一种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株进行分类的方法。该方法具体步骤是：首先，分别对多株沙门氏菌菌株进行培养，再提取菌株细胞，再获取菌株细胞内的脂肪酸种类和脂肪酸的含量，然后根据多株沙门氏菌的脂肪酸脂肪酸种类和脂肪酸的含量绘制沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱；最后，采用上述方法获得待测沙门氏菌菌株的脂肪酸种类和脂肪酸的含量并与沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱进行比较，从而对待测沙门氏菌菌株进行分类。采用本发明的方法使得沙门氏菌菌株的分类更加精准、分类速度更快、并且应用成本低。
【专利说明】—种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株进行分类的方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，也是导致我国食源性疾病的主要病原体之一。据估计在中国将近22.2%的食源性细菌爆发是由沙门氏菌引起的。因此，对食物中毒主要病原菌沙门氏菌的分型，研究其相关性，以达到准确溯源，从而快速有效的控制由其引起的食物中毒。 [0003]目前，用来区分沙门氏菌的方法有许多种，主要包括抗生素敏感试验、噬菌体分型、血清型分类、多位点酶电泳(MLEE)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、扩增片段长度多态性(AFLP)和多位点序列分型(MLST)。除此之外，近年来，化学分类学特别是脂肪酸的化学分类学研究在细菌分类学方面也具有良好的分辨能力，以上方法均能够分型菌株，但其准确性、区分能力和再现性不同，将这些技术的特点相结合能够提高追踪流行病学研究的精确性。
[0004]但是，随着食源性致病菌的种类越来越复杂，病菌的成分越来越相似，在现有的分类方法时就病菌的分类显得不够精细、不够准确了。
【发明内容】
[0005]为了克服【背景技术】中的缺陷，本发明提出了一种分类更加精准、分类速度快、应用成本低的利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法。
[0006]本发明的具体技术方案是:
[0007]—种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，其特征在于，
[0008]包括以下步骤:
[0009]步骤I】选取多株沙门氏菌菌株，并获取多株沙门氏菌菌株的脂肪酸信息质谱，其具体是步骤是:
[0010]步骤1.1】将沙门氏菌菌株进行培养获得沙门氏菌菌株细胞；
[0011]步骤1.2】分别对沙门氏菌菌株细胞进行热裂解处理，形成气体产物；
[0012]步骤1.3】将气体产物注入气相色谱柱的系统进行处理，从而获得沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱；
[0013]步骤2】对获得的每株沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱进行谱库检索，确认每株沙门氏菌菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量；
[0014]步骤3】对上述步骤2】的结果采用最短距离法和欧氏距离法进行聚类分析，并绘制出沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱；
[0015]步骤4】将待测试的沙门氏菌菌株，根据上述步骤I】和步骤2】获取菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量，将获得的结果和步骤3】中所获得的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱进行结合并绘制出新的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱，从而确定待测沙门氏菌菌株的类型。
[0016]上述步骤1.1】将沙门氏菌菌株进行培养获得沙门氏菌菌株细胞；其具体步骤是:
[0017]步骤1.1.1】沙门氏菌菌株预培养；
[0018]将沙门氏菌菌株接种于IOmL的肉汤培养基中，保持温度在37°C，并在1580rpm转速的情况下震荡培养18_24h ；
[0019]步骤1.1.2】沙门氏菌菌株进行二次培养；
[0020]提取上述步骤1.1.1】预培养菌液ImL并接种到100肉汤培养基中，在恒温摇床上，37 °C恒温震荡培养18-24h。
[0021]步骤1.1.3】将0.5%的甲醛注入步骤1.1.2】的培养菌液中进行灭活处理；
[0022]步骤1.1.4】将灭活处理后的培养液在转速4000r/min的情况下离心处理2min，收集沙门氏菌菌株细胞；
[0023]步骤1.1.5】用灭菌蒸馏水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行至少两次洗涤，然后使用无菌纯净水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行预悬浮，最后将细胞移到容量瓶内冷冻干燥后保存。
[0024]上述步骤1.2】通过热裂解仪分别对沙门氏菌菌株细胞进行处理，从而形成气体产物；其具体是:使用热裂解仪在600°C的温度下进行裂解处 理12s，喷射温度保持在280°C，从而形成气体产物。
[0025]上述步骤1.3】将气体产物注入气相色谱柱的系统进行处理，从而获得沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱；其具体步骤是:
