移和分化利用用针对人特异性标志物hna的抗体染色和用针对中间神经元的已知标志物的抗体同时染色鉴定。简言之，在温育期后，将小鼠处死，并将脑组织用4％pfa在4℃固定48小时，并用pbs洗涤。将组织块在低温恒温器上切片并储存于-80℃直至使用。将低温切片与一级抗体在4℃温育过夜，然后在室温与二级抗体温育2小时。针对dcx和gaba的抗体用于检测中间神经元。针对lhx6、cmaf和mafb的抗体用于检测mge型皮层中间神经元，且针对coup-tfii和sp8的抗体用于检测lge/cge型中间神经元。
图16中显示了hna+/dcx+细胞从其注射部位到新生小鼠皮层的前后迁移，这是迁移性中间神经元的特征。在注射后进行染色以鉴定从人皮层分选的并以不同剂量(每次沉积25、50、100和200x103个细胞)移植到小鼠皮层中的细胞表面标志物阳性细胞。人hna+细胞在移植后30天(dpt)存留于小鼠脑中并且还表达中间神经元标志物c-maf、maf-b、lhx6和gaba。在90dpt时细胞仍然表达gaba。在30dpt时在小鼠皮层中表达中间神经元标志物lhx6、c-maf和maf-b的hna+细胞的定量如图17所示。在90dpt和130dpt时表达更成熟的中间神经元亚型标志物sst和calr(带有或没有sp8)的hna+细胞的定量如图18所示。
实施例5：分选的人皮层细胞进入成年大鼠cns的移植
为了确定从人皮层组织富集的神经前体细胞标志物阳性细胞在成年脑中在体内迁移和分化为中间神经元的能力，将通过facs或macs分选的神经前体细胞标志物阳性细胞浓缩并移植入成年大鼠的海马。细胞群体最初通过针对cxcr4或erbb4的抗体分选。将浓缩的细胞悬液装载到安装在液压注射器上的斜面玻璃微量移液管(wiretrol5μl,drummondscientificcompany)中。通过低温麻醉成年rnu大鼠并将其定位在注射平台上的粘土头部模具中。注射部位在图19中示意地示出。
使用立体定位，将每个注射部位的预定数目的细胞注射到成年未经实验的大鼠海马中。允许细胞在大鼠体内迁移和分化，随后免疫组织化学分析。在71dpt时获取冠状切片，并用针对hna和中间神经元标志物mafb、lh6x和gaba的抗体染色。发现对hna和中间神经元标志物阳性的细胞分散在海马内，并且细胞显示迁移中间神经元形态。
接下来，使用红藻氨酸(kainate)诱导的大鼠癫痫模型和脊髓挫伤损伤大鼠，检查了从人皮层的分选神经前体细胞在成年患病的哺乳动物cns中迁移和分化的能力。将分选的、浓缩的细胞移植入红藻氨酸诱导的癫痫成年大鼠海马或受损的脊髓，并允许细胞如上所述在体内迁移。在71天后，接受移植细胞的cns切片含有分散在海马或脊髓中的人hna+dcx+双阳性细胞，并且这些细胞共表达中间神经元标志物lhx6并展示迁移表型。
实施例6：来自人神经节隆起和人esc衍生的培养物的细胞中的plexina4细胞富集和感兴趣的神经前体的标志物表达增加
发现在妊娠20周的人神经节隆起(内侧、尾侧和外侧)包括表达神经前体细胞表面标志物(“npcsm”)(例如，crcx4、crcx7或erbb4)和plexina4二者的细胞群体(hochrv等人,cellrep.2015,july21,12:3484-492)。对内侧ge观察到比例更多的plexina4单阳性细胞和一些npcsm单阳性细胞。当染色hesc衍生的培养物分化为mge谱系时，检测到类似的表达模式。
如本文对于来自人皮层的细胞所述，使用npcsm(例如，crcx4、crcx7或erbb4)从人胎儿mge分离细胞以富集感兴趣的神经前体细胞的细胞，并且对这些富集的细胞进行表达分析以鉴定与来自相应样品的未选择细胞相比，在facs选择的细胞中表达具有最大变化的转录物。简言之，将样品在illuminahiseq2500上测序，修剪低质量读段，并将剩余的高质量读段映射到以下参考基因组-homosapienshg19grch37：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html#human。计算每个基因的rpkm值并在组间比较。
使用结合剂分离plxna4+npcsm+双阳性、plxna4-npcsm-双阴性、plxna4+npcsm-和plxna4-npcsm+单阳性群体。值得注意的是，单独的npcsm+结合剂可用于分离plxna4-npcsm+和plxna4+npcsm+群体。这些群体使用抗体针对细胞表面标志物的抗体通过facs分选从人内侧ge分离。通过qrt-pcr(如本文所述进行)确定三个细胞群中的相对基因表达水平。相对于总mrna水平，npscm+双阳性群体富集中间神经元标志物转录物(lhx6、erbb4、mafb、cmaf、gad1、sox6、dlx2)(
然后通过免疫细胞化学(icc)分析进一步表征来自人mge组织的三种facs分选的细胞群体的组成。mge祖细胞标志物nkx2.1和olig2在npcsm+细胞中被下调，且中间神经元标志物lhx6和erbb4在npcsm+细胞中被上调，表达测量为与未分化的des细胞中的表达水平相比的改变倍数。lhx6在plxna4+npscm-细胞中也被上调，但在plxna4-npscm-细胞中不存在可检测水平。
类似地，使用针对npcsm的抗体通过facs分选从人esc衍生的mge模式化培养物分离双阴性、双阳性和npcsm+单阳性群体。通过如本文所述的qrt-pcr确定三个细胞群中的相对基因表达水平。相对于总mrna水平，npscm+单阳性群体富集中间神经元标志物转录物(lhx6、erbb4、mafb、cmaf)(图
通过rna测序(rnaseq)检查比较来自人mge的plxna4-npcsm-、plxna4+npcsm-、和plxna4+npcsm+facs纯化群体的全基因表达分析。所列的前面的基因在单阳性或双阳性群体中被上调或下调。
