一种海洋低温糖原分支酶基因的克隆及其表达的制作方法

本发明属于酶工程和基因工程领域，具体涉及到一种在低温下仍具有活性与稳定性的海洋低温糖原分支酶基因的克隆与其表达。

背景技术：

淀粉作为原料在工业中的应用，其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖或者寡糖糖浆，这些糖浆随后被用作原料用于如酒精、有机酸、氨基酸等工业生产或直接作为产品用于其他工业领域,淀粉酶作为应用最广的酶制剂之一，其主要用途包括：食品、医药、洗涤、造纸、纺织等领域,淀粉酶能分解淀粉类污垢，使之降解，达到去除的目的。

分支酶是属于α-淀粉酶家族的碳水化合物活性酶，该家族包括水解酶，转糖基酶和异构酶，例如α-淀粉酶，异淀粉酶α-葡糖苷酶，支链淀粉酶，环糊精糖基转移酶和糖原分支酶。分支酶能将一个七糖单位，从一段长于11个葡萄糖残基的糖链非还原端，转移到邻近的糖链上，并以α-1,6糖苷键相连，新的分支点至少距离老的分支点4个葡萄糖残基以上。糖原分支酶(glycogen branching enzyme)催化1,6-糖苷键合成。

基于糖原分支酶独特的α-1,6转糖基化活性，糖原分支酶可以在淀粉相关工业中找到新的应用。在淀粉中存在约18-33％的直链淀粉，由于直链淀粉的低溶解度，淀粉在淀粉降解程序中的最大浓度是有限的。此外，直链淀粉倾向于逆行，导致较低的产品质量和更多的食品变质。糖原分支酶特异性催化直链淀粉的α-1,4-糖苷键，改变其结构并降低其在淀粉中的百分比，因此已经研究了糖原分支酶的几种潜在应用。通过糖原分支酶修饰的淀粉已经应用于造纸的涂布步骤中证明了糖原分支新酶的应用。糖原分支酶可以改变淀粉的结构，从而增加淀粉溶液的溶解度和稳定性。糖原分支酶可以作用于大米淀粉并延缓其逆行，已经发现来自细菌和植物的几种糖原分支酶改善了食品如曲奇饼，蛋糕和面包的质量。

目前主要研究的糖原分支酶为中温和高温酶，但是，在0～20℃活力低，从而限制了糖原分支酶在食品、饲料、纺织和洗涤工业的应用，日本学者和田恭尚曾详细论述了低温糖原分支酶作为食品添加剂的条件，因此，低温淀粉酶的研究开发具有现实的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供了一种在低温下仍具有活性与稳定性的海洋低温糖原分支酶基因。

本发明的目的之二在于提供了该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。

为达到以上目的，本发明通过下述方案实现:

一种海洋低温糖原分支酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列，该基因序列全长1788bp，以ATG为起始密码子，以TGA为终止密码子，GC碱基含量为37％。

所述的海洋低温糖原分支酶基因的蛋白序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该蛋白是595个氨基酸构成的蛋白序列，预测其分子相对质量为69.97kDa。

所述的海洋低温糖原分支酶基因的克隆方法，包括以下步骤为：

(1)、以苏云金芽孢杆菌基因组DNA为模板，以PCR扩增获取糖原分支酶基因CDS区全长序列；

(2)、根据已获取的糖原分支酶基因，与已知序列进行NCBI比对，得到同源序列，并根据同源序列设计合成如下引物：

CTF036Fw1 5’-GATATTGCAGTTTTTCGCAG-3’

CTF036Rw1 5’-GAATTCGCACAGTTACTTAG-3’

CTF036Fw2 5’-GTTTACAATGAATATTCGTC-3’

CTF036Rw2 5’-CACGCATTTCCGATTCCGAT-3’

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)进行PCR扩增获得克隆基因片段和PCR产物纯化，最后测序分析获得所需的基因克隆片段。

所述的PCR扩增的条件为：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分钟，30个循环；72℃5分钟一个循环。

