专利名称：一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，属于微生物发酵领域。
背景技术：
地衣芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌，能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染等行业。地衣芽孢杆菌是我国20世纪90年代起开发利用的新型微生态制剂，其消长直接影响该制剂的疗效和产量的高低。目前，地衣芽孢杆菌的生产方法按发酵方式可分为固体发酵和液体发酵。但长期以来，无论采用那何种发酵方式，生产成本一直据高不下，工业生产成本难以大幅度降低。国内外已有许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行研究，以求提高产量,降低生产成本。保藏于中国农业微生物菌种保藏中心的三株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)Ll、L2、L3，其中，保藏编号为ACCC11080的地衣芽孢杆菌LI，具有分解木质素，促进生长的功能；保藏编号为ACCC10613的地衣芽孢杆菌L2，能产生杆菌肽，具有抑制细菌性及霉菌性根腐病的功能；保藏编号为ACCC11106的地衣芽孢杆菌L3，能抗梨黑星病。目前，上述三株地衣芽孢杆菌的发酵方式通常为:单株发酵得到L1、L2、L3的发酵液，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而得到最终产品。采用此发酵方式，生产成本较高，且受发酵工艺的影响，批次制得的产品性能并不稳定。为此，开发合理的地衣芽孢杆菌发酵方式，降低生产成本，是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种抑菌能力高、生产成本低的地衣芽孢杆菌混合发酵工艺。`为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)分别为L1、L2、L3,保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，LI的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106 ;包含以下步骤:a)固体斜面培养:将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中:地衣芽孢杆菌LI的培养条件为30 37°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25 30°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28 32°C，24 48h ；b)理化因子诱变:将步骤a)中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，用0.9%的生理盐水制备成浓度为IO8 IO9个/ml (血球计数浓度)的菌悬液；并将制得的菌悬液按致死率70% 90%的处理剂量进行紫外诱变处理，进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30°C培养48h，至长出单菌落；c)摇瓶筛选:无菌条件下，将步骤b)中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30°C培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30°C恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30°C恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力(生物圈)、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；d)根据步骤c)中的二次复筛结果，选取芽孢率彡90%、抑菌圈彡20mm、生物量^ 20%的菌株，用接种针接入斜面培养基，于30°C培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30°C培养22h，得摇瓶种子液；e)发酵培养:将步骤d)中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5°C，罐压:0.03 0.05MPa, pH 值为 6.3 6.6，流量 1:0.3 ~ 1:0.8，转速 300rpm,至芽孢率大于85%时放罐。进一步地:步骤a)、c)和d)中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氢二铵0.1 2.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2.2%，余量为水；pH值为
6.5 7.5o进一步地:步骤b)中所述的紫外诱变处理方式为:将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，振摇608、908、1208、然后于暗光处，301:培养16h。进一步地:步骤b)中所述的亚硝基胍诱变处理方式为:将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合， 于37°C下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。进一步地:步骤b)中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、氯化钠0.5
3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1
0.5%、琼脂1.5 2.2%，余量为水；pH为6.5-7.5。进一步地:步骤c)中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.0%、酵母粉0.2 1.0%、磷酸二氢钾0.2
1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤c)与步骤d)中所述的种子摇瓶培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米浆0.2 L 5%、磷酸二氢钾0.2 L 0%、磷酸氢二钠0.2 L 0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤e)中所述的种子罐培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米浆0.2 1.5%、磷酸二氢钾0.2 1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。进一步地:步骤e)中所述的发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.5%、酵母粉0.2 2.5%、磷酸二氢钾0.2 2.5%、磷酸氢二钠0.2 2.5%、硫酸镁0.02 0.25%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。本发明有益效果在于，相对于常规的单株分别发酵，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而获得产品的方法，本发明通过诱变育种，改变了菌种的成长特性，优化了发酵工艺，使得原本在不同培养条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶，经过一级种子制备、二级种子制备，最后于同一发酵罐内发酵培养，从而降低了生产成本。
图1为了常规单株发酵工艺的流程图；图2为本发明所述三株混合发酵工艺的流程图。
具体实施例方式下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。本发明具体实施方式
中所述的三株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)L1、L2、L3，已保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其中，地衣芽孢杆菌LI的保藏编号为:ACCC11080，其作用为:分解木质素，具有促生长功能；所述的地衣芽孢杆菌L2的保藏编号为:ACCC10613，其作用为:产生杆菌肽，具有抑制细菌性及霉菌性根腐病的功能；所述的地衣芽孢杆菌L3的保藏编号为:ACCC11106，其作用为抗梨黑星病。实施例1菌株筛选1、固体斜面培养将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行培养，其中:地衣芽孢杆菌LI的培养条件为37°C，24h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为30°C，24h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为32°C，24h ；按重量百分比计，所用的斜面培养基组分为:葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉
1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氢二铵0.1%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2。2、理化因子诱变取上述固体斜面培养物，在无菌条件下，用0.9%的生理盐水制备菌悬液，浓度控制在IO8 IO9个/ml (血球计数浓度)；然后将上述菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下,距离30cm,分别振摇60s、90s、120s，然后于暗光处，30°C培养16h ；在无菌条件下，将上述UV处理的菌悬液，用0.9%的生理盐水梯度稀释至KT1 10_6个/ml (血球计数浓度)，涂布于分离平板，于30°C培养48h，然后按照致死率为70% 90%的处理剂量，进行摇瓶筛选；按重量百分比计，所用的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、硫酸锰