rna序列分析鉴定了高度富集的标志物转录物，通过其表达值中的改变倍数与表1-3和图22-27中各组中的其他表面标志物分选的细胞比较。表1按plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的改变倍数显示了富集的所有差异表达的转录物。表2按plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4+npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的改变倍数显示了富集的所有差异表达的转录物。表3按plexina4+npcsm-分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的改变倍数显示了富集的所有差异表达的转录物。图22显示了plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前30个富集的神经前体细胞标志物，以及另外的示例性中间神经元标志物。图23显示了plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前20个消耗的标志物，以及示例性表面标志物。图24显示了plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4+npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前16个神经前体细胞标志物的表达增加。图25显示了plexina4+npcsm+分选的群体中与plexina4+npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前23个标志物的表达减少。图26显示了plexina4+npcsm-分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前20个神经前体细胞标志物的表达增加。图27显示了plexina4+npcsm-分选的群体中与plexina4-npcsm-分选的群体中这些标志物的水平相比的前20个标志物的表达减少。
表1：plexina4+npcsm+细胞相比plexina4-npcsm-细胞的转录物改变倍数
表2：plexina4+npcsm+细胞相比plexina4+npcsm-细胞的转录物改变倍数
表3：plexina4+npcsm-细胞相比plexina4-npcsm-细胞的转录物改变倍数
实施例8：从hesc培养物产生感兴趣的神经前体
在玻连蛋白基底(thermofisher)上的tesr-e8培养基(stemcelltechnologies)中培养人es细胞(esc)系。使用在特定时间点添加的优化的形态发生素混合物诱导mge型中间神经元，将人esc分化成mge型培养物(如以下中详述的：14/763,397、nicholasc等人,cellstemcell.2013,12(5):573-86)。如以上实施例中详细描述的，使用用于人皮层细胞和人mge细胞二者的细胞分选技术可以进一步富集这些细胞的感兴趣的神经前体。
磁性分选有效地从朝向mge型中间神经元谱系分化的四种不同人esc系富集npcsm阳性细胞(例如crcx4+、crcx7+或erbb4+)。图28示出了与阳性(中间行)和阴性(下行)分选级分相比，来自四个不同esc系的未分选的hesc衍生的培养物(顶行)中的npcsm-阳性细胞百分比的流式细胞术直方图的示例性集合。
从hesc衍生的培养物分离的未分选的、npcsm阳性和npcsm阴性分选级分的icc分析显示npcsm阳性级分中包括erbb4、lhx6和mafb的中间神经元标志物的富集以及祖细胞标志物(olig2和ki67)和投射神经元标志物(isl1)的消耗(图29)。这些标志物在hesc衍生的神经前体群体中的表达增加或减少可以鉴定用于移植的感兴趣的细胞群体，因为它们富集具有在体内迁移并分化成产生gaba的细胞的能力的细胞。这样的细胞群体可以通过分化、阳性选择或通过表达不指示神经前体细胞的细胞标志物的细胞的消耗来富集。
使用针对在npcsm阳性群体中被消耗并在npcsm阴性群体中被富集的其他表面标志物的抗体通过facs分析进一步表征从hesc分化的mge样细胞群体。从nkx2.1:egfphesc衍生的mge样培养物纯化的cd98阴性细胞富集dcx，dcx是有丝分裂后迁移神经元的标志物。此外，随着hesc细胞分化成mge样培养物，cd271表达水平随时间增加然后下降。使用facs分析，从nkx2.1:egfphesc衍生的mge样培养物纯化的cd271阴性细胞显示为富集dcx，dcx是有丝分裂后迁移神经元的标志物。
实施例9：hesc衍生的感兴趣的神经前体细胞可移植入小鼠脑中。
然后测试如上所述选择的hesc衍生的神经前体细胞(plexina4+单阳性、npcsm+单阳性、或plexina4+npcsm+)在体内迁移和分化为产生gaba的细胞的能力。如上所述将分选的细胞移植入免疫缺陷的scid新生小鼠皮层中，并允许其在小鼠脑中迁移和分化。移植1个月后，人hna+细胞表现出包括dcx、mafb、lhx6和gaba的mge型皮层中间神经元的标志物表达。在移植细胞内检测到很少或没有sp8表达，表明中间神经元不是lge-或cge-型中间神经元。
来自hesc衍生的培养物的分选的神经前体向免疫缺陷小鼠皮层注射后1个月和2个月时由免疫组织化学的人hna+细胞标志物表达的定量显示通过下调nkx2.1和上调cmaf，维持mafb表达，以及缺少增殖细胞(ki67)，皮层中间神经元的成熟(图30)。注射到小鼠皮层的来自两种不同的hesc系的分选的细胞获得了稳定的人细胞移植和迁移到整个皮层，类似于先前讨论的用来自人胎儿皮层的npcsm+细胞移植后的迁移性中间神经元(图31)。与npcsm阴性群体相比，plxna4+npcsm+和npcsm+分选的hesc衍生的mge样神经前体细胞在进一步培养3至5周后还显示出分泌升高水平的gaba(图32)。
实施例10：hesc衍生的感兴趣的神经前体细胞可移植入成年大鼠cns中。
来自hesc衍生的mge样培养物的macs纯化的npcsm阳性细胞显示在颞叶癫痫(tle)的免疫缺陷大鼠模型中移植入成年海马。在移植3周后，人细胞表现出迁移性中间神经元的标志物(dcx和nkx2.1)表达。在移植的细胞内分别检测到很少或没有lge和cge衍生的中间神经元的sp8或ki67表达标志物和增殖。
还将来源于人esc的npcsm+macs分选的神经前体细胞移植到挫伤损伤后的成年大鼠脊髓中。移植后一个月，将小鼠处死并分析其脊髓的人细胞迁移和分化。脊髓中的人hna+细胞已经迁移，并且对于包括mafb和lhx6的皮层中间神经元标志物为阳性，表明向中间神经元谱系分化。
