低频低强度超声促进微藻油脂合成的方法与流程

本发明涉及微藻生物能源领域，涉及一种有效提高微藻油脂含量的方法。
背景技术：
：随着全球能源短缺及环境恶化等问题日趋严重，寻找新的清洁可再生能源成为亟需解决的问题之一。生物质能源以其安全、不易造成二次污染、可再生等优势在众多新型能源中脱颖而出，有望取代或部分替代化石能源。而生物柴油作为生物质能源的研究热点，其原料的选择受到了广泛关注。由于微藻可在海水、污水以及滩涂中养殖，具有“不与人争粮，不与粮争地”、光合作用较强能够固定更多的二氧化碳、油脂含量较高等优点，因此，第三代生物柴油以其作为原材料，进行了大量研究。目前生物柴油的瓶颈仍然是成本问题，其中，藻种的油脂含量是制约生物柴油产率的关键性因素之一，有效提高微藻油脂含量依旧是微藻生物能源领域有待解决的技术难题。目前，针对提高微藻油脂含量的研究方向包括营养调控、诱变育种、基因工程等。营养调控主要以对氮、磷元素的调控为主，氮、磷等元素的缺乏能够明显提高微藻藻株的含油率，但是，也会对其生物量造成消极影响，因此，在总油脂含量上提高不明显。通过诱变育种的方式提高藻株油脂含量，能够达到较好的效果，但是，由于其突变的不定向性，具有一定的局限性。而通过基因工程的手段，能够定向增加微藻藻株的油脂含量，但是由于其技术难度较大，受到了限制。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供一种低频低强度超声促进微藻油脂合成的方法。具体方案为：将超声探头浸入培养至对数期的微藻培养液，开启超声对微藻进行超声处理，超声频率为20-50kHz，超声功率为10-30W/L(瓦特/每升微藻培养液)，超声处理时间为15-35min/d(分钟/每天)，相邻两次超声脉冲之间时间间隔为1-6s，总处理时间为0.5-5d(包括间隔)，最好在微藻的对数生长期(第3-5天)连续处理三天；处理后的微藻转移至光照培养箱中培养。其中最佳超声频率为20kHz，最佳超声功率为20W/L，最佳处理时间为30min/d，最佳超声脉冲时间间隔为2s。上述超声探头为超声波生物促进生长仪的超声探头，超声探头进入微藻培养液的深度为约2mm。上述微藻的培养基为BG-11微藻培养基或其他任何微藻培养基。本发明的一个优选方案中，每次超声处理所取微藻培养液的体积为10-500ml。上述微藻为栅藻、小球藻、硅藻、隐甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻和大型藻类等中的一种或多种。本发明的一个优选方案中，处理后的微藻培养温度为0-40℃。微藻油脂的提取方法可为氯仿-甲醇法、索氏抽提法、正己烷-异丙醇法、正己烷-乙醇法和乙醚-石油醚法等。本发明提供的方法利用超声促进微藻传质，增加酶活，用于提高油脂含量及生物量，创新性强、易于操作，可用于促进微藻油脂的积累，同时提高微藻的生物量。本发明采用20kHz的低频超声波，在不破坏生物细胞结构的基础上，增强了细胞膜的通透性，有利于对底物的摄取和代谢产物的积累，其中不仅油脂含量增加了37％，而且葡萄糖利用率提高了24％，细胞干重(生物量)提高了34％，这是由于低频低功率的超声波通过破坏细胞膜的结构或者改变酶分子的空间构象，从而明显地加速微生物代谢速率、提高代谢产物的积累。同时，超声后的微藻细胞经过尼罗红染色在荧光显微镜下能够显示更多的黄色荧光，说明超声波确实能够促进油脂的合成(图1)。附图说明图1为微藻细胞经尼罗红染色后在荧光显微镜下的照片：(a)超声处理前；(b)超声处理后。图2为微藻细胞在超声波处理前后的最终生物量和油脂含量。图3为微藻细胞在超声波处理前后对葡萄糖的利用情况。具体实施方式实施例1-17本发明所用藻种为实验室筛选的栅藻，超声实验均在无菌室中的超净台中完成，温度为室温。为了保持无菌状态，试验时将超声波生物促进生长仪以及超声探头置于超净台内，紫外灭菌25min；超声时，将培养至对数期的微藻培养液从光照培养箱中取出，放置于经紫外灭菌的超净台中；为了使超声均匀的作用于微藻细胞，超声处理开始前首先要将藻液摇匀，然后将经过灭菌的超声探头浸入微藻液约2mm进行超声处理(由于超声探头直径较大，本实验使用体积约为240ml带有透气孔的植物组织培养瓶培养微藻，注意一个样品处理完成后需用酒精棉将探头擦干净，防止样品之间出现染菌的情况)；在微藻生长过程中每隔24h测定一次藻液在680nm波长下的吸光度，用于表征微藻浓度；同时每隔24h测定一次葡萄糖浓度(用于表征微藻底物消耗速率)。当微藻生长至稳定期时(OD680≈8),取50ml藻液，离心后(10000r/m)于105℃下烘干至恒重，即为生物量。再取50ml藻液，利用氯仿-甲醇法(体积比为2:1)对油脂进行抽提，吸取氯仿相后氮吹至有机溶剂全部挥发，恒重后即得到微藻油脂。微藻的油脂含量＝油脂质量/生物量×100％微藻的培养基为BG-11微藻培养基，微藻种类为栅藻，超声总时间(不包括时间间隔)为30min。表1实施例1-17主要参数及实验结果实施例1234567891011121314151617超声频率kHz2030405020304050203040503050204010超声功率W/L1020304050203020202020202020202020超声时间min/d1520253035301525203015352025301520超声间隔s13125612345621246油脂含量(％)2423192223252427262918252926322725从表1可以看出，当处理条件采取实施例15的参数时，微藻油脂含量最高。实施例18-27与实施例15的区别在于表2。表2实施例18-27区别条件及实验结果。当前第1页1 2 3