本发明涉及蛋白质提取
技术领域：
，具体而言，涉及一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法。
背景技术：
：牛血加工技术主要指从牛血中提取各种蛋白的工艺，以提供牛血的附加价值，提高其利用率。目前，国内外关于牛血清蛋白的分离纯化方法很多，常见的有离子交换法、凝胶过滤法、亲和层析法、区带电泳法、超速离心法等。这些方法的收率都比较理想，但要求条件苛刻，需要特殊设备，所以难以推广普及，不具有生产意义。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，利用该方法从牛血中提取白蛋白和球蛋白不需要特殊设备，提取得到的牛血清白蛋白和牛血清球蛋白产率高、纯度高、回收率高。本发明的目的之二在于提供一种利用牛血的方法，该方法从牛血中分离出牛血清之后，利用上述从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法提取牛血清白蛋白以及牛血清球蛋白。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，其包括：取牛血清，离心得第一上清液，向第一上清液中加入0.8-1.2倍于第一上清液体积的4-6mM的pH为7.0-7.4的PBS；搅拌下加入(NH4)2SO4至48％-52％饱和度；经冷藏、静置后抽滤得第一滤液和第一沉淀；从第一滤液中提取白蛋白。从第一沉淀中提取球蛋白。一种利用牛血的方法，其包括：从牛血中分离出牛血清。按照上述的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法从牛血清中提取牛血清白蛋白以及牛血清球蛋白。本发明实施例的一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法的有益效果是：本发明提供的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，利用血浆蛋白在一定饱和度的盐溶液中沉淀的原理，采用(NH4)2SO4分级沉淀，并进一步纯化得到牛血清白蛋白，该牛血清白蛋白纯度高，内毒素含量低，符合《中国生物制品规程》的要求；利用饱和(NH4)2SO4分级反复盐析方法，提取牛血清球蛋白，最大限度的祛除高分子量的血浆杂蛋白，提取的牛血清球蛋白纯度高。本发明提供的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法工艺简单，不需特殊设备，适合扩大生产，本发明提供的利用牛血的方法提高了牛血的利用率。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例1中从牛血清中提取白蛋白和球蛋白工艺流程图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法进行具体说明。一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，其包括：第一步：牛血清分离步骤。取牛血，分离出牛血清。优选地，将取得的新鲜牛血清置于35-38℃下保温静置2-4h后，在2-8℃下冷藏12-16h，吸取上层析出的黄色液体，得到牛血清，无菌分装后2-8℃下冷藏备用。优选地，上述牛血为新鲜牛血。第二步：前处理步骤。(1)取上述牛血清，离心得第一上清液，向第一上清液中加入0.8-1.2倍体积的4-6mM的pH为7.0-7.4的PBS。具体地，上述离心为3000-4000r/min条件下离心20-40min。上述冷藏静置为2-8℃下，静置12-16h。(2)搅拌下加入(NH4)2SO4至48％-52％饱和度；经冷藏静置后抽滤得第一滤液和第一沉淀。第一滤液与上述第一沉淀均2-8℃下保留备用。48％-52％饱和度的(NH4)2SO4使球蛋白沉淀，而白蛋白任然溶解于溶液中，通过抽滤的方式将二者分开。第三步：提取白蛋白步骤。取第一滤液，提取得到白蛋白。(1)取上述第一滤液，加入保护剂后加热至变性温度，使杂蛋白变性；抽滤得第二滤液。优选地，上述保护剂为辛酸钠，并且辛酸钠在第一滤液中的终浓度为为0.15％-0.19％(m:v)。加入保护剂，可以在变性过程中保护白蛋白免于变性，留在溶液中。优选地，往第一滤液中加入0.8％-1.2％(v:v)的无水乙醇。该浓度下的无水乙醇起到辅助变性的作用。优选地，变性温度为55-65℃，并且在变性温度下加热20-40min，使杂蛋白充分变性。温度过低达不到除杂蛋白的目的，温度过高，则会使白蛋白变性。(2)往上述第二滤液中加入(NH4)2SO4至60％-64％饱和度，并调节pH至4.4-4.8，静置离心得第二沉淀。具体地，上述静置时间为2-4h，上述离心为3000-4000r/min条件下离心20-40min。(3)溶解上述第二沉淀，透析后离心得到第二上清液，透析浓缩上述第二上清液得到浓缩液。具体地，用4-6mM的pH为7.0-7.4的PBS溶解第二沉淀。(4)将上述浓缩液进行脱盐处理，得到白蛋白溶液，白蛋白溶液经冷冻干燥后得到白蛋白。优选地，上述浓缩液经过SephadexG-50柱进行脱盐处理。第四步：提取球蛋白步骤。