实施例11：用本发明的神经前体细胞群体治疗癫痫病
检查了本发明的神经前体细胞群体减少急性和慢性癫痫发作的能力。恢复或增加抑制性中间神经元在体内的功能通过将mge细胞移植到脑中实现，并且这样的细胞被证明在宿主新皮层中迁移，其分布在距离注射部位0.75和5mm之间(参见u.s.20090311222,u.s.9,220,729和alvarez-dolado等人,jneurosci.2006jul12；26(28):7380-9)。进行以下实验来证明，本发明的神经前体细胞群体在癫痫小鼠模型中具有迁移和拯救急性癫痫病的相同能力。
自发性强直-阵挛性癫痫发作已经在具有kcna1的显性-阴性错义突变的人或具有kv1.1/kcna1隐性敲除的小鼠中报告(zuberism等人,brain.1999may；122:817-25)。为了监测这些小鼠中的自发性癫痫发作，进行了延长的视频脑电描记法(eeg；关于电图表型的完整描述，参见方法)。kv1.1-1-小鼠的eeg显示持续10-340秒并且每小时发生一次以上的严重的、广泛的电图癫痫发作；在年龄匹配的野生型同胞中从未观察到电图癫痫发作或高电压尖峰。视频监测证实在发作性癫痫发作事件(ictalseizureepisodes)期间的强直-阵挛性、s4癫痫发作行为(例如，强直性弓起、尾部伸展、随后是前肢阵挛，且然后是前肢和后肢同步阵挛)。
颞叶癫痫(tle)是一种常见的癫痫病，以自发复发性癫痫发作为特征，这是使患者衰弱的。目前，许多患者对抗癫痫药物无反应并且具有有限的治疗选择，诸如高度侵入性的颞叶切除术。在大多数情况下，即使在手术切除癫痫灶后，癫痫发作最终复原。抑制性gaba能信号传导的缺陷是tle的已知原因之一。将gaba能中间神经元移植入海马是治疗tle患者的一种有前途的治疗方法。癫痫发作通常涉及神经回路的超活化或过度兴奋并损害脑功能。新的中间神经元将大脑的兴奋/抑制平衡转向抑制。为了评价npcsm+中间神经元移植物的治疗潜力，使用了成年大鼠和小鼠红藻氨酸(rattka等人,epilepsyresearch,2013,103,135-52)和毛果芸香碱(borgesk等人,experimentalneurology,2003,21-34)的tle模型。
为了用重复的低剂量红藻氨酸诱导tle型癫痫发作，向动物每小时给予5-15mg/kg红藻氨酸的ip注射，直到它们发展racine量表的5期癫痫发作。允许动物癫痫发作持续30-90分钟，随后施用10mg/kg地西泮(ip)以终止癫痫发作。为了用毛果芸香碱诱导癫痫持续状态，用东莨菪碱(1mg/kg,30min)预处理动物，然后直接ip注射100-500mg/kg毛果芸香碱。用东莨菪碱预处理阻断了毛果芸香碱的外周作用。视频和eeg记录和行为实验用于测量癫痫发作频率和持续时间，以评价细胞移植物的有效性和安全性。
将本发明的神经前体细胞群体浓缩到～1,000个细胞/nl。将浓缩的细胞悬液装载到安装在液压注射器上的斜面玻璃微量移液管(wiretrol5μl,drummondscientificcompany)中。通过低温麻醉癫痫动物并将其定位在注射平台上的粘土头部模具中。使用立体定向(stereotax)，将每个注射部位的25-50,000个细胞经头盖骨注射到每只动物距离中线(矢状窦)1.0mm、距人字点2.6mm和距皮肤表面0.3mm深的脑(包括但不限于皮层、纹状体、海马、丘脑、杏仁核、下脑、内嗅皮层)中。
如报道的(smart1999；wenzel2007；glasscock2007)，kv1.1-1-小鼠在出生后第二至第三周期间开始出现频繁的自发性癫痫发作，并且未存活超过出生后第8周；猝死很可能是由于与癫痫持续状态相关的心肺衰竭。与之相比，在p2上移植本发明的神经前体细胞的kv1.1-1-小鼠在出生后第10周存活良好，并表现出电图癫痫发作活动的降低。与未移植的小鼠相比，癫痫发作事件的频率很少见。kaplan-maier存活图显示接受本发明的神经前体细胞群体的成功移植的kv1.1突变小鼠的明显、且统计学显著的向右移位。类似地，tle模型呈现状态后数周的潜伏期，随后是癫痫发作频率的上升阶段，直到动物发生>1次自发性复发性癫痫发作/天。注射本发明的神经前体细胞的成年动物显示显著减少的自发性癫痫发作活动(癫痫发作频率、持续时间和/或严重程度减少)，如通过电图eeg记录和/或通过行为癫痫发作分析测量的。
实施例12：用本发明的神经前体治疗帕金森病
帕金森病(pd)影响美国和欧洲约150人/100,000人。pd的特征是运动障碍以及认知和自主神经功能障碍以及情绪紊乱。pd的四个基本特征可以归入首字母缩略词trap：静止时震颤、僵硬、运动不能(或运动迟缓)和姿势不稳定。此外，弯曲姿势和僵硬(运动阻滞)已被列入帕金森综合征的典型特征之中，其中pd是最常见的形式。现有的治疗可以减轻pd的症状，但无法治愈。
pd的运动症状主要是由于黑质致密部(snc)中含有多巴胺的神经元的损失，其将轴突投射延伸至纹状体并释放多巴胺(综述参见(litvan等人,2007,jneuropatholexpneurol.2007may；66(5):329-36)。snc和纹状体属于基底神经节，一个核心网络，它整合了抑制性和兴奋性信号来控制运动。pd中snc细胞的损失减少了释放到纹状体中的多巴胺量，产生神经递质失衡，其抑制基底神经节的输出并产生运动不足的体征(综述参见delong和wichmann,2007,archneurol.2007jan；64(1):20-4)。
先前已经证明，移植mge细胞可以治疗由多巴胺能输入减少产生的帕金森病的运动症状，这是一种改变了基底神经节中的回路活动的基于非多巴胺的策略(参见美国专利申请第20130202568号)。简言之，将mge细胞移植到用6-羟基多巴胺(6-ohda)处理的大鼠的纹状体中，用6-羟基多巴胺(6-ohda)处理的大鼠是已确立的pd模型。这种治疗依赖于移植后mge细胞迁移、功能整合和增加宿主脑中抑制水平的能力。移植的mge细胞从注射部位迁移并分散到宿主纹状体中。大多数mge移植细胞获得成熟的神经元表型并表达神经元和gaba能标志物。此外，移植的细胞表达多种纹状体gaba能中间神经元特征性的标志物，诸如cb、cr、cb和som。最后，mge移植细胞变成在生理学上成熟，整合到宿主回路中，并改善大鼠6-ohda模型中pd的运动症状。这些结果表明，gaba能中间神经元的移植恢复已经受神经退行性疾病诸如pd影响的神经元回路的平衡。
