产油酵母与芽孢杆菌混合发酵降解木质纤维素生产脂肪酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种产油酵母和芽孢杆菌混合发酵降解木质纤维素生产脂肪酸的方法：将秸秆或者木屑粉碎成较细颗粒，然后将粉碎后的木质纤维素原料用稀碱处理，使其完全溶解；将培养好的芽孢杆菌离心并用生理盐水洗2次，完全除去碳源成分，转接到含有木质纤维素的发酵培养基中培养，时间为96-144h；在培养96h后将产油酵母接种到发酵培养基中继续发酵96-144h；培养结束后离心收集细胞，破壁提取生物油脂。本发明的优点在于，与其他工艺相比，本研究能够在较低能耗下生产微生物油脂，并且扩大了原料来源。
【专利说明】产油酵母与芽孢杆菌混合发酵降解木质纤维素生产脂肪酸 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物降解木质纤维素生产脂肪酸的方法，尤其是一种产油酵 母与芽孢杆菌混合发酵降解木质纤维素生产脂肪酸的方法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是多种复杂高分子有机化合物组成的复合体，主要由纤维素、半纤维 素和木质素3种主要的聚集体以及一些可溶于极性或弱极性溶剂的提取物组成，木质素和 半纤维素以共价键形式结合将纤维素包围起来，形成坚固的天然屏障，所以在直接水解过 程中木质纤维素很难降解。另外，对发酵和后续水解有害的抑制物将会在木质素的水解过 程中产生，而纤维素本身存在复杂的结晶结构，所以木质纤维素直接水解的效果较差，能够 降解木质纤维素素的微生物主要是真菌如：白腐菌、褐腐菌、软腐菌。还有一些细菌，如一些 放线菌及杆菌和梭菌等。
[0003] 微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、 碳氢化合物等碳源，在菌体内所产生的脂肪类化合物。微生物生产油脂具有油脂含量高、生 产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点，而且可以通过各种人工方法，使微生物产生 高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 和类可可脂（CBE)等具有特殊功能的油脂。
[0004] 对于大多微生物来说，生长所需的最适碳源一般都为葡萄糖，因此利用葡萄糖作 为碳源对产油酵母进行的研究已经有很多，并且其菌体中油脂含量最高可达到80%，但大 规模的利用葡萄糖进行微生物油脂生产的成本较高，经济可行性低。因此，为了实现微生物 油脂的工业化生产，利用农业秸杆以及林木废弃物等富含木质纤维素的材料来生产油质是 一个可行的方法。本文发明人通过长期研究，发现产油酵母和芽孢杆菌混合发酵能够高效 利用木质纤维素素作为碳、氮源来积累脂肪酸，这将是木质纤维素素资源利用的一条意义 重大的研究途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用木质纤维素生产脂肪酸的方法，尤其是提供产 油酵母和芽孢杆菌混合发酵利用木质素生产脂肪酸的途径。通过芽孢杆菌Bacillus Iigniniphilus对木质纤维素中的木质素进行降解，打破木质纤维素的结构，使纤维素和 半纤维素暴露出来，然后产油酵母可以利用纤维素和半纤维素作为碳源进行油脂合成。本 发明团队人员长期进行产油酵母降解木质纤维素的研究，发现产油酵母对木质纤维素的降 解率可高达25%-37%，是一条行之有效的新能源开发途径。
【具体实施方式】
[0006] 本
【发明内容】
可通过以下实施例来具体说明。
[0007] 实施例I 种子罐培养 本实施例所用的种子罐培养基配方如下： 采用5L发酵罐作为种子罐，配制3L发酵液。
[0008] 葡萄糖 l〇g/L，酵母提取物 5g/L，尿素 lg/L，（NH4 )2S04 I. 5g/L， MgSO4 · 7H20 I. 5g/L，Na2HPCM · 12H20 9g/L，KH2PCM I. 5g/L。除葡萄糖外将培养基其 他成分于121°C条件下灭菌20min，葡萄糖单独于115°C灭菌20min。接种量为10%，产油酵 母培养条件：初始 ρΗ7· 0±0· 02, 30°C，200rpm，培养 24h。
[0009] 芽孢杆菌培养条件：初始ρΗ9· 0±0· 02, 30°C，200rpm，培养24h。