取上述第一沉淀，提取得到球蛋白。(1)取上述第一沉淀，溶解第一沉淀，加入(NH4)2SO4至30％-35％饱和度，并调节pH至6.5-7.0，经搅拌、静置离心后得第三沉淀。30％-35％饱和度的(NH4)2SO4溶液中，球蛋白与杂蛋白均析出。(2)溶解第三沉淀，加入(NH4)2SO4至30％-35％饱和度，经搅拌、静置离心后得第四沉淀。(3)溶解第四沉淀，加入(NH4)2SO4至18％-22％饱和度，经搅拌、静置离心后得第三上清液。18％-22％饱和度的(NH4)2SO4溶液中，杂蛋白从溶液中析出，而与球蛋白溶解于溶液中。通过离心得到球蛋白溶液。(4)往第三上清液中加入(NH4)2SO4至30％-35％饱和度，经搅拌、静置离心后得第五沉淀。30％-35％饱和度的(NH4)2SO4溶液中，球蛋白从溶液中析出，离心得到含有球蛋白的沉淀。(5)溶解第五沉淀得到粗球蛋白溶液，粗球蛋白溶液经脱盐处理并冷冻干燥后得到球蛋白。优选地，本步骤(第四步)中，所提及的静置均为静置2-4h。所提及的离心均为3000-4000r/min条件下离心20-40min。溶解沉淀所用的介质均为4-6mM的pH为7.0-7.4的PBS。优选地，本发明提供的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法中所用的(NH4)2SO4均为其饱和溶液。(NH4)2SO4的饱和溶液中，(NH4)2SO4均相分布，加入到蛋白溶液中时，其能迅速反应，析出蛋白。还能避免使用不饱和溶液导致加入的溶液体积过大的不便。需要说明的是，本方法中的第三步：提取白蛋白步骤与第四步：提取球蛋白步骤之间没有绝对的先后顺序之分。即第三步：提取白蛋白步骤与第四步：提取球蛋白步骤可以交换先后顺序。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，该方法的工艺流程如图1所示。具体地，其包括：第一步，进行牛血清分离步骤。取1L新鲜牛血液放置于容器中，在37℃下保温静置3h后，在4℃下冷藏12h，吸取上层析出的黄色液体，得到牛血清，无菌分装后4℃下冷藏备用。第二步，进行前处理步骤。取上述牛血清，3500r/min条件下离心30min，弃去沉淀，得到第一上清液，往第一上清液中加入等体积的pH7.0的5mMPBS，搅拌均匀。搅拌下缓缓加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4的饱和度为50％。搅拌均匀后4℃下冷藏静置12h，然后抽滤得到第一滤液和第一沉淀，第一滤液与第一沉淀均保留备用。第三步，进行提取白蛋白步骤。(1)取上述第一滤液，搅拌下加入辛酸钠至辛酸钠的终浓度为0.17％(m:v)，辛酸钠完全溶解后，搅拌下加入无水乙醇至无水乙醇的浓度为1％(v:v)，水浴加热至60℃，维持30min，并调节pH至6.3，继续搅拌45min。(2)抽滤，弃去沉淀，得到第二滤液。搅拌下往第二滤液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为62％，并在搅拌下加入6mol/LHCl调节pH至4.6，静置2h。(3)3500r/min条件下离心20min，弃去上清液，得到第二沉淀。往第二沉淀中加入pH7.0的5mMPBS至第二沉淀完全溶解，然后将溶解第二沉淀后的溶液转入透析袋(分子截留量为5KDa)于pH7.0的5mMPBS中透析12h，并且每4h换一次5mMPBS。(4)透析后的溶液在3500r/min条件下离心30min，弃去沉淀，得到第二上清液。将第二上清液装入透析袋(分子截留量为5KDa)，并将透析袋埋入聚乙二醇6000(固体)中进行透析浓缩12h，得到浓缩液。(5)将浓缩液上SephadexG-50柱脱盐，用pH7.0的5mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白。第四步，进行球蛋白提取步骤。(1)取上述第一沉淀，加入pH7.0的5mMPBS至第一沉淀完全溶解。搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为33％，并在搅拌下加入1mol/LNaOH调节pH至6.5，静置2h后3500r/min条件下离心20min，弃去上清液，得到第三沉淀。(2)往第三沉淀中加入pH7.0的5mMPBS至第三沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为33％，静置2h后3500r/min条件下离心20min，弃去上清液，得到第四沉淀。(3)往第四沉淀中加入pH7.0的5mMPBS至第四沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为20％，静置2h后3500r/min条件下离心30min，弃去沉淀，得到第三上清液。(4)搅拌下往第三上清液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为33％，静置2h后3500r/min条件下离心20min，弃去上清液，得到第五沉淀。