类似地，本发明的神经前体细胞群体可用于治疗帕金森病。将本发明的神经前体细胞移植到帕金森病的已确立动物模型6-ohda模型中。使用6-ohda对大鼠黑质纹状体投射的单侧损伤通过退行性运输导致snc中的多巴胺能细胞的损失，和通过轴突破坏导致纹状体中多巴胺能末梢的损失(berger等人,1991,trendsneurosci.1991jan；14(1):21-7.)。结果是，d1和d2受体的分布被改变。单侧损害可导致snc的双侧变化(berger等人,同上)。大鼠黑质纹状体通路的损伤伴随从剩余多巴胺能末梢合成和释放多巴胺的代偿性增加(zigmond等人,1984lifesci.1984jul2；35(1):5-18)。
用氯胺酮(90mg/kg)和赛拉嗪(7mg/kg)麻醉成年雌性大鼠，并且当对疼痛不敏感时，将其固定在平面头骨位置的立体定位框架内。在头皮上作出两厘米的矢状面(mid-sagittal)皮肤切口以暴露头骨。黑质纹状体束的坐标基于计算机化的成年大鼠脑图谱确定(togaaw等人,1982brainresbull.1989feb；22(2):323-33)。在适当的坐标钻洞穿过头骨，将玻璃毛细管微量移液器立体推进，以使移液管的内部尖端位于黑质纹状体通道内。微量移液管具有50μm直径尖端，并用0.1％抗坏血酸-盐水中12gr/3μl的6-ohda溶液填充。将6-ohda以1μl/分钟的速率注射到右边的黑质纹状体通道中。将微量移液管在该部位再保持4分钟，然后慢慢取出。皮肤切口用不锈钢伤口夹封闭。每只动物仅在右侧注射6-ohda，产生半帕金森大鼠。
在实验第1天诱导6-ohda损伤，并在第3周和第5周进行行为测试。在选择用于移植的大鼠中，在第6周移植本发明的神经前体细胞，并且在第9、11、14和18周重复行为测试。为了评价手术的成功，在损伤后4周将一部分动物(n＝5)灌注，并且将snc对酪氨酸羟化酶(多巴胺合成中的限制酶)免疫反应性(th-ir)染色，以标记多巴胺能细胞。在成功的手术中，与6-ohda注射同侧的snc侧不显示th-ir，而对侧具有许多th+细胞。为了评价体内6-ohda手术，如下所述进行行为测试。
沿着纹状体的头-尾轴(rostro-caudalaxis)进行三次注射，并且将细胞在每个注射部位沿着背腹轴的三个递送位置处沉积，首先从最腹侧位置开始，然后背侧撤回注射移液管以进行第二次和第三次注射。在每个递送位置注射大约400nl细胞悬液，并且在每个纹状体中注射总共3.6μl总细胞悬液。
行为测试用于确定神经前体细胞移植改善6-ohda损伤大鼠的行为症状的能力。在神经前体细胞移植前后进行三种行为测试：在阿朴吗啡下旋转，步幅长度改变和最大路径宽度。接受神经前体细胞移植物的6-ohda损伤大鼠表现出行为改善，包括阿朴吗啡旋转试验的改善，步幅长度的增加和步态的正常化。这些行为和运动变化表明在移植本发明的神经前体细胞之后pd动物的运动症状的普遍改善。
第一个行为测试是阿扑吗啡下的旋转。阿扑吗啡与由宿主纹状体神经元表达的多巴胺受体结合，这引起6-ohda大鼠的旋转(ungerstedt和arbuthnott,1970,brainres.dec18；24(3):485-93)。如先前所示，在施用阿扑吗啡后，与在两个方向上大致均等旋转的对照大鼠相比，单侧6-ohda损伤的大鼠显著地向对侧(相对于损伤侧)旋转比同侧更多。阿扑吗啡直接刺激多巴胺能受体，由于去神经支配诱导的多巴胺受体超敏性优先在去神经支配的一侧，引起对侧旋转(ungerstedt和arbuthnott,1970)。在阿朴吗啡施用后，为了产生最大旋转行为，存在必须达到的损伤阈值(hudson等人,1993)。半帕金森大鼠的异常行为与da细胞损失量直接相关。当纹状体中多巴胺消耗少于50％时，由于纹状体中的代偿机制，未观察到阿扑吗啡注射后旋转行为的显著变化。
给每只试验大鼠注射多巴胺激动剂阿朴吗啡(0.05mg/kg,ip)以在6-ohda处理的大鼠中产生对侧旋转行为。药物引起的旋转在自动旋转计量碗中测量(columbusinstruments,ohio,brainresearch,1970,24:485-493)。腹膜内注射阿朴吗啡后，对动物配备夹套，该夹套通过电缆连接到旋转传感器。将动物放置在测试碗中，并且在40分钟的测试时间内记录旋转次数和方向。将该测试施加于每只大鼠以验证和定量颅内6-ohda输注的功效。对于移植实验，只选择向对侧旋转比注射的同侧多至少四倍的那些6-ohda大鼠。
在神经前体细胞移植后，与未移植6-ohda对照相比，移植的6-ohda损伤大鼠的对侧旋转次数显著减少。在从第9周开始至至少18周的所有实验时间观察到这种效应。伪移植的6-ohda大鼠的表现与未移植的6-ohda大鼠无法区分，表明神经前体细胞而不是移植程序负责mge移植的6-ohda大鼠的运动改善。
移植的本发明的神经前体对6-ohda损伤大鼠的第二行为效应是步幅长度的变化。将测试动物放置在1m长、33cm宽、两边墙高50cm的跑道上。跑道顶部开放，并位于光线充足的房间内。在跑道的一端放置一个暗箱，并且大鼠穿过跑道后可以自由进入箱。通过将大鼠放在暗箱对面端的跑道上，训练大鼠沿着跑道跑动。重复练习跑动，直到每只大鼠在跑道中放置后立即跑完跑道长度。跑道的地面覆盖纸。在每次测试开始时，动物的后脚在被放置在跑道起点之前浸入黑色墨水中。对每只大鼠重复测试，并测量每次测试的步幅长度以获得每只大鼠的平均步幅长度。
比较各组的平均步幅长度。6-ohda大鼠展示对侧肢体的姿势和运动中的损伤。它们通过主要靠它们的同侧肢体支撑自己，用对侧肢体和尾巴来平衡，并通过不成比例地依靠它们的好的肢体来行走。好的肢体负责姿势调整和向前移动，并且它们向前和侧向移动身体(miklyaeva,1995,brainres.1995may29；681(1-2):23-40)。坏的肢体几乎没有向前移动，因此6-ohda大鼠的步长比对照大鼠短。
损伤大鼠展示显著短于对照大鼠的步幅长度的步幅。神经前体细胞移植后，6-ohda大鼠的步幅长度增加，并到第9周达到与对照大鼠类似的值。步幅长度的增加在11周和14周后保持。接受伪移植的6-ohda大鼠的步幅长度没有变化，并且与未接受治疗的6-ohda大鼠没有显著差异。