表达上述的海洋低温糖原分支酶基因的方法的具体步骤为：

(1)、PCR扩增糖原分支酶基因1785bp，3’端添加TGA终止子，两侧添加NdeI/Hind III酶切位点，克隆至pCold I载体形成重组质粒。

(2)、将重组质粒转入BL21T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导，表达。

通过实验证实海洋低温糖原分支酶最适温度为15-25℃，15℃和30℃时酶活性分别保留80％和60％以上，在20℃以下是最稳定的；30℃保温1h仍能保留60％的酶活性，因此，该糖原分支酶具备一定的低温特性。

本发明的有益效果：本发明通过苏云金芽孢杆菌菌株能快速，准确的获得活性最适温度为15-25℃的低温糖原分支酶基因，并且获得的基因是一个完整的阅读框，并实现快速高效表达低温糖原分支酶基因，可以大量获取海洋低温糖原分支酶，为研究开发低温糖原分支酶提供基础。

附图说明

图1为温度对糖原分支酶活性的影响，其中，横坐标表示作用温度，纵坐标表示相对酶活；

图2为温度对糖原分支酶稳定性的影响，其中，横坐标表示作用时间，纵坐标表示相对酶活。

具体实施方式

现结合实施例进一步对本发明进行说明。

一种海洋低温糖原分支酶酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列，该基因序列全长1788bp，以ATG为起始密码子，以TGA为终止密码子，GC碱基含量为37％。

所述的海洋低温糖原分支酶基因的蛋白序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该蛋白是595个氨基酸构成的蛋白序列，预测其分子相对质量为69.97Da。

所述的海洋低温糖原分支酶基因的克隆方法，包括以下步骤为:

(1)、以苏云金芽孢杆菌基因组DNA为模板，以PCR扩增获取糖原分支酶基因CDS区全长序列；

(2)、根据已获取的糖原分支酶基因已知序列进行NCBI比对得到同源序列，并根据同源序列设计合成如下引物：

CTF036Fw1 5’-GATATTGCAGTTTTTCGCAG-3’

CTF036Rw1 5’-GAATTCGCACAGTTACTTAG-3’

CTF036Fw2 5’-GTTTACAATGAATATTCGTC-3’

CTF036Rw2 5’-CACGCATTTCCGATTCCGAT-3’

(3)、使用HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)进行PCR扩增获得克隆基因片段和PCR产物纯化，最后测序分析获得所需的基因克隆片段。

所述的PCR扩增的条件为：98℃10秒，50℃10秒，72℃2分钟，30个循环，72℃5分钟一个循环。然后PCR扩增获得基因片段和PCR产物纯化，最后测序分析获得所需的基因克隆片段。

表达上述的海洋低温糖原分支酶基因的方法的具体步骤为:

(1)、PCR扩增糖原分支酶基因1785bp，3’端添加TGA终止子，两侧添加NdeI/Hind III酶切位点，克隆至pCold I载体形成重组质粒。

(2)、将重组质粒转入BL21T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导，表达：

①转化：将重组质粒取0.5ul转入BL21T1R中；使用LB/抗生素Amp(100ug/ml)平板，10ul转化液涂布，37℃O/N培养，Control pCold I进行同样操作；

②培养及诱导：分别挑取单菌落至2ml LB/Amp(100ug/ml)培养基中，37℃O/N培养。在Glass tube中添加5ml LB/Amp(100ug/ml)培养基，分别添加种培养菌液100ul，37℃培养至OD₆₀₀nm值约为0.6，15℃15min，添加100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)50ul(final 1mM IPTG)进行诱导，15℃培养22hr。

③蛋白质抽提：集菌后1.0OD相当的菌体加入160ul PB S悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离。

④抽提液电泳：取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8ul(0.05OD相当)，加入2ul 5×SDS Loading Buffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。

