一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株。本发明利用菌体通过尼罗红染色后与产油指示菌对比荧光强弱的方法进行产油菌株的筛选，对获得的产油菌株进行碳代谢分析，获得可利用廉价碳源糖蜜的产油酵母菌株。本发明还利用制备原生质体后紫外诱变的技术选育出产量提高的突变株。本发明为发酵生产微生物油脂提供了新的菌种来源，且其突变菌株可用于工业生产。
【专利说明】一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株
【技术领域】
[0001]本发明属于生物能源【技术领域】，特别涉及一种可利用廉价碳源糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株。
【背景技术】
[0002]某些微生物在一定条件下能将碳水化合物、碳氢化合物以及普通油脂等作为碳源转化为菌体内大量储存油脂，且储存的量超过生物量的20%，便可称为产油微生物(Oleaginous microorganisms)。产油微生物主要有酵母、霉菌、丝状真菌、藻类和细菌等,其中真核的酵母、霉菌和藻类合成的甘油三酯与植物油脂组成相似，而原核的细菌则合成特殊脂类，因此己报道的产油微生物以酵母菌和霉菌类真菌居多。
[0003]油脂既是维持和构成生命的基本物质之一，也是重要的工业原料，其应用价值非常广泛。传统的油脂资源主要来源于动植物，能源油主要来源于矿物资源。随着人口的增长、社会的进步，油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐，特别是随着日益严重的环境污染与全球性能源短缺，被迫寻求开发新型油脂资源及可再生清洁能源。随着生物科技的快速发展，人们对微生物油脂的研究也在逐步深入，利用微生物发酵法生产油脂为油脂资源的开发提供了一条新途径。
[0004]微生物油脂在脂肪酸组成上与许多植物油脂的成分相似，富含不饱和的长链脂肪酸，是生产生物柴油的潜在原料。产油脂微生物可以利用食品工业生产的废弃物生产油脂以及农副产品等可再生资源，不仅降低了生产成本，而且提高了原料及废弃物附加值，实现了废弃物的资源化。
[0005]因此开展微生物油脂的研究对解决人类面临的人口增长、人类健康、资源短缺、环境恶化等现实问题具有重要的意义。本发明正是从解决现实的问题出发，获得了可利用廉价碳源糖蜜高产油菌株。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株，该产油酵母菌株的产油率达百分之四十以上。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种产油酵母菌株的突变株，其产油率比原始菌株提高20%。
[0008]本发明的再一目的在于提供所述产油酵母菌株的筛选方法及制备所述产油酵母菌株的突变株的制备方法；所述突变株的制备方法工艺简单，易于工业化。
[0009]本发明的产油酵母菌，分类命名为近平滑假丝酵母2A00015Candidaparapsilosis2A00015，2013年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2013354。
[0010]本发明的产油酵母菌从海洋来源的真菌中筛选得到，其来源于东太平洋飩鱼腮中。其筛选方法具体为:将从太平洋来源的酵母在添加尼罗红的培养基中培养后，通过与指示菌对比荧光强弱的方法筛选出产油酵母菌2A00015。通过26S rDNA D1/D2序列扩增技术对产油酵母菌2A00015进行鉴定，确定为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，其为一株新高产油酵母菌，命名为近平滑假丝酵母2A00015 (Candida parapsilosis)。
[0011]本发明利用尼罗红与胞内油脂成分结合后在紫外光照射下发出荧光且荧光强弱与油脂含量相关的原理。通过在添加尼罗红的培养基中培养酵母，并观察菌落荧光强弱的方法对深海酵母进行产油脂菌株筛选。本发明的筛选方法简单易于操作。
[0012]通过碳代谢分析，发现本发明的近平滑假丝酵母2A00015可利用廉价碳源废糖蜜产油脂。以廉价糖蜜作为底物，对本发明的近平滑假丝酵母2A00015进行发酵培养，尼罗红染色后用快速荧光定量检测油脂含量，计算获得产油率达到44.18%。
[0013]通过对近平滑假丝酵母2A00015制备原生质体后紫外诱变，获得了提高产油量的突变菌株。该突变菌株分类命名为近平滑假丝酵母2A00015/25Candidaparapsilosis2A00015/25，2013年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCN0:M2013271。本发明的近平滑假丝酵母2A00015/25的产油率为64.06%，比原始菌株提高了 20%。
[0014]本发明近平滑假丝酵母2A00015/25通过如下方法制备得到:首先利用近平滑假丝酵母2A00015菌体酶解制备获得原生质体，然后将制备好的原生质体在黑暗条件下在紫外光照射下进行诱变，诱变后恒温培养4-5天，筛选获得近平滑假丝酵母2A00015/25。所述诱变方法工艺简单，易于工业化。