移植的本发明的神经前体对6-ohda损伤大鼠的第三种行为效应是大鼠在跑道下降时所经过的最大路径宽度。6-ohda动物具有明显宽于对照大鼠的路径宽度。
正常对照大鼠沿着跑道直线跑动到一端的箱。然而，在6-ohda大鼠中，肢体损伤产生了从一侧到另一侧呈锯齿形的徘徊路径，且因此6-ohda大鼠所遵循的路径比正常更宽。比较对照组和实验组的最大路径宽度，以确定神经前体细胞群体对大鼠下降跑道(descendtherunway)的能力的影响。
接受神经前体细胞移植的6-ohda大鼠的路径宽度减小，并且在第11周时与未损伤的对照动物相似。伪移植的6-ohda大鼠的路径与6-ohda大鼠的路径没有显著差异，表明细胞移植负责6-ohda损伤大鼠步态的实质改善。
实施例13：用本发明的神经前体治疗脊髓损伤(sci)
先前已描述mge细胞具有改善与脊髓损伤相关的某些病理的能力(参见例如，参见例如，u.s.9,220,729和美国专利申请第20130202568号)。将神经前体细胞群体植入未损伤的啮齿动物的脊髓以评估它们整合进入局部回路，以及挫伤和横断的脊髓。研究了挫伤和横断二者以评估痉挛的轻度(挫伤)和中度(横断)水平。
遗传修饰的小鼠和野生型小鼠用补充了异氟烷的阿佛丁或仅异氟烷麻醉。将背部中间的皮肤刮毛。将刮毛区域用clinidine消毒。在使用前，将所有手术工具在cidex中浸泡过夜。将润滑眼药膏放置在每只眼睛中。将动物置于温暖的毯子上以保持温度在37℃。使用手术刀刀片作出大约1cm长的背部中线切口。识别并移除t9的棘突和椎板。暴露直径约2.4mm的硬膜圆形区域。此时将动物转移到离手术区约5英尺的脊髓损伤装置。将小型手术夹放置在脊椎头侧和脊椎尾侧至椎板切除部位以稳定脊柱。此后，使2-3g重量下降5.0cm至暴露的硬膜上。这产生中等水平的脊髓损伤。在损伤后立即将动物从损伤装置中取出并返回到手术区域。将小的无菌缝合线放置在脊椎旁肌肉组织中以标记损伤部位。然后用伤口夹闭合皮肤，并使动物从麻醉中恢复。整个手术过程在45-60分钟内完成。
行为测试用于确定神经前体细胞移植改善与6-ohda损伤大鼠的行为症状相似的与sci相关的生理损伤的能力。在神经前体细胞移植前后进行五项行为测试：旷场测试、网格行走、脚放置、梁平衡和斜面测试。
第一种行为测试是旷场测试，其涉及在损伤后3天和之后每周测试动物直到42天时的安乐死时间。行动测试包括评价动物在旷场中如何行动。这一旷场步行评分测量在自由旷场行动期间动物后肢运动的恢复，如由basso等人描述的。如果没有自发移动，给出评分为0，评分为21表示正常行动。当动物显示14分的评分时，达到完全重量支持的足底步进和完全前肢-后肢协调。bbb评分的修改版本用于确定恢复运动特征的顺序是否与原始评分中描述的不同。如果观察到这种情况，则独立添加对单个特征的分。例如，对于显示不完全脚趾间隙的小鼠，增强脚部旋转并且已经是“尾巴向上”位置，对于尾部位置的评分增加另外一分。
小鼠在术前在旷场进行测试，该旷场是一个80×130cm透明plexiglass盒，具有30cm的墙壁，和铺有纸板的防滑地板。在术后时期(sessions)，对治疗不知情的两个人将观察每只动物4分钟的时间。基于旷场测试显示协调运动的动物如下进行运动功能的另外测试。
用于评估神经前体细胞移植对sci大鼠的影响的第二项行为测试是网格行走。通过评估动物穿过圆形金属棒之间不规则分配的间隙(0.5-5cm)的1m长跑道的能力来检查下降运动控制中的缺陷。棒的距离在一次测试时期与下一次之间随机更改。在安乐死之前的1到2周开始，测试动物5天的时间。
穿越这一跑道要求动物准确地将它们的四肢放在棒上。在基线训练和术后测试中，每只动物将穿过网格至少三次。在每个交叉处计数脚步(footfalls)数量(错误)，并计算平均错误率。如果一只动物不能移动后肢，则给出最大20的错误。计数的错误的数量也在非参数网格行走评分中分级：0-1个错误分级为3分，2-5个错误分级为2分，6-9个错误分级为1分，且10-20个脚步分级为0分。
用于评估神经前体细胞移植对sci大鼠的影响的第三项行为测试是脚放置。足迹放置分析从demedinaceli等人修改。将动物的后爪涂上例如，可以容易地洗掉的水彩颜料，并且在动物穿过跑道时，在覆盖1m长度和7cm宽度的狭窄跑道的纸上产生足迹。这确保了每步的方向符合标准。使用一系列至少八个连续的步骤来确定每次测量肢体旋转、步幅长度和支撑基部的平均值。支撑基部通过测量后爪中心垫的核心间距离来确定。肢体旋转由通过第三趾的印迹与代表跖趾关节的印迹的线以及通过平行于行走方向的中心垫的线的相交形成的角度来定义。步幅长度在每一侧的连续两个印迹的中心垫之间测量。
为了包括在早期术后测试时期中不完全重量支撑的动物，还使用了4分评分系统：对于不变的背部步进或后肢拖动，即没有足迹可见，给出0分；如果动物在至少三个足迹中有至少三只脚趾的可见脚趾印，则计数1分；如果动物显示与其自身基线值相比超过两倍数值的脚外旋或内旋，则给予2分；如果动物没有显示脚趾拖动的迹象而是脚部旋转，则记录3分；如果动物没有显示外旋或内旋的迹象(小于基线值角度的两倍)，则评分为4分。在安乐死之前的1到2周开始，测试这些动物5天的时间。
用于评估神经前体细胞移植对sci大鼠的影响的第四项行为测试是梁平衡。将动物放置在一个狭窄的梁上，并且评价维持平衡和/或穿过梁的能力。在安乐死之前的1到2周开始，测试这些动物5天的时间。狭窄的梁测试根据hicks和d'amato的描述进行。三种类型的梁用作狭窄通路：矩形2.3cm宽的梁，矩形1.2cm宽的梁和直径2.5cm的圆形钉。所有梁长1m，并距离地面30cm。训练后，预计正常大鼠能够以小于三个脚步穿过水平梁。偶尔它们的脚从梁上滑下时，动物精确地恢复并重新定位。
评分系统用于评估动物穿过梁的能力：0被计数为完全不能在梁上行走(动物立即摔倒)，如果动物能够穿过梁的一半评分0.5，对穿过整个长度给出1分，当用后肢步进是部分可能的时1.5分，并且正常重量支撑和准确脚放置注解为2分。如果所有三个梁的评分相加，可以达到最多6分。
用于评估神经前体细胞移植对sci大鼠的影响的最后一项行为测试是斜面测试。将动物放置在可以升高到不同角度的平台上。确定在给定角度保持位置的能力。在安乐死之前的1到2周开始，测试这些动物5天的时间。将动物放置在如所述地构造的可调斜面上(rivlin和tator,1977,jneurosurg.1977oct；47(4):577-81)。斜率每20秒逐渐增加，记录小鼠无法保持其位置持续5秒的角度。对每只小鼠重复测试两次并记录平均角度。在斜面测试中，在损伤之前和再次在损伤后1、7、14和21天，评估从运动障碍的恢复。记录大鼠能够保持自己持续5秒而不坠落的平面的最大倾角。