(5)往第五沉淀中加入pH7.0的5mMPBS至第五沉淀完全溶解，溶解第五沉淀所得的溶液上SephedexG-50柱脱盐，用pH7.0的5mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清球蛋白。需要说明的是，本实施例中的第三步：提取白蛋白步骤与第四步：提取球蛋白步骤之间没有绝对的先后顺序之分。在其他实施例中，第三步：提取白蛋白步骤与第四步：提取球蛋白步骤可以交换先后顺序。实施例2本实施例提供一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法。其包括：第一步，进行牛血清分离步骤。取1L新鲜牛血液放置于容器中，在35℃下保温静置2h后，在2℃下冷藏14h，吸取上层析出的黄色液体，得到牛血清，无菌分装后2℃下冷藏备用。第二步，进行前处理步骤。取上述牛血清，3000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得到第一上清液，往第一上清液中加入0.8倍体积的pH7.2的4mMPBS，搅拌均匀。搅拌下缓缓加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4的饱和度为48％。搅拌均匀后2℃下冷藏静置14h，然后抽滤得到第一滤液和第一沉淀，第一滤液与第一沉淀均保留备用。第三步，进行提取白蛋白步骤。(1)取上述第一滤液，搅拌下加入辛酸钠至辛酸钠的终浓度为0.15％(m:v)，辛酸钠完全溶解后，搅拌下加入无水乙醇至无水乙醇的浓度为0.8％(v:v)，水浴加热至55℃，维持40min并调节pH至6.0，继续搅拌30min。(2)抽滤，弃去沉淀，得到第二滤液。搅拌下往第二滤液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为60％，并在搅拌下加入6mol/LHCl调节pH至4.4，静置3h。(3)3000r/min条件下离心30min，弃去上清液，得到第二沉淀。往第二沉淀中加入pH7.2的4mMPBS至第二沉淀完全溶解，然后将溶解第二沉淀后的溶液转入透析袋(分子截留量为5KDa)于pH7.2的4mMPBS中透析，并且每4h换一次4mMPBS。(4)透析后的溶液在3300r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得到第二上清液。将第二上清液装入透析袋(分子截留量为5KDa)，并将透析袋埋入聚乙二醇6000(固体)中进行透析浓缩12h，得到浓缩液。(5)将浓缩液上SephadexG-50柱脱盐，用pH7.2的4mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白。第四步，进行球蛋白提取步骤。(1)取上述第一沉淀，加入pH7.2的4mMPBS至第一沉淀完全溶解。搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为30％，并在搅拌下加入1mol/LNaOH调节pH至6.7，静置3h后3000r/min条件下离心30min，弃去上清液，得到第三沉淀。(2)往第三沉淀中加入pH7.2的4mMPBS至第三沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为30％，静置3h后3000r/min条件下离心30min，弃去上清液，得到第四沉淀。(3)往第四沉淀中加入pH7.2的4mMPBS至第四沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为18％，静置3h后3000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得到第三上清液。(4)搅拌下往第三上清液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为30％，静置3h后3000r/min条件下离心30min，弃去上清液，得到第五沉淀。(5)往第五沉淀中加入pH7.2的4mMPBS至第五沉淀完全溶解，溶解第五沉淀所得的溶液上SephedexG-50柱脱盐，用pH7.2的4mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清球蛋白。实施例3本实施例提供一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法。其包括：第一步，进行牛血清分离步骤。取1L新鲜牛血液放置于容器中，在38℃下保温静置4h后，在8℃下冷藏16h，吸取上层析出的黄色液体，得到牛血清，无菌分装后8℃下冷藏备用。第二步，进行前处理步骤。取上述牛血清，4000r/min条件下离心40min，弃去沉淀，得到第一上清液，往第一上清液中加入等体积的pH7.4的6mMPBS，搅拌均匀。搅拌下缓缓加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4的饱和度为52％。搅拌均匀后8℃下冷藏静置16h，然后抽滤得到第一滤液和第一沉淀，第一滤液与第一沉淀均保留备用。第三步，进行提取白蛋白步骤。