0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2 ;根据上述摇瓶筛选结果， 选择正突变的菌株，用pH6.0的磷酸缓冲液制备菌悬液，血球计数浓度为IO7 IO9个/ml ;将Iml上述菌悬液与Iml的200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37°C下作用30min，而后立即用2ml的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应，用0.9%的生理盐水将上述反应液梯度稀释至KT1 10_6个/ml(血球计数浓度)，涂布分离平板，于30°C培养48h，直至长出单菌落，所用的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、硫酸锰
0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2 ;在无菌条件下，将上述单菌落从分离平板上接入斜面培养基，于30°C培养48h，得单菌落斜面，按重量百分比计，所用斜面培养基组分为:葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉
1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氢二铵0.1%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵
0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2。将上述单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30°C恒温振荡培养22h,得初筛种子液；按重量百分比计，所用的种子摇瓶培养基组分为:葡萄糖2.0%、黄豆饼粉1.0%、酵母粉1.0%、蛋白胨0.5%、玉米浆0.2%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.5%，余量为水，pH为7.0，并在120°C下灭菌30min ；然后在无菌条件下，将初筛种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30°C恒温振荡培养48h，按重量百分比计，所用的摇瓶发酵培养基为:葡萄糖4%、黄豆饼粉1%、玉米粉0.8%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5，然后以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量为指标进行初筛，根据初筛结果，选取芽孢率、抑菌圈及生物量比对照株高的菌株进入一次复筛，初筛结果见表1:表I初筛结果
权利要求
1.一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)分别为L1、L2、L3,保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，LI的保藏编号为ACCCl 1080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCCl1106 ;其特征在于，包含以下步骤: a)固体斜面培养:将三株地 衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中:地衣芽孢杆菌LI的培养条件为30 37°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25 30°C，24 48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28 32°C，24 48h ； b)理化因子诱变:将步骤a)中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为IO8 IO9个/ml (血球计数浓度)的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70% 90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30°C培养48h，至长出单菌落； c)摇瓶筛选:无菌条件下，将步骤b)中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30°C培养48h,得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基,于30°C恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30°C恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛； d)根据步骤c)中的二次复筛结果，选取芽孢率>90%、抑菌圈> 20mm、生物量> 20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30°C培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30°C培养22h，得摇瓶种子液； e)发酵培养:将步骤d)中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5°C，罐压:0.03 0.05MPa, pH值为6.3 6.6，流量1:0.3 1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。
2.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤a)、c)、d)中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氢二铵0.1 2.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2.2%、余量为水，pH为6.5 7.5。
3.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤b)中所述的紫外诱变处理方式为:将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，分别振摇60s、90s、120s，然后于暗光处，30°C培养16h。
4.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤b)中所述的亚硝基胍诱变处理方式为:将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37°C下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。
5.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤b)中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖0.2 2.5%、酵母粉·0.1 2.0%、牛肉膏0.5 L 5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、氯化钠0.5 3.5%、硫酸锰0.005 .0.1%、硫酸铵0.5 3.5%、磷酸氢二钾0.1 0.5%、硫酸镁0.1 0.5%、琼脂1.5 2.2%、余量为水，pH为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤c)中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I .3.5%、玉米粉0.8 2.0%、酵母粉0.2 1.0%、磷酸二氢钾0.2 1.0%、磷酸氢二钠0.2 .1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
7.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤c)与步骤d)中所述的种子摇瓶培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米浆0.2 1.5%、磷酸二氢钾0.2 1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为 6.5-7.0。
8.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤e)中所述的种子罐培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖1.0 2.5%、黄豆饼粉.1.0 2.5%、酵母粉0.2 L 0%、蛋白胨0.2 L 0%、玉米浆0.2 L 5%、磷酸二氢钾0.2 .1.0%、磷酸氢二钠0.2 1.0%、硫酸镁0.02 0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
9.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于:步骤e)中所述的发酵培养基，其组分按重量百分比计为:葡萄糖2 4.5%、黄豆饼粉I .3.5%、玉米粉0.8 2.5%、酵母粉0.2 2.5%、磷酸二氢钾0.2 2.5%、磷酸氢二钠0.2 .2.5%、硫酸镁0.02 0.25%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
全文摘要
本发明公开了一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，通过人工诱变育种，及工艺配方、培养条件的优化，使得原本在不同条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶后，经过一级种子液制备、二级种子液制备，最后于同一发酵罐内发酵培养。采用本发明的混合发酵工艺，抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%，节约成本200%。
文档编号C12N1/20GK103146624SQ20131010129
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者张晓红, 刘姝静, 朱慧平, 张中亲 申请人:山西凯盛肥业有限公司