[0026]步骤1.3.1】设定气相色谱柱的系统内的初始温度为45°C，进样口温度为250°C，载气为氦气，流速36.5cm/s，分流比为30:1，离子源温度220°C，接口温度250°C，光谱扫描范围 20 - 600U ；
[0027]步骤1.3.2】将气体产物注入到设定气相色谱柱的系统内，按照逐渐升温的方式加热。
[0028]步骤1.3.3】对气体产物离子全扫描，获取气体产物中脂肪酸的信息质谱。
[0029]本发明的有益效果是:
[0030]采用本发明在沙门氏菌菌株快速确认方面有很高的利用价值，这种方法同样能够用来确认菌株间的关系，脂肪酸分析法不仅具有和PFGE、血清型分析法同样的检测能力，更具有分类更加精细、分类快速以及良好的经济性等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为4号沙门氏菌菌株的TIC图；
[0032]图2为4号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0033]图3为5号沙门氏菌菌株的TIC图；
[0034]图4为5号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0035]图5为6号沙门氏菌菌株的TIC图；
[0036]图6为6号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0037]图7为14号沙门氏菌菌株的TIC图；[0038]图8为14号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0039]图9为40号沙门氏菌菌株的TIC图；
[0040]图10为40号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0041]图11为41号沙门氏菌菌株的TIC图；
[0042]图12为41号沙门氏菌菌株的TIC局部放大图；
[0043]图13为42株沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱；
[0044]图14为42株沙门氏菌菌株PFGE分离种群系统树状图谱。
【具体实施方式】
[0045]本发明提出了一种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，通过采用该方法不仅具有和PFGE、血清型分析法同样的检测能力，更具有分类更加精细、分类快速以及良好的经济性等优势。
[0046]以下提供了本发明具体的实施过程:
[0047]采用本发明的基础是，选取多株沙门氏菌菌株，并按照多株沙门氏菌菌株构建沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱；
[0048]在该实验中发明人一共选取了 42株沙门氏菌，其中4株来自人类患者，11株来自猪肉，2株来自速食食品，26株来自鸡肉。39株食源性沙门氏菌分离于2007年和2009年，分离于陕西杨凌的超市和农贸市场的零售食品。4株人源菌株分离于2007年和2009年，河南疾病和预防控制中心分离 于痢疾(sporadic diarrheal)患者。所有细菌菌株在使用前均保存在_80°C, 20%(v/v)甘油的大豆酪蛋白培养基(trypticase soy broth, TSB)中。
[0049]利用上述的42株菌株按照以下步骤，构建沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱:
[0050]步骤I】获取42株沙门氏菌菌株的脂肪酸信息质谱，其具体步骤是:
[0051]步骤1.1】将沙门氏菌菌株进行培养获得沙门氏菌菌株细胞，其具体步骤是:
[0052]步骤1.1.1】沙门氏菌菌株预培养；
[0053]将沙门氏菌菌株接种于IOmL的肉汤培养基中，保持温度在37°C，并在1580rpm转速的情况下震荡培养18_24h ；
[0054]步骤1.1.2】沙门氏菌菌株进行二次培养；
[0055]提取上述步骤1.1.1】预培养菌液ImL并接种到100肉汤培养基中，在恒温摇床上，37 °C恒温震荡培养18-24h。
[0056]步骤1.1.3】将0.5%的甲醛注入步骤1.1.2】的培养菌液中进行灭活处理；
[0057]步骤1.1.4】将灭活处理后的培养液在转速4000r/min的情况下离心处理2min，收集沙门氏菌菌株细胞；
[0058]步骤1.1.5】用灭菌蒸馏水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行至少两次洗涤，然后使用无菌纯净水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行预悬浮，最后将细胞移到容量瓶内冷冻干燥后保存。
[0059]步骤1.2】通过热裂解仪分别对沙门氏菌菌株细胞进行处理，从而形成气体产物；
[0060]其具体是:使用热裂解仪在600°C的温度下进行裂解处理12s，喷射温度保持在280°C，从而形成气体产物。
[0061]步骤1.3】将气体产物注入气相色谱柱的系统进行处理，从而获得沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱，其具体步骤是:
[0062]步骤1.3.1】设定气相色谱柱的系统内的初始温度为45°C，进样口温度为250°C，载气为氦气，流速36.5cm/s，分流比为30:1，离子源温度220°C，接口温度250°C，光谱扫描范围 20 - 600U ；
[0063]步骤1.3.2】将气体产物注入到设定气相色谱柱的系统内，按照逐渐升温的方式加热，其具体是:
[0064]具体的做法是:初始温度下保持2min，再以每分钟5°C的速度升高到100°C ;再以每分钟15°C的速度升高到250°C，保持2min ;再以每分钟20°C的速度升高到300°C，并在300°C 保持 2min ；