利用不同温度分别对海洋低温糖原分支酶的活性和稳定性作出如下测试：

1、温度对低温糖原分支酶活性的影响

具体实施步骤为：

(1)于无菌条件下将斜面上的菌体转接3环于种子培养基中，20℃，140r/min摇床振荡培养20h后，作为种子液；再将种子液用移液器转接到发酵培养基中，20℃，140r/min振荡培养。定时取样测定发酵液中的酶活力，每个实验做2个平行，结果取平均值。

(2)将发酵液于4℃，8000r/min下离心15min，上清液即作为粗酶液。

(3)取适量粗酶液在不同温度下(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)作用30min，然后测量粗酶液相对酶活。

从图1中可以看出该酶作用的最适温度为15-25℃，15℃和30℃时酶活性分别保留80％和60％以上，可见该酶具备一定的低温特性，在较低温度还能保持较高的酶活。

2、温度对低温糖原分支酶稳定性的影响

具体实施步骤：

(1)于无菌条件下将斜面上的菌体转接3环于种子培养基中，20℃，140r/min摇床振荡培养20h后，作为种子液；再将种子液用移液器转接到发酵培养基中，20℃，140r/min振荡培养。定时取样测定发酵液中的酶活力，每个实验做2个平行，结果取平均值。

(2)将发酵液于4℃，8000r/min下离心15min，上清液即作为粗酶液。

(3))取适量粗酶液在不同温度下(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃)作用下，每隔10min测一次相对酶活，连续测量6次。

图2表示低温糖原分支酶在不同温度下的稳定性，该酶在20℃以下是稳定的；30℃保温1h，仍保留60％的酶活性，可见该酶具备一定的低温特性，属低温型糖原分支酶，有潜力应用于低温条件下淀粉液化加工行业

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连大学

<120> 一种海洋低温糖原分支酶基因的克隆及其表达

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1788

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atgagtgttg ttggggattt taatgagtgg gattatgagc aacataagat gctacaagtg 60

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tatgcgattg aaacgttggc tggtgacgtc attttaaagg cagatccgta tgctgtatat 180

gcagaagtaa gaccgaatac ggcatctgta gtttttgata taaaaggata tgaatggaat 240

gataaaaact ggaatcgtaa gaaaaagaaa aaatcgattt ataaagaagc gatgacagtt 300

tatgaattac attttggttc ttggaaaaag aaagaagatg gaacgctgta ctcttacagg 360

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atgccgcttg ttgagcatcc atatgatcgt tcttggggat accaaggaac gggatattat 480

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aatccagtat ggggaactgt caattttgat ttaggaaaga gagaggtacg taatttctta 720

atttcaaatg cgttattttg gatgagatat ttccatattg atggtttcag agttgatgca 780

gttgcgaaca tgttgtactg gaataaagaa ggacaagagc aaagtaatga gcatgctgtt 840

tcatttttaa gagagttaaa tgaagcagtg tttgcagaag atgaagattt tcttatgacg 900

gcagaagatt caacagcttg gccacttgta acaactccaa cgtatgaagg tgggcttgga 960

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cctgaatata ggaaacacat tcatgagaaa atgacgtttt ctttactata tgcgtactct 1080

gaaaacttca tattaccgct ttctcatgat gaagtcgttc atgggaaaaa gtcgttatta 1140

aataaaatgc caggtgatta ctgggataag tttgctcaac ttcgtttatt atatggatat 1200

ttctttactc acccaggaaa gaagttactt ttcatgggag gagaattcgg acagtttgat 1260

gagtggaaag accttgaaga tttagattgg aatttacatg attttgaaat gcatcgttat 1320

atgcatgatt actttaatga gctcatagca ttgtataagc gctcaaaacc actttggcaa 1380

cttgaccatt cacctgaagg ttttcagtgg attgatgcta ataataatga gcaaagtatt 1440

ttctctttta ttcgccaagg ggataaacaa gaagatgcgt tagttgtcgt atgtaatttt 1500

acgaaagcta catatgataa ctataaagta ggtgtaccag atttcgagta ttataacgag 1560

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FSFIRQGDKQ EDALVVVCNF TKATYDNYKV GVPDFEYYNE ILNSDAQQYG GSGQVNKKRL 540

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