[0010] 扩大培养 本实施例采用的发酵培养基各组分含量如下： 木质纤维素 15g/L，尿素 lg/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，CaCl2 · 2H20 0· 02g/L，FeSO4 · 7H20 0· 5g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 4g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，H3BO3 0· 015g/L，NiCl2 · 2H20 0· Olg/ L，EDTA 0· 25g/L，CoCl2 · 6H20 0· 05g/L，CuCl2 · 2H20 0· 005g/L，Stock A 溶液 lml/L, I. OM 的磷酸缓冲溶液35. 2ml/L Stock A 溶液配方：NaMoO4 · 2H20 2g/L，FeNa · EDTA 5g/L I. OM 的磷酸缓冲溶液配方=KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L 将种子罐发酵所得的培养液离心收集到的芽孢杆菌菌体转入配制好的培养基中进行 扩大培养。培养参数设定：301：，200印111，？!19.0±0.02，通气量0.5-111，培养9611，然后调整 PH到7.0,接种产油酵母， 培养过程中实时测定木质纤维素含量，用紫外分光光度计测定在波长205nm吸收值， 用3%硫酸做参比。
[0011] 公式：OD值/110*木素溶液的稀释倍数当木质纤维素浓度低于3g/L时，及时向 发酵罐中补料使得浓度维持在15g/L。
[0012] 实施例2 (测定产油酵母细胞干重）取上述实施例2结束后的发酵液lml，在 IOOOOrpm下离心lOmin，用水洗涤生物质沉淀两次，并在40°C下恒温干燥24h，通过重量分 析确定生物质。
[0013] 实施例3 (酸热法提取酵母细胞内油脂） 取上述实施例3制得的干菌体lg，加入IOmL浓度为4mol/L的盐酸 震荡混匀 20°C条件下静置Ih 沸水水浴8-10min 室温冷却30min 溶液加入分液漏斗，加入5ml无水乙醇 加25ml氯仿：甲醇（2:1)混合液萃取酵母胞内油脂 收集下相的有机层，氮气流氛围下在旋转蒸发器中蒸发含有脂质的下相，回收油脂，称 重。
[0014] 实施例4 将实施例1中木质纤维素浓度改变为5g/L、15g/L、20g/L，培养基其他组分均不作改 变，分别进行实施例1到实施例3的操作，记录并分析数据。
[0015] 下面表1为不同木质纤维素浓度下发酵，产油酵母的细胞干重、油脂重量及菌体 含油量。
[0016] 表 1 不同浓度木质素条件下产油酵母菌体干重，油脂重量及菌体含油量
【权利要求】
1. 一种产油酵母和芽孢杆菌混合发酵降解木质纤维素的生产油脂的方法，其特征在于 产油酵母和能够降解木质素的芽孢杆菌混合发酵。
2. 根据权利要求1所述利用木质纤维素生产脂肪酸的产油酵母为海洋酵母（ Kodamaea ohmeri )、类丝抱酵母（Trichosporonoides spathulata),皮状丝抱酵 母（Trichosporon cutaneum)等油脂产量较高的酵母，所用芽孢杆菌为能够降解木质素的 嗜木质素芽孢杆菌（Bacillus ligninphilus)。
3. 根据权利要求1和2所述的产油酵母和芽孢杆菌混合发酵利用木质纤维素生产脂肪 酸的方法，其特征在于，具体步骤为： 将結杆或者木屑粉碎成较细颗粒； 将粉碎后的木质纤维素原料用稀碱处理，使其完全溶解； 将嗜木质素芽孢杆菌用ph为9的LB培养基试管活化，接入种子培养基，种子培养基为 葡萄糖培养基； 将芽孢杆菌离心并用生理盐水洗2次，完全除去碳源成分，转接到含有木质纤维素的 发酵培养基中培养，时间为96-144h ; (5)在培养96h后将产油酵母接种到发酵培养基中继续发酵96-144h，培养结束后离心 收集细胞，破壁提取生物油脂。
4. 根据权利要求3步骤1所述，木质纤维素的原料为农业秸杆以及木屑，其中农业秸杆 包括小麦，水稻，高粱、玉米等，其中以高粱玉米等秸杆为佳，所述木屑以软木屑为佳。
5. 根据权利要求3步骤1所述，秸杆或者木屑颗粒要求40-80目，以80目以上为佳。
6. 根据权利要求3步骤2所述，所用稀碱以NaOH为佳，其浓度在1-5%。
【文档编号】C12R1/645GK104372062SQ201410589034
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】朱道辰, 谢长校, 陈焱 申请人:镇江拜因诺生物科技有限公司