(1)取上述第一滤液，搅拌下加入辛酸钠至辛酸钠的终浓度为0.19％(m:v)，辛酸钠完全溶解后，搅拌下加入无水乙醇至无水乙醇的浓度为1.2％(v:v)，水浴加热至65℃，维持20min，并调节pH至6.5，继续搅拌40min。(2)抽滤，弃去沉淀，得到第二滤液。搅拌下往第二滤液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为64％，并在搅拌下加入6mol/LHCl调节pH至4.8，静置4h。(3)4000r/min条件下离心40min，弃去上清液，得到第二沉淀。往第二沉淀中加入pH7.4的6mMPBS至第二沉淀完全溶解，然后将溶解第二沉淀后的溶液转入透析袋(分子截留量为5KDa)于pH7.4的6mMPBS中透析，并且每4h换一次6mMPBS。(4)透析后的溶液在4000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得到第二上清液。将第二上清液装入透析袋(分子截留量为5KDa)，并将透析袋埋入聚乙二醇6000(固体)中透析浓缩12h，得到浓缩液。(5)将浓缩液上SephadexG-50柱脱盐，用pH7.4的6mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清白蛋白。第四步，进行球蛋白提取步骤。(1)取上述第一沉淀，加入pH7.4的6mMPBS至第一沉淀完全溶解。搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为35％，并在搅拌下加入1mol/LNaOH调节pH至7.0，静置4h后4000r/min条件下离心40min，弃去上清液，得到第三沉淀。(2)往第三沉淀中加入pH7.4的6mMPBS至第三沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为35％，静置4h后4000r/min条件下离心40min，弃去上清液，得到第四沉淀。(3)往第四沉淀中加入pH7.4的6mMPBS至第四沉淀完全溶解，搅拌下加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为22％，静置4h后4000r/min条件下离心40min，弃去沉淀，得到第三上清液。(4)搅拌下往第三上清液中加入饱和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4饱和度为35％，静置4h后4000r/min条件下离心40min，弃去上清液，得到第五沉淀。(5)往第五沉淀中加入pH7.4的6mMPBS至第五沉淀完全溶解，溶解第五沉淀所得的溶液上SephedexG-50柱脱盐，用pH7.4的6mMPBS进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到牛血清球蛋白。实施例4本实施例提供应用实施例2中的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法提取牛血清白蛋白以及牛血清球蛋白的纯度、回收率以及提取率进行检测。本方法利用血浆蛋白在一定饱和度的盐溶液中沉淀的原理，采用(NH4)2SO4分级沉淀，并进一步纯化得到牛血清白蛋白。用本方法从5个不同批次的新鲜牛血中分别提取牛血清白蛋白进行检测，检测结果如表1所示。表1从5个批次的新鲜牛血中提取的牛血清白蛋白的检测结果批次纯度(％)回收率(％)198.681.0298.181.3398.980.6498.880.9598.680.2由表1可知，从5个批次的牛血中提取的牛血清白蛋白的纯度均大于98％，并且回收率均大于80％。用鲎试剂法测定提取的牛血清白蛋白中内毒素含量，结果显示，牛血清白蛋白中内毒性含量低于0.25EU/mL，质量符合《中国生物制品规程》的要求。本方法选取饱和硫酸铵分级反复盐析方法，对牛血清中的免疫球蛋白进行分离提取，最大限度的祛除高分子量的血浆杂蛋白(如：纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、IgM等)，得到牛血清球蛋白，使本方法的提取牛血清球蛋白的得率为9.03g/L，回收率为90％。经检测，提取的牛血清球蛋白的纯度大于95％。综上，本发明提供的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法，利用血浆蛋白在一定饱和度的盐溶液中沉淀的原理，采用(NH4)2SO4分级沉淀，并进一步纯化得到牛血清白蛋白，该牛血清白蛋白纯度高，内毒素含量低，符合《中国生物制品规程》的要求；利用饱和(NH4)2SO4分级反复盐析方法，提取牛血清球蛋白，最大限度的祛除高分子量的血浆杂蛋白，提取的牛血清球蛋白纯度高。本发明提供的从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法工艺简单，不需特殊设备，适合扩大生产，本发明提供的利用牛血的方法提高了牛血的利用率。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页1 2 3