本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法。
背景技术：
单细胞蛋白(亦称微生物蛋白)，是指细菌、酵母、霉菌和微藻等在适宜条件下利用各种基质培养单细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白。单细胞蛋白所含的营养物质极为丰富，并且氨基酸组分齐全，赖氨酸等必需氨基酸含量较高，还富含维生素，已成为饲料蛋白补充途径之一。
饲料油，也即动物饲料中所添加的油脂(以猪油为主)，主要通过混入饲料供牲畜使用。饲料油可提高牲畜日粮的能量水平，并有助于牲畜对饲料中其它脂溶性营养物质的消化吸收和利用，进而提高牲畜生产性能以及饲料的利用效率。我国的动物饲料油原料来源比较复杂，它更多的来源于生产动植物油的副产品，如油脂厂下脚料、城市餐饮排放的地沟油、酸化油、肠油等，因而在农药残留、重金属、霉菌毒素等标准上较难达标。微生物油脂，又称单细胞油脂，是指由油脂微生物在一定条件下合成并储存在菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油相似，主要为棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等，此外也含有微量γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸等功能性油脂。因此，微生物油脂可作为饲料油的替代品。
产油酵母，是指能够利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源积累大量油脂的酵母。通过调节培养基组成，如培养基碳氮比，可以控制产油酵母细胞中的油脂含量。因此，利用产油酵母同时产单细胞蛋白和微生物油脂在为牲畜提供蛋白质的同时也可以提供油脂，节省了饲料油的添加。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法。本发明解决了为饲料中提供所需蛋白质和解决饲料油原料来源的问题。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法，包括如下步骤：
(1)酵母种子液的制备：取产油酵母接种于YEPD液体培养基中，恒温培养，得到产油酵母种子液；
(2)产油酵母同时发酵生产单细胞蛋白和微生物油脂：取步骤(1)中得到的产油酵母种子液按8％～12％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，恒温培养，得到发酵液；
(3)取步骤(2)中得到的发酵液，离心，弃去上清，得到的酵母菌体在104～106℃条件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的单细胞蛋白产品；
(4)酵母细胞中蛋白含量的测定：取步骤(3)中得到的单细胞蛋白产品100～200mg于180～200℃下消化，用凯氏定氮法测定粗蛋白含量；
(5)酵母细胞中油脂含量的测定：按每克干菌体加入10mL浓度为3.5～4.5mol/L HCl，于80～100℃处理30～60min；冷却后按体积比2:1加入氯仿和甲醇的混合溶剂进行萃取，收集氯仿层，减压蒸馏去除氯仿，得到微生物油脂；微生物油脂在50～60℃的真空干燥箱中干燥2～4h，称重；得到的油脂重量占干酵母重量的比值即为酵母的油脂含量(％)。
步骤(1)中所述的产油酵母为发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)或皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)等油脂酵母；优选为发酵性丝孢酵母；
发酵性丝孢酵母(CICC1368)购于中国工业微生物菌种保藏中心，斯达氏油脂酵母(AS 2.1560)和皮状丝孢酵母(AS 2.0571)购于中国科学院微生物研究所。
步骤(1)中所述的YEPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，pH 6.0；115℃灭菌20min；
步骤(1)中所述的恒温培养的条件为27～29℃，150～170rpm恒温培养23～25h；优选为28℃，160rpm恒温培养24h；
步骤(2)中所述的发酵培养基：碳源50～100g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO4·7H2O为0.3～0.5g/L，KH2PO4为1.8～2.2g/L，MnSO4·H2O为0.002～0.004g/L，Cu2SO4·5H2O为0.0001～0.0002g/L，pH 6.0～7.0；115℃灭菌20min；
优选的，所述的发酵培养基：碳源50～60g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO4·7H2O为0.3～0.5g/L，KH2PO4为1.8～2.2g/L，MnSO4·H2O为0.002～0.004g/L，Cu2SO4·5H2O为0.0001～0.0002g/L，pH 6.0～7.0；115℃灭菌20min；
更优选的，所述的发酵培养基：碳源50～60g/L，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，MgSO4·7H2O为0.4g/L，KH2PO4为2.0g/L，MnSO4·H2O为0.003g/L，Cu2SO4·5H2O为0.0001g/L，pH 6.0～7.0；115℃灭菌20min；
所述的碳源为葡萄糖、木糖、粗甘油或木质纤维素水解液等；优选为葡萄糖或粗甘油；
步骤(2)中所述的接种量优选为10％(v/v)；