[0015]本发明获得以下有益的效果:
[0016]1、本发明利用菌体通过尼罗红染色后与产油指示菌对比荧光强弱的方法进行产油菌株的筛选，对获得的产油菌株进行碳代谢分析，获得可利用廉价碳源糖蜜的高产油菌株近平滑假丝酵母2A00015。产油率高达44.18%。
[0017]2、本发明通过制备近平滑假丝酵母2A00015原生质体后紫外诱变的方法，获得高产油菌株的突变株，其产油率比原始菌株提高了 20%,并且诱变方法简单，具有明显的工业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1近平滑假丝酵母2A00015突变株生长及产油情况。
【具体实施方式】
[0019]以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0020]实施例1筛选近平滑假丝酵母2A00015
[0021]PYG培养基:葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5.0g、琼脂粉15g，人工海水1000ml，pH自然。
[0022]筛选的酵母分离自太平洋航行中所采集的海水、生物及沉积物样品；其中2A00015酵母分离自东太平洋飩鱼腮。
[0023]PYG培养基灭菌后冷却至60°C左右后添加尼罗红贮存液1.0mg/mL (Nile/DMSO),使其最终浓度达到0.5 μ g/mL，倒入一次性平板，待平板完全冷却凝固后将所要筛选的酵母接种到平板，并在各平板上接入指示菌-皮状丝孢酵母(Trichosporn cutaneum)2.571 (购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。避光室温培养3-4天后置于波长为280-300nm紫外灯下观察，若有橙色荧光出现则为产油脂菌株，对比指示菌的荧光强度可粗略获知油脂含量高低。
[0024]通过上述筛选方初步获知编号2A00015酵母为高产油脂菌株，应用26SrDNAD1/D2序列扩增技术对2A00015进行菌种鉴定，2A00015为近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis,为一株新高产油酵母菌，命名为近平滑假丝酵母2A00015 (Candidaparapsilosis)。2013年7月21日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为:CCTCCM2013354。
[0025]酵母2A00015的具体鉴定方法如下:
[0026]采用改进的CTAB法抽提酵母2A00015的染色体DNA，体提取方法如下:
[0027]I)接种已纯化的酵母2A00015至5mLPYG液体培养基中，经摇床过夜培养后，取ImL培养物经8000r/min离心5min,收集菌体,用无菌水洗漆3次；
[0028]2)吸取400 μ L CTAB抽提液，加入β -巯基乙醇8 μ L(终浓度为2%)，预热至65°C ；
[0029]3)收集的菌体经_70°C冷冻30min后，迅速加入预热的抽提液，65°C保温45_60min ；
[0030]4)加入等体积的酌.:氯仿:异戍醇(25:24:1),混匀，13000r/min离心20min,将上层水相移入新管；此步骤重复两次；
[0031]5)加入0.6倍体积异丙醇，于4°C中沉淀20min ; 10000r/min，离心1min,
[0032]去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干；
[0033]6 )以25 μ L无菌DDW溶解沉淀，-20 V保存备用。
[0034]提取结果显示染色体DNA大小在22kb左右，DNA条带清晰，纯度和浓度较高可直接用于PCR反应。以提取的染色体DNA为模板，选用酵母通用引物NLl及NL4，对26S rDNAD1/D2区的一段核糖体DNA进行PCR扩增。其反应体系及条件如下:
[0035]PCR反应体系:
[0036]
【权利要求】
1.一种产油酵母菌株，其特征在于:所述菌株为近平滑假丝酵母2A00015 (Candidaparapsilosis)，其微生物菌种保藏号为CCTCC M2013354。
2.一种产油酵母菌株的突变株，其特征在于:所述突变株为如权利要求1所述的近平滑假丝酵母2A00015的紫外诱变突变株。
3.如权利要求2所述的产油酵母菌株的突变株，其特征在于:所述突变株为近平滑假丝酵母 2A00015/25 (Candida parapsilosis)，其微生物菌种保藏号为 CCTCC M2013271。
4.如 权利要求1所述的产油酵母菌株的应用，其用于产油脂。
5.如权利要求2或3所述的产油酵母菌株的突变株的应用，其用于产油脂。
【文档编号】C12N1/16GK104046571SQ201310618217
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】钟添华, 骆祝华, 叶德赞, 黄翔玲, 林义, 胡艳丽 申请人:国家海洋局第三海洋研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会