上述这些测试的每个需要少于5分钟。这些各种测试的设计使得如果动物从测试仪器落下，它们着地在加垫地板上，或者落下的距离足够有限(小于6英寸)，动物不会受到伤害。
实施例14：用本发明的神经前体治疗痉挛
痉挛是脑和脊髓损伤患者的常见紊乱。脊髓损伤患者的患病率为大约65-78％(maynard等人1990)，且永久偏瘫的中风患者的患病率为大约35％(sommerfeld等人2004)。在人脊髓损伤后，在几个月内发生损伤部位尾部的反射性兴奋过度。难治性痉挛也是多发性硬化患者常见的残疾来源。症状包括张力过度、阵挛、抽搐和反射亢进。膀胱痉挛也常见于老年人、妊娠或妊娠后以及更年期的妇女。
虽然尚不完全了解负责痉挛发生的确切机制，但已证明将mge细胞移植到患病区域改善小鼠脊髓损伤模型中的痉挛。(参见例如，u.s.9,220,729和美国专利申请第20130202568号)。类似地，本发明的神经前体细胞群体可用于治疗痉挛。将本发明的神经前体细胞群体移植到sci动物模型中。与接受死细胞/媒介物注射或无注射的对照动物相比，在脊髓灰质中接受神经前体细胞群体的小鼠表现出改善的膀胱功能、较少的不受抑制的膀胱收缩和较少的残余尿。
实施例15：用本发明的神经前体治疗神经性疼痛
除上述实验外，神经前体细胞移植可改善神经性疼痛。具体地，可以使用此前描述(shields等人,2003)的备用神经损伤(sni)模型，将神经元前体细胞移植到使用损伤引起的神经性疼痛的动物模型研究中。这一模型通过横切在动物的一侧的坐骨神经的三个分支中的两个产生，导致延长的机械超敏反应(shields等人,jpain.2003oct；4(8):465-70)。
所有移植对雄性小鼠(6-8周龄)进行。先前描述了zw和zwx小鼠(braz和basbaum,2009,neuroscience.nov10；163(4):1220-32)。为了产生双转基因zwx-npy小鼠，将zwx小鼠与在npy表达神经元中表达cre重组酶的小鼠杂交(defalco等人,2001,science.mar30；291(5513):2608-13)。为了产生per-zw小鼠，将zw小鼠与peripherin-cre小鼠杂交(zhou等人,2002,febslett.jul17；523(1-3):68-72)。
对于移植，通过腹膜内注射氯胺酮(60mg/kg)/赛拉嗪(8mg/kg)麻醉6-8周龄小鼠(未经实验或sni后一周)。在腰的水平进行背部半椎板切除术，扩大以露出腰段脊髓的两段(～1.5–2mm)，然后切开硬脑膜并反射。将含有5×104个神经前体细胞的细胞悬液装入玻璃微量移液管(预先填充有矿物油)中。将微量移液管连接到安装在立体定向仪上的显微注射器。细胞悬液注射靶向于神经损伤同侧的背角。向对照组注射等量的dmem介质。闭合伤口，且允许动物恢复，随后将其返回自己的笼子。在移植后不同时间(1至5周)杀死动物。
机械敏感性通过将动物置于高架丝网格上，并用vonfrey毛发刺激后爪来评估。上下范式(chaplan等人,1994jneuroscimethods.jul；53(1):55-63)用于定义阈值。在手术前每隔一天测试动物3次以确定基线阈值，并且在手术后2天测试动物以评估机械性异常性疼痛的幅度。移植组或介质注射组(对照组)仅包括展示机械缩足阈值下降50％的动物。行为测试在移植或介质注射后第7、14、21和28天发生。对于行为测试，研究者对处理(细胞介质或细胞群体移植)不知情。热痛觉过敏测定(热/冷板、hargreaves和甩尾)也用于测量疼痛敏感性。
还对测试动物进行旋转棒测试和后爪损伤测定，这是一种建立的用于检测小鼠神经性疼痛的测定。对于加速旋转棒测试，训练大鼠在三个时期中保持在旋转棒的旋转轴上，在开始时每个时期进行三次试验，并且在大鼠能够在主轴上停留超过60秒后进行一次试验。旋转杆的加速设置为在5分钟内自动从4增加到40rpm，并且当动物从主轴上落下时试验自动结束。在甩尾测定中，将10μl1％福尔马林溶液(sigma,st.louis,mo)注射到移植侧同侧的介质或神经前体细胞移植小鼠的后爪中。将小鼠对用于退缩或舔注射的后爪(5分钟内)的总时间评分。行为评分由对处理组不知情的实验者完成。
这一移植导致损伤侧同侧的机械阈值(vonfrey)急剧下降。移植后两周(sni后23天)首次检测到对照组和神经前体细胞群体移植组之间的显著差异，这与预测移植的细胞分化为神经元和整合进入宿主回路必需的时间类似。在移植本发明的神经前体细胞后4周，恢复的程度继续改善并且疼痛阈值恢复到损伤前的基线水平。
重要的是，移植的动物都没有表现出运动损伤的迹象。此外，发现两组中的小鼠在观察期间在旋转棒上行走。在后爪损伤测定中，与接受注射介质的小鼠相比，神经前体细胞移植入脊髓灰质导致疼痛减轻。对每个研究组评估五只小鼠，且接受神经前体细胞注射的小鼠与仅介质组相比显示神经性疼痛的统计学显著减少。
将本发明的神经前体细胞注射入sci动物模型的脊髓中时获得类似的结果。sci引起慢性疼痛，包括机械异常性疼痛和热痛觉过敏。在急性、亚急性和/或慢性期损伤后注射入脊髓的神经前体细胞改善慢性神经性疼痛。
实施例16：用本发明的神经前体治疗阿尔茨海默病中的认知缺陷
本发明的方法也可以用于治疗阿尔茨海默病以改善这些患者的学习和记忆损伤。可将神经前体细胞移植入apoe4-ki小鼠的门(hilus)，或移植入家族性阿尔茨海默病(fad)模型，以证明apoe4诱导的认知缺陷以及癫痫发作的拯救，如前所述的(tonglm等人,j.neuroscience34(29):9506-9515)。本发明的神经前体细胞的移植导致移植衍生的gaba能中间神经元在海马中的功能成熟和整合，并拯救成年小鼠中apoe4诱导的认知缺陷。