[0065]步骤1.3.3】对气体产物离子全扫描，获取气体产物中脂肪酸的信息质谱；
[0066]2】对获得的每株沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱进行谱库检索，确认每株沙门氏菌菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量；
[0067]3】对上述步骤2】的结果采用最短距离法和欧氏距离法进行聚类分析，并绘制出沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱；
[0068]4】发明人随机选择了一株或多株待测试的沙门氏菌菌株，根据上述步骤I】和步骤2】获取菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量，将获得的结果和步骤3】中所获得的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱进行结合并绘制出新的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱，从而确定待测沙门氏菌菌株的类型。
[0069]为了反应本次试验的过程，发明人随机抽选的42株沙门氏菌菌株中的4、5、6、14、40,41号沙门氏菌菌株的TIC图和TIC局部放大图，如图1至图12所示，并从上述图纸中获取了 4、5、6、14、40、41号沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱；并利用步骤2】分别对上述每株沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱进行了处理；获得以下表1~表6:
[0070]表1、4号样品定性结果
[0071]
【权利要求】
1.一种利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，其特征在于，包括以下步骤: .1】选取多株沙门氏菌菌株，并获取多株沙门氏菌菌株的脂肪酸信息质谱，其具体是步骤是: . 1.1】将沙门氏菌菌株进行培养获得沙门氏菌菌株细胞； . 1.2】分别对沙门氏菌菌株细胞进行热裂解处理，形成气体产物； .1.3】将气体产物注入气相色谱柱的系统进行处理，从而获得沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱； 2】对获得的每株沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱进行谱库检索，确认每株沙门氏菌菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量； 3】对上述步骤2】的结果采用最短距离法和欧氏距离法进行聚类分析，并绘制出沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱； 4】将待测试的沙门氏菌菌株，根据上述步骤I】和步骤2】获取菌株脂肪酸种类和脂肪酸的含量，将获得的结果和步骤3】中所获得的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱进行结合并绘制出新的沙门氏菌菌株的脂肪酸系统树状图谱，从而确定待测沙门氏菌菌株的类型。
2.根据权利要求1所的利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，其特征在于:所述步骤1.1】将沙门氏菌菌株进行培养获得沙门氏菌菌株细胞；其具体步骤是: . 1.1.1】沙门氏菌菌株预培养； 将沙门氏菌菌株接种于IOmL的肉汤培养基中，保持温度在37°C，并在1580rpm转速的情况下震荡培养18_24h ； . 1.1.2】沙门氏菌菌株进行二次培养； 提取上述步骤1.1.1】预培养菌液ImL并接种到100肉汤培养基中，在恒温摇床上，37°C恒温震荡培养18-24h。 . 1.1.3】将0.5%的甲醛注入步骤1.1.2】的培养菌液中进行灭活处理； . 1.1.4】将灭活处理后的培养液在转速4000r/min的情况下离心处理2min，收集沙门氏菌菌株细胞； . 1.1.5】用灭菌蒸馏水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行至少两次洗涤，然后使用无菌纯净水对收集的沙门氏菌菌株细胞进行预悬浮，最后将细胞移到容量瓶内冷冻干燥后保存。
3.根据权利要求1所的利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，其特征在于:所述步骤1.2】通过热裂解仪分别对沙门氏菌菌株细胞进行处理，从而形成气体产物；其具体是:使用热裂解仪在600°C的温度下进行裂解处理12s，喷射温度保持在280°C，从而形成气体产物。
4.根据权利要求1所的利用全细胞脂肪酸对沙门氏菌菌株的分类方法，其特征在于:所述步骤1.3】将气体产物注入气相色谱柱的系统进行处理，从而获得沙门氏菌菌株脂肪酸的信息质谱；其具体步骤是: .1.3.1】设定气相色谱柱的系统内的初始温度为45°C，进样口温度为250°C，载气为氦气，流速36.5cm/s,分流比为30: 1，离子源温度220 V，接口温度250°C，光谱扫描范围20 - 600U ； .1.3.2】将气体产物注入到设定气相色谱柱的系统内，按照逐渐升温的方式加热。 .1.3.3】对气体产物离子全扫描，获取气体产物中脂肪酸的信息质谱。
【文档编号】C12R1/42GK103589775SQ201310618107
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】张鹏飞, 付骋宇, 蓝海啸, 刘德昊, 王新 申请人:中华人民共和国陕西出入境检验检疫局