步骤(2)中所述的恒温培养的条件为27～29℃，150～170rpm恒温培养5～7d；优选为28℃，160rpm恒温培养5d；
步骤(3)中所述的离心的条件为3000～6000rpm下离心5～10min；优选为4000rpm下离心5min。
步骤(3)中所述的烘干优选是在105℃条件下烘干；
一种含微生物油脂的单细胞蛋白产品，通过上述制备方法制备得到。
所述的单细胞蛋白产品中，蛋白含量为8.2％～52.1％，微生物油脂含量为9.7％～56.3％。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明提供利用产油酵母生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法和工艺：菌种选取-培养基的制备-菌种种子液的制备-菌种同时发酵生产单细胞蛋白和微生物油脂。产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的工艺条件：碳源浓度50～100g/L，培养时间5天，初始pH 6.0，蛋白胨1.3～41.0g/L，酵母膏0.5～14.7g/L，发酵后的蛋白含量为8.2％～52.1％，微生物油脂含量为9.7％～56.3％。本发明通过利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂，提高了粗甘油的附加值，同时也开辟了新的饲料蛋白和饲料油源。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例是一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法，具体步骤如下：
(1)称取14.51g麦芽汁琼脂培养基，溶于100mL蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20min。
(2)将购买于中国工业微生物菌种保藏中心的发酵性丝孢酵母菌种(保藏号：CICC 1368)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基，28℃培养2～3天，然后放于4℃条件下保存。
(3)YEPD液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(4)发酵培养基：称取葡萄糖60g，蛋白胨41.0g，酵母膏14.7g，MgSO4·7H2O为0.4g，KH2PO4为2.0g，MnSO4·H2O为0.003g，Cu2SO4·5H2O为0.0001g，溶于1000mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(5)取一环4℃保存的斜面种子于含50mL步骤(3)所得的YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养24h，得到种子液。
(6)取5mL步骤(5)中所得种子液接种于含45mL步骤(4)所述发酵培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养120h，得到发酵液。
(7)取步骤(6)中得到的发酵液，4000rpm下离心5min，弃去上清，得到的酵母菌体在105℃条件下烘干至恒重即得到含一定微生物油脂的单细胞蛋白产品。单细胞蛋白产品的产量为19g/L；得到的单细胞蛋白产品的蛋白含量为50.0％，微生物油脂含量为9.7％；蛋白产量为9.5g/L；油脂产量为1.8g/L。见表1。
单细胞蛋白产品的产量是指每L发酵液中获得的单细胞蛋白产品的质量；
蛋白产量是指每L发酵液中含有的蛋白的质量；
油脂产量是指每L发酵液中含有的油脂的质量。
实施例2
本实施例是一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法，具体步骤如下：
(1)称取14.51g麦芽汁琼脂培养基，溶于100mL蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20min。
(2)将购买于中国工业微生物菌种保藏中心的发酵性丝孢酵母菌种(保藏号：CICC 1368)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基，28℃培养2～3天，然后放于4℃条件下保存。
(3)YEPD液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(4)发酵培养基：称取葡萄糖60g，蛋白胨8.9g，酵母膏3.2g，MgSO4·7H2O为0.4g，KH2PO4为2.0g，MnSO4·H2O为0.003g，Cu2SO4·5H2O为0.0001g，溶于1000mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(5)取一环4℃保存的斜面种子于含50mL步骤(3)所得的YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养24h，得到种子液。
(6)取5mL步骤(5)中所得种子液接种于含45mL步骤(4)所述发酵培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养120h，得到发酵液。
(7)取步骤(6)中得到的发酵液，4000rpm下离心5min，弃去上清，得到的酵母菌体在105℃条件下烘干至恒重即得到含一定微生物油脂的单细胞蛋白产品。单细胞蛋白产品的产量为19.1g/L；得到的单细胞蛋白产品的蛋白含量为29.1％，微生物油脂含量为25.9％；蛋白产量为5.5g/L；油脂产量为4.9g/L。见表1。
实施例3