将14个月龄的雌性apoe4-ki和apoe3-ki小鼠和10月龄的apoe4-ki/happfad小鼠用80μl盐水溶液中的氯胺酮(10mg/ml)和赛拉嗪(5mg/ml)麻醉并维持0.8％-1.0％异氟烷。将神经前体细胞悬液(600个细胞/nl)装入60μm尖端直径、30°斜面玻璃微量移液管针头(nanoject,drummondscientificcompany)中。用0.5mm微钻(foredom,finesciencetools)钻双侧头端和尾端立体定位部位，并在四个部位进行门移植。在每个移植部位，引入估计20,000个神经前体细胞。对照移植小鼠接受等量的热休克死亡神经前体细胞，其通过55℃3分钟和干冰3分钟的4个交替循环、随后离心收集产生。(alvarez-dolado等人,2006,jneurosci.2006jul12；26(28):7380-9.；baraban等人,2009,procnatlacadsciusa.sep8；106(36):15472-7.；southwell等人,2010,science.feb26；327(5969):1145-8)。
为了评估移植的神经前体细胞群体改进阿尔茨海默病模型中的认知的能力，在70-80dpt对细胞移植和对照移植的小鼠进行行为测试。morris水迷宫(mwm)测试在室温水(22–23℃)的池(直径122cm)中进行，在隐藏试验期间，10cm2的平台浸入不透明水表面下方1.5cm处(andrews-zwilling等人,2010,jneurosci.oct13；30(41):13707-17.；leung等人,2012,plosone.7(12):e53569)。在隐藏平台第1-5天(hd1–5)每天四次进行试验训练小鼠来定位隐藏平台，其中hd0是第一天的第一次试验，每次试验最多60秒。每次记忆试验在最后一次学习时期后24、72和120小时平台的不存在下进行60秒。记忆被评估为在学习试验中被包含在平台中的目标象限花费的时间的百分比，与在非目标象限中花费的时间的平均百分比比较。
对于可见的试验，黑色和白色条纹桅杆(15cm高)标记平台的位置。除了在可见试验期间移动平台之外，平台位置和房间布置在整个测定中保持不变。速度通过行进距离除以试验持续时间来计算。使用ethovision视频跟踪软件(noldusinformationtechnology)客观监测表现。
旷场试验通过允许小鼠探索新的、但空的环境来评估适应和一般活动行为(andrews-zwilling等人,2012,plosone.7(7):e40555.)。至少2小时的室内适应后，将小鼠置于用30％etoh清洁15分钟的气味标准化室中。活动行为由sandiegoinstruments的软件监控和分析。高架十字迷宫通过允许小鼠探索开放的、照明区域(开放臂)或隐藏在黑暗的、封闭空间(闭合臂；bien-ly等人,2011,procnatlacadsciusa.mar8；108(10):4236-41)来评估焦虑和探索行为。这里，在至少2小时的室内适应之后，将小鼠置于用30％etoh清洁10分钟的气味标准化迷宫中。通过与motormonitor软件(kinderscientific)连接的红外光电池分析行为。
将神经前体细胞移植入apoe4-ki小鼠的门中，不仅显示了改进这些小鼠中观察到的认知缺陷的能力，而且还显示了在apoe4的存在下产生功能性整合的中间神经元和aβ积累的能力。
实施例17：移植本发明的神经前体细胞群体用于治疗中风引起的损害
使用中脑动脉闭塞(mcao)中风模型测试本发明的神经前体细胞改善具有创伤性脑损伤诸如中风的受试者中的运动和协调的能力。简言之，如先前所述(daadi,m.等人,plosone3(2):e1644；200.)，通过管腔内缝合使sprague-dawley(sd)成年大鼠(275–310g,charlesriverlaboratories,wilmington,ma)经受1.5小时的瞬时mcao。使用提升的身体摆动测试(ebst)来评估mcao后的身体不对称，如先前所述(borlongan,c.v.等人,j.neurosci.15(7)pt.2):5372–5378；1995)。通过尾巴悬吊动物，在20个试验中计数与缺血侧对侧的初始头部摆动的频率，并表示为总数的百分比。研究中使用超过75％偏斜摆动的缺血大鼠。在缺血损伤两周后，将2μl浓度为50,000个细胞/μl的神经前体细胞悬液立体定位移植到损伤的纹状体和皮层内的四个部位。使用经受缺血并移植媒介物的大鼠作为对照。
为了研究神经前体移植影响mcao中风模型中中风损伤侧的重新连接的能力，在神经前体细胞移植后3周，通过将bda注射入右侧感觉运动皮层来标记来源于完整脑半球的轴突。细胞移植后三周，将来自每个移植组和媒介物处理组的三只随机选择的动物麻醉并置于立体定位装置中。在开颅术后，将0.5μl生物素化的葡聚糖胺[bda，10,000分子(mw),molecularprobes,eugeneor；无菌pbs中10％w/v溶液]立体注射到与中风损伤部位相对的感觉运动皮层中。然后闭合头皮，并将动物送回其笼。bda注射后1周将动物处死。将bda标记的末梢的定量分析对在注射部位的标记的人体细胞的总数标准化(详见材料和方法)，揭示了移植侧的增加。
为了确定神经前体移植是否对中风后的运动功能有影响，将测试动物进行两种运动行为测试，即旋转棒测试和ebst。所有动物的基线运动行为评估在缺血损伤前和缺血损伤后2周以及移植后4周进行。对于加速旋转棒测试，训练大鼠在三个时期中保持在旋转棒的旋转轴上，在开始时每个时期进行三次试验，并且在大鼠能够在主轴上停留超过60秒后进行一次试验。旋转杆的加速设置为在5分钟内自动从4增加到40rpm，并且当动物从主轴上落下时试验自动结束。对于ebst，通过尾巴悬吊动物，在20个试验中计数与缺血侧对侧的头部摆动的频率，并表示为总数的百分比，如以上所述的。神经前体移植大鼠的运动和运动协调都有改进，在两种测试中有显著的改善。
为了确定神经前体细胞移植是否对中风或创伤性脑损伤引起的癫痫发作具有影响，进行癫痫发作频率、严重程度和持续时间的视频/eeg监测。如上所述，神经前体移植动物的癫痫发作活动明显减少。
实施例18：移植神经前体细胞群体到自闭症模型
本发明的方法也可以用于治疗自闭症谱系紊乱以改善这些患者的行为诸如社交缺陷和学习缺陷。btbrt+itpr3tf/j小鼠(btbr小鼠)是一种充分研究的特发性自闭症模型(defensor,e.b.,pearson等人,(2011).behav.brainres.217,302–308；mcfarlane,h.g.等人,(2008).genesbrainbehav.7,152–163；yang,m.,等人(2012),physiol.behav.107,649–662.)。与对照品系c57bl/6j相比，btbr小鼠的海马内gabaa受体介导的抑制性神经传递水平降低，这可能有助于其自闭症样行为。han等人,neuron2014；81:1282-1289。本发明的神经前体细胞的移植及导致的移植物衍生的gaba能中间神经元在海马中的功能成熟和整合可拯救接受移植神经前体细胞的btbr小鼠的自闭症样行为。
