高产洛伐他汀枝状枝孢菌Cc‑106菌株及其用途的制作方法

本发明属于微生物生物技术领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株、用途和发酵生产方法。

背景技术：

Lovastatin是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，具有高效、低毒、安全的特点，它能选择性抑制羟甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性，并阻断胆固醇生物合成，近年来在临床治疗方面应用十分广泛。从1979年，日本学者远滕章（Akira Endo）教授从红色红曲霉（Monascus ruber）的培养液中分离出一种能够强力抑制胆固醇合成的活性物质，命名为Monacolin K（莫纳可林K）开始，时隔1年，美国Albert等从土曲霉（Aspergillus terrers）中发现了相似的物质，并命名为Mevinolin，现称Lovastatin。此后发现Lovastatin存在于包括侧耳属（Pleurotus）、茎点菌属（Phoma）、青霉属（Penicillium）、发光类脐菇 （Omphalotus olearius）在内的多种真菌中。

枝孢菌（Cladosporium）属于半知菌，是一类能够产生分生孢子的霉菌；孢子分布广泛，室内和室外空气中含量丰富；菌落褐绿色，经常与曲霉、青霉混淆；但是枝孢菌的菌丝是有颜色的，菌落整体呈现深色。有文章和专利报道，枝孢菌可用于：① 纤维素酶、木质素酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等酶制剂的生产，② 可产生紫杉醇等抗肿瘤、抗细菌真菌等活性代谢产物，③ 可用作微生物农用杀虫剂等。

技术实现要素：

针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供1株高产Lovastatin枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株和发酵生产Lovastatin的方法。

本发明所述枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株，保藏编号为：CCTCC M 2016380，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。

Cc-106菌株的形态特征：在PDA 培养基上28 ℃培养7 d形成较典型的菌落。菌落突点状，褐绿色，菌丝厚绒毛状，较致密，与培养基结合紧密，不易挑起，菌落背面墨绿色（附图1）。显微镜观察菌丝细胞丝状交织，有分隔，壁光滑或粗糙（附图2）。分生孢子梗直立，在中部形成分枝（附图3）；分生孢子簇生或单生，无隔或有隔，分生孢子椭圆形至梭形，单细胞大小差异较大，长×宽平均大小为 5.5 µm×3.5 µm（附图4）。

ITS rDNA基因序列分析结果表明，其长度为525 bp（附图5），与枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）的进化距离最近（附图6）。根据Cc-106菌株的形态特征，结合枝孢菌属（Cladosporium）分种检索表，将Cc-106菌株鉴定为枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）。

Cc-106菌株具有高产Lovastatin、产孢量多、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.0~5.5，培养温度为28 ℃条件下，Cc-106菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，发酵80 h~136 h，Lovastatin产量可达184 mg/L左右（附图7）；用液相色谱-质谱联用技术分离检测发酵液中的Lovastatin，结果表明分离物的结构、分子量与Lovastatin准品一致（附图8）。枝状枝孢菌Cc-106菌株丰富了生产Lovastatin的菌种。

枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株可用于发酵生产Lovastatin。用接种针挑取少量菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3 d；取3个菌饼（直径8 mm）接种于一级种子培养液中，摇床培养3 d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10%加入一级种子液，200 r/min摇床培养2 d成二级种子液；在5 L发酵罐发酵培养液中按20%接入二级种子液，发酵时间为80 h~136 h；发酵培养结束后，取发酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1:4的比例），超声处理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达184 mg/L左右（附图7）。

本发明利用丰富的霉菌自然资源，筛选到1株高产Lovastatin的枝状枝孢菌Cc-106菌株，该菌株具有高产Lovastatin、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为28℃条件下，Cc-106菌株5 L发酵罐液体发酵80 h~136 h，Lovastatin产量可达184 mg/L左右（附图7）。产生Lovastatin的枝状枝孢菌目前还未见有报道，本发明丰富了生产Lovastatin的菌种。

附图说明

图1 Cc-106菌株PDA培养基上培养10 d菌落正面和背面。

图2 Cc-106菌株菌丝和分生孢子梗的显微特征（200 X）。

图3 Cc-106菌株分生孢子梗的显微特征（200 X）。

图4 Cc-106菌株菌株分生孢子显微特征（400 X）。

图5 Cc-106菌株ITS rDNA基因序列（525 bp）。

图6 基于枝孢菌属（Cladosporium）ITS rDNA基因序列建立的Cc-106菌株系统发育树。

图7 Cc-106菌株在5 L发酵罐中的生物量和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。

图8 Cc-106菌株发酵液Lovastatin 液相色谱-质谱联用检测图。

保藏声明

枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株，保藏编号为：CCTCC M 2016380，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2016年7月7日。

具体实施方式

下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

培养基实施例1 高产Lovastatin枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株的分离、筛选和鉴定

① PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，pH 5.5~6.0。用于霉菌菌株的分离纯化和鉴定。

② PD培养液：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%，pH 5.5~6.0。用于高产Lovastatin霉菌菌株的筛选。

