本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种茯苓菌丝体液体发酵方法。
背景技术：
茯苓有着极高的药用价值，其有效成分：包括β-茯苓聚糖(β-Pachyman)即茯苓多糖、茯苓糖和三萜类化合物茯苓酸(Tumulasie acid)、松苓酸(Pmicoic acid)。目前茯苓有效成分的获取，仍然主要依靠茯苓人工培植和野生采集。由于茯苓生长周期较长，产量小，因此难以大量生产。
而目前对茯苓菌丝体液体发酵方法，主要集中在茯苓多糖、茯苓糖的生产。对菌丝体发酵产物药用成分，如茯苓多糖等的提取、纯化、检测，及其药理学作用的研究报道较多，这些工作为研究茯苓酸生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是这些茯苓菌丝体发酵工艺对于提高茯苓三萜含量及产量，没有明显作用。
但对于茯苓液体发酵条件，尤其是培养温度进行细化研究的报道几乎没有。同时考虑到茯苓作为一种药食同源类中药，如果想要促进其在医学界广泛使用的话，必须考虑到发酵的安全性和经济性。因此，有必要开发效果更加理想的发酵方法和条件，提高茯苓在菌丝体阶段三萜类化合物产量。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种茯苓菌丝发酵方法体的，其目的在于通过模拟野外的温度变化，刺激诱导茯苓合成茯苓三萜，提高茯苓三萜累化合物的产量，由此解决现有技术茯苓三萜产量较低，无法规模化生产的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种茯苓菌丝体液体发酵方法，其特征在于，包括种子培养阶段和扩大培养阶段；
所述扩大培养阶段，在28℃至30℃下茯苓菌丝体液体发酵体系，培养5至7天，每天用采用高温或低温处理所述茯苓菌丝体液体发酵体系1至3小时。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其所述高温在32℃至36℃之间；所述低温在0℃至8℃之间。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其每天采用高温或低温处理茯苓菌丝体发酵体系2小时。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其所述茯苓菌丝提液体发酵体系扩大培养阶段培养基为CYM培养基。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其种子液培养阶段采用多级种子发酵培养。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其所述种子液培养阶段具体步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5至7天，获得一级种子液；
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml。
优选地，所述茯苓菌丝体液体发酵方法，其每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
茯苓野外生长环境离不开温度的影响，目前对于温度的研究局限于恒温培养，而未涉及模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响。本发明通过模拟茯苓野外生长环境，进行高低温发酵培养，实现了茯苓胞内三萜含量的高水平积累。能够在无需添加任何外源物质的前提下，廉价、安全、易操作，可显著提高胞内茯苓三萜含量，从而为工业化生产茯苓三萜奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例及对比例茯苓三萜含量提高结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的茯苓菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得茯苓菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的茯苓菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5至7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，121℃灭菌20至30分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20至30分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
在28℃至30℃下茯苓菌丝体液体发酵体系，培养5至7天，优选6天，每天用采用高温或低温处理所述茯苓菌丝体液体发酵体系1至3小时，优选2小时。例如，2小时在0℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在0℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
高温或低温处理，需考虑到刺激效果和茯苓菌丝体耐受情况，以1至3小时为宜，2小时为佳。实验证实，高温处理，温度在32℃至63℃之间，优选36℃；低温处理，温度在0℃至8℃之间，优选4℃，具有明显的诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量的效果，高温处理效果较低温处理更佳。
以下为实施例：
实施例1
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得茯苓菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的茯苓菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，121℃灭菌20至30分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20至30分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在0℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在0℃条件下发酵2小时后22小时在正常温度即28℃至30℃条件下继续发酵，如此循环培养144小时。
实施例2
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在4℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在4℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例3
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在8℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在8℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例4
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在32℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在32℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例5
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在36℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例6
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
3小时在36℃条件下发酵，21小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵3小时，如此循环培养120小时。
实施例7
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
3小时在36℃条件下发酵，21小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在36℃条件下发酵3小时，如此循环培养168小时。
实施例8
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得茯苓菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的茯苓菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，121℃灭菌20至30分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20至30分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如实施例1。
实施例9
一种提高茯苓菌丝体液体发酵的胞内茯苓三萜含量的方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得茯苓菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的茯苓菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养6天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，121℃灭菌20至30分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20至30分钟。
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如实施例1。
对比例1
茯苓菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：采用多级种子培养，使得茯苓菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的茯苓菌丝体液体发酵体系，适应第二阶段的变温处理，具体操作步骤如下：
(1)采用PDA液体培养基活化茯苓菌丝体，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养7天，获得一级种子液；
其中，每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g，121℃灭菌20至30分钟。
(2)将步骤(1)中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5，接种于第一茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养5天，获得二级种子液；
每升所述第一茯苓种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(3)将步骤(2)中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10，接种于第二茯苓种子培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养2天，获得三级种子液；
每升所述第二茯苓种子培养基含有葡萄糖35g，蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾1.0g、七水合磷酸二氢钾0.5g、以及维生素B1 0.05ml，121℃灭菌20至30分钟。
(4)将步骤(3)中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10，接种于CYM培养基中，28℃至30℃，摇床转速120-150r/min培养1天，获得所述茯苓菌丝体液体发酵体系。
每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B1 0.05克，上述成分蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20至30分钟。
扩大培养阶段，采用恒温处理，28℃培养144小时。
实施例6
茯苓菌丝体液体发酵方法，包括以下步骤：
种子培养阶段：如实施例1
扩大培养阶段，采用变温处理，通过改变发酵环境温度，模拟野外环境的高低温变化对茯苓菌丝体发酵胞内茯苓三萜积累的影响来诱导茯苓菌丝体提高茯苓三萜含量，具体操作过程如下：
2小时在40℃条件下发酵，22小时在正常温度即28℃至30℃条件下发酵，然后再在40℃条件下发酵2小时，如此循环培养144小时。
实施例1至9及对比例1、2培养结束后，用布氏漏斗收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5-6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定茯苓三萜含量。取烘干的菌丝粉0.1g，置于试管中加入95％乙醇5ml，在超声破碎仪中超声破碎40min(重复3次)，合并上清，60℃旋蒸，3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次，合并上清，45℃旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中，70℃蒸干后依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml，混匀，70℃水浴25min，取出冰上冷却5min，加入5ml冰醋酸，混合后于550nm处测定吸光度，测定茯苓三萜含量。检测结果见表1。与比较例相比含量增加明显，茯苓三萜含量增加百分比见表1。
表1
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。