将14个月龄的雌性btbr小鼠用80μl盐水溶液中的氯胺酮(10mg/ml)和赛拉嗪(5mg/ml)麻醉并维持0.8％-1.0％异氟烷。将神经前体细胞悬液(600个细胞/nl)装入60μm尖端直径、30°斜面玻璃微量移液管针头(nanoject,drummondscientificcompany)中。用0.5mm微钻(foredom,finesciencetools)钻双侧头端和尾端立体定位部位，并在四个部位进行纹状体移植。在每个移植部位，引入估计20,000个神经前体细胞。对照移植小鼠接受等量的热休克死亡神经前体细胞，其通过55℃3分钟和干冰3分钟的4个交替循环、随后离心收集产生。(alvarez-dolado等人,2006；baraban等人,2009；southwell等人,2010)。
用于测量神经前体细胞移植对btbr小鼠的自闭症样行为的影响的行为测试包括三室社交互动测试，其测量测试小鼠与陌生的小鼠相比新的物体的互动时间，以及旷场测试，其测量焦虑相关行为。接受神经前体细胞移植的btbr小鼠在三室社交互动测试和/或旷场相互社交行为测试中表现出比对照小鼠更高的互动比率、更高的相互互动时间和更频繁的鼻-鼻嗅闻次数。接受神经前体细胞移植的btbr小鼠在旷场试验中也显示出减少的活动过度(测量为向旷场中心移动的总距离)，并减少了刻板环行行为。这些结果表明，增加的抑制性中间神经元活性能够减少btbr小鼠的行为缺陷。
神经前体细胞的移植也能够改善btbr小鼠表现出的认知缺陷。已知btbr小鼠具有受损的恐惧记忆(macpherson,p等人(2008).brainres.1210,179–188)，且可以使用情境依赖性恐惧条件反射来测量与自闭症相关的认知缺陷。btbr小鼠在接受神经前体细胞移植后9周，在恐惧条件反射下对空间情境的短期(30分钟)和长期(24小时)二者的记忆表现改善。
为了在恐惧的不存在下测试空间学习和记忆，进行了barnes圆形迷宫测试，其中小鼠通过学习在外围具有黑暗避难所的孔的位置而快速逃离明亮的照明场。移植后9周的btbr小鼠在反复训练时期后与btbr对照对应物相比显示出显著降低的表现时间。
实施例19：移植神经前体细胞群体到精神病模型
本发明的方法还可以用于治疗精神病紊乱，诸如精神分裂症，以改善这些患者中与神经失调相关的行为。细胞周期蛋白d2敲除(ccnd2-/-)小鼠模型显示与精神病有关的成人神经行为表型相关的皮层pv+中间神经元减少，包括增加海马基础代谢活性，增加中脑da神经元活性，增强对amph的响应，以及破坏招募和依靠海马的认知过程。ccnd2-/-小鼠具有多种神经生理和行为表型，这些表型将被预测由海马去抑制产生，包括增加腹侧盖区域多巴胺神经元群体活性、对安非他命的行为高反应性以及海马依赖性认知损害。参见例如，gilani等人procnatlacadsciusa.2014may20；111(20):7450-5。
将ccnd2敲除小鼠维持在c57bl/6j背景上。神经前体细胞群体如本文所述产生，并加入适当的赋形剂以促进移植。对于对照移植，通过反复冻融周期杀死神经前体细胞。将平均密度为30,000个活细胞/微升的活细胞或对照(杀死的细胞)悬液通过使用连接到纳米注射器的玻璃移液管(50-μm外尖端直径)双侧注射到6至8周龄小鼠的尾腹侧海马ca1中。
在标准照明条件下，在17×17英寸的旷场盒中测量自发性和安非他命诱导的运动活性。将小鼠置于旷场中30分钟，然后通过腹膜内注射安非他命(2mg/kg溶解0.2mg/ml的等渗盐水中)或盐水。再测量行进的距离60分钟。如上所述(同上)使用混合anova设计，以基因型和药物为因素，以及时间(在注射之前或之后)为重复量度。这一分析之后是针对基线和注射后运动分别的药物条件内的基因型的计划的studentt检验比较。情境恐惧条件反射方法从以前的研究改编(例如，saxemd,等人(2006)procnatlacadsciusa103(46):17501–17506；quinnjj,等人(2008)hippocampus18(7):640–654)。
简言之，在训练前1小时使小鼠适应测试室。训练/测试装置是放置在声音衰减室内的具有震动网格地板的室。内室以视觉空间、触觉和气味线索的独特组合为特征，它们共同定义了情境。在训练当天，将小鼠放置在一个情境(“训练情境”)中，并且在300、470、580、670和840秒时呈现由音调(85db,20s持续时间,4.5khz)组成的cs+。在每个音调的最后一秒钟内，通过地板网格传送0.7ma扰动电流(us+)。在最后一次cs-us呈现后的140秒内将小鼠从训练情境中移出。二十四小时后，将小鼠置于新的情境中，并且在300、410、580、670和830秒处呈现音调cs+而无电击。在音调cs+还原测试后六小时，将小鼠放置在训练情境中持续600秒。条件反射的愣住(freezing)，被定义为除呼吸外没有运动，在以下时期被定量：(i)在音调cs+的第一次呈现期间，(ii)在第2-5次cs+呈现的发生情境中。用混合anova分析数据，其中还原阶段作为重复量度和基因型作为受试者之间的因素。
神经前体移植的细胞改进了其运动和运动协调，在两种测试中有显著的改善。
虽然本发明由以很多不同形式的方面满足，但是如结合本发明优选的方面详细描述的，应理解本公开内容应被视为是本发明的原则的示范且不意图将本发明限制为本文例证和描述的具体方面。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题并不能被解释为限制本发明的范畴，因为它们的目的是能够使适当的机构，以及一般公众迅速地确定本发明的一般性质。本文引用的所有参考文献为了所有目的以其整体并入。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则本文列举的特征或要素都不应该被解释为根据35u.s.c.§112,6的手段加功能的限定。