本实施例是一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法，具体步骤如下：
(1)称取14.51g麦芽汁琼脂培养基，溶于100mL蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20min。
(2)将购买于中国工业微生物菌种保藏中心的发酵性丝孢酵母菌种(保藏号：CICC 1368)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基，28℃培养2～3天，然后放于4℃条件下保存。
(3)YEPD液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(4)发酵培养基：称取粗甘油50g，蛋白胨33.5g，酵母膏11.9g，MgSO4·7H2O为0.4g，KH2PO4为2.0g，MnSO4·H2O为0.003g，Cu2SO4·5H2O为0.0001g，溶于1000mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(5)取一环4℃保存的斜面种子于含50mL步骤(3)所得的YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养24h，得到种子液。
(6)取5mL步骤(5)中所得种子液接种于含45mL发酵培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养120h，得到发酵液。
(7)取步骤(6)中得到的发酵液，4000rpm下离心5min，弃去上清，得到的酵母菌体在105℃条件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的单细胞蛋白产品。单细胞蛋白产品的产量为9.4g/L；所得单细胞蛋白产品的的蛋白含量为52.1％，油脂含量为10.6％；蛋白产量为4.9g/L；油脂产量为1.0g/L。见表2。
实施例4
本实施例是一种利用产油酵母同时生产单细胞蛋白和微生物油脂的方法，具体步骤如下：
(1)称取14.51g麦芽汁琼脂培养基，溶于100mL蒸馏水中，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20min。
(2)将购买于中国工业微生物菌种保藏中心的发酵性丝孢酵母菌种(保藏号：CICC 1368)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基，28℃培养2～3天，然后放于4℃条件下保存。
(3)YEPD液体培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨1g，酵母浸膏1g，溶于100mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(4)发酵培养基：称取粗甘油50g，蛋白胨2.8g，酵母膏1g，MgSO4·7H2O为0.4g，KH2PO4为2.0g，MnSO4·H2O为0.003g，Cu2SO4·5H2O为0.0001g，溶于1000mL蒸馏水中，用5M NaOH调节pH至6.0。115℃灭菌20min。
(5)取一环4℃保存的斜面种子于含50mL步骤(3)所得的YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养24h，得到种子液。
(6)取5mL步骤(5)中所得种子液接种于含45mL发酵培养基的三角瓶中，28℃，160rpm恒温摇床中培养120h，得到发酵液。
(7)取步骤(6)中得到的发酵液，4000rpm下离心5min，弃去上清，得到的酵母菌体在105℃条件下烘干至恒重即得到含微生物油脂的单细胞蛋白产品。单细胞蛋白产品的产量为8.3g/L；所得单细胞蛋白产品的的蛋白含量为27.8％，油脂含量为14.4％。蛋白产量为2.3g/L；油脂产量为1.2g/L。见表2。
不同发酵条件下发酵性丝孢酵母利用葡萄糖同时生产单细胞蛋白和微生物油脂，具体步骤参照实施例1，结果如表1所示。
不同发酵条件下发酵性丝孢酵母利用粗甘油同时生产单细胞蛋白和微生物油脂，具体步骤参照实施例3，结果如表2所示。
表1不同发酵条件下发酵性丝孢酵母利用葡萄糖同时生产单细胞蛋白和微生物油脂
注：条件1：葡萄糖60g/L，蛋白胨41.0g/L，酵母膏14.7g/L，MgSO4·7H2O为0.4g/L，KH2PO4为2.0g/L，MnSO4·H2O为0.003g/L，Cu2SO4·5H2O为0.0001g/L，pH 6.5。除蛋白胨和酵母膏浓度不同外，条件2-5与条件1的培养基组成相同；条件2中蛋白胨和酵母膏浓度分别为8.9和3.2g/L；条件3中蛋白胨和酵母膏浓度分别为3.4和1.2g/L；条件4中蛋白胨和酵母膏浓度分别为2.1和0.8g/L；条件5中蛋白胨和酵母膏浓度分别为1.6和0.6g/L。
表2不同发酵条件下发酵性丝孢酵母利用粗甘油同时生产单细胞蛋白和微生物油脂
注：条件1：粗甘油50g/L，蛋白胨33.5g/L，酵母膏11.9g/L，MgSO4·7H2O为0.4g/L，KH2PO4为2.0g/L，MnSO4·H2O为0.003g/L，Cu2SO4·5H2O为0.0001g/L，pH 6.5。除蛋白胨和酵母膏浓度不同外，条件2～5与条件1的培养基组成相同。条件2中蛋白胨和酵母膏浓度分别为7.2和2.6g/L；条件3中蛋白胨和酵母膏浓度分别为2.8和1.0g/L；条件4中蛋白胨和酵母膏浓度分别为1.7和0.6g/L；条件5中蛋白胨和酵母膏浓度分别为1.3和0.5g/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。