实验方法

2.1 霉菌菌株的分离纯化

从不同生境收集的样品（食品、土壤、水果、有机质等）表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，28℃培养24 h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3 d产生孢子后，显微镜观察具有霉菌的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的霉菌纯菌株。将分离纯化获得的霉菌菌株编号保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱备用。

高产Lovastatin霉菌菌株的筛选

用高效液相色谱法（HPLC）检测获得的178株霉菌纯菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。霉菌各保存菌株28℃ PDA平板培养3 d后，用打孔器取3个菌饼（直径8 mm）转接种于PD培养液中，28℃、200 r/min摇床培养5 d。取发酵液1 mL，加甲醇4 mL（按1: 4的比例），超声处理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 离心3 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的青霉菌株。

目的菌株的鉴定

用镊子挑取少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，活化培养3 d；取平皿中1菌饼（直径8 mm）接种于新的PDA培养基平板上，28℃，培养7 d，显微镜观察目的菌株的菌丝、分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，并拍照。提取目的菌株的基因组DNA，扩增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司测序。

实验结果

3.1高产Lovastatin菌株的筛选

通过分离纯化从浙江省各地不同生境收集的样品（食品、土壤、水果、有机质等）中共获178株霉菌纯菌株。

利用高效液相（HPLC）法对178株霉菌纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，结果表明不同霉菌菌株Lovastatin产量存在显著差异。经筛选获1株Lovastatin产量较高的编号为Cc-106菌株，Lovastatin产量为115.2 mg/L，Cc-106菌株分离自霉烂的番茄。

菌株的鉴定结果

Cc-106菌株的形态特征：在PDA 培养基上28 ℃培养7 d形成较典型的菌落。菌落突点状，褐绿色，菌丝厚绒毛状，较致密，与培养基结合紧密，不易挑起，菌落背面墨绿色（附图1）。显微镜观察菌丝细胞丝状交织，有分隔，壁光滑或粗糙（附图2）。分生孢子梗直立，在中部形成分枝（附图3）；分生孢子簇生或单生，无隔或有隔，分生孢子椭圆形至梭形，单细胞大小差异较大，长×宽平均大小为 5.5 µm×3.5 µm（附图4）。

ITS rDNA基因序列分析结果表明，其长度为525 bp（附图5），与枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）的进化距离最近（附图6）。根据Cc-106菌株的形态特征，结合枝孢菌属（Cladosporium）分种检索表，将Cc-106菌株鉴定为枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）。

实施例2 枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株在5 L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产生规律

1 菌株：枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）Cc-106菌株。

培养基

① PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的活化培养。

② PD培养液：马铃薯20%、葡萄糖2%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的一级种子培养。

③ 二级种子培养液：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株的二级种子培养。

④ 发酵培养液：马铃薯20%、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.5%、NaCl 0. 2%、pH 5.0~5.5。用于Cc-106菌株发酵生产Lovastatin。

实验方法

3.1 Cc-106菌株的培养

用接种针挑少量Cc-106菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3 d；取平皿中3个菌饼（直径8 mm）接种于一级种子培养液中，摇床培养3 d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10%接入一级种子液，200 r/min摇床培养2 d成二级种子液；在5 L发酵罐发酵培养液中按20%接入二级种子液进行发酵培养。

菌株菌丝干重的测定

1.5 mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干，称取空离心管质量为m；每管吸取1 mL培养液，在4 ℃，10000 r/min离心10 min，弃上清；加无菌蒸馏水洗3次，10000 r/min离心10 min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重质量为M-m。每隔4 h取3 mL Cc-106菌株发酵液（设3次重复）测定菌丝干重。以发酵时间为横坐标，Cc-106菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。

菌株发酵过程中Lovastatin产量分析

每隔4 h取发酵液1 mL（设3次重复），加甲醇4 mL（按1:4的比例），超声处理20 min，50℃水浴2 h，3000 r/min 离心3 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以发酵时间为横坐标，Cc-106菌株发酵液中Lovastatin产量为纵坐标，绘制Cc-106菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。

Cc-106菌株发酵液中Lovastatin的鉴定

用液相色谱-质谱联用技术分离检测Cc-106发酵液中的Lovastatin结构、分子量等。

实验结果

4.1 Cc-106菌株的生长曲线

每隔4 h取样测定菌丝干重，Cc-106菌株生长曲线见图7。Cc-106菌株0 ~12 h生长速度慢，为迟缓期；16 h~52 h快速生长，菌体量大增，为对数生长期；发酵至56 h后，长势趋于平缓，菌体量达到最高，为稳定生长期，菌丝干重为35.6 g/L；96 h后出现泡沫，进入衰亡期。

Cc-106菌株发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线

每隔4 h取样用HPLC法测定Cc-106菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图7，发酵至80 h后，发酵液中Lovastatin产量基本稳定，最大值为184.1 mg/L。

Cc-106菌株发酵液中Lovastatin的鉴定

用液相色谱-质谱联用技术分离检测发酵液中的Lovastatin，结果表明分离物结构、分子量与Lovastatin准品一致，分子式为C₂₄H₃₆O₅，分子量为404.45（附图8）。