一种短型肽聚糖识别蛋白及其制备方法、分离的核酸以及应用和抗菌药物与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种短型肽聚糖识别蛋白及其制备方法、分离的核酸以及应用和抗菌药物。

背景技术：

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)是固有免疫系统中重要的模式识别受体，在机体抵御细菌性病原微生物的免疫反应中发挥重要作用。目前，PGRPs已经在软体动物、节肢动物、棘皮动物和脊椎动物中报道。已报道的PGRPs分子均含有一个或多个由160个氨基酸构成的PGRP结构域。

无脊椎动物的PGRPs主要通过以下几个方面发挥作用：1)识别模式识别受体，激活Toll或免疫缺陷信号通路，调节相关抗菌肽基因的表达；2)诱发酚氧化酶原级联反应，产生黑色素等抗微生物产物来包裹微生物从而限制感染；3)酰胺酶活性，能够水解肽聚糖N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间的酰胺键，将具有活性PGN分子转变为无活性的PGN片段从而发挥其抗菌活性。低等脊椎动物鱼类的GRPs同样具有PGN识别、酰胺酶活性和直接杀菌活性。哺乳动物的PGRPs同样具有PGN识别功能，同时天然动物的短型PGRP和中间型PGRP具有直接杀菌活性。

中国大鲵(Andrias davidianus)为国家二类保护水生野生动物，是世界上现存最大的有尾两栖动物。大鲵为两栖类原始类群，在研究陆生四足类动物系统演化中具有重要的科学价值。近年来，通过我国学者的不懈努力，大鲵人工养殖技术及产业化规模已不断扩大，大鲵已经成为我国中西部地区重要的名特优养殖品种。但随着大鲵养殖规模不断扩大、养殖集约化程度不断提高以及苗、种交流日益频繁，大鲵的病害问题日益突出。大鲵病害的主要病原有细菌、病毒、寄生虫等，而由细菌性病原所引起的疾病最常见，造成的损失也最大。

因此，在大鲵中进行PGRPs抗菌功能研究与应用将为深入开展大鲵病原菌防御机制研究，对保护大鲵种质资源，促进大鲵养殖业的可持续健康发展具有重要的现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种短型肽聚糖识别蛋白，该短型肽聚糖识别蛋白对细胞内细菌和细胞外细菌均具有明显的抑菌作用。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸，其编码上述的短型肽聚糖识别蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种载体，该载体含有上述的用于编码短型肽聚糖识别蛋白的核酸。

本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组细胞或重组菌。

本发明的另一目的在于提供制备上述短型肽聚糖识别蛋白的方法。

本发明的另一目的在于提供上述的短型肽聚糖识别蛋白在制备抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种抗菌药物，其活性成分为上述的短型肽聚糖识别蛋白。

本发明是这样实现的：

一种短型肽聚糖识别蛋白，其氨基酸序列如以下(1)或(2)所示：

(1)SEQ ID NO:1所示；

(2)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换和/缺失所得到的、且具有与SEQ ID NO:1相同活性的衍生序列。

一种分离的核酸，其编码上述的短型肽聚糖识别蛋白。

一种载体，其含有上述的核酸。

含有上述载体的重组细胞或重组菌。

一种制备上述短型肽聚糖识别蛋白的方法，其包括：用编码上述短型肽聚糖识别蛋白的核酸在宿主细胞中表达，纯化后得到上述短型肽聚糖识别蛋白。

上述的短型肽聚糖识别蛋白在制备抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂中的应用。

一种抗菌药物，其活性成分为上述的短型肽聚糖识别蛋白。

本发明提供的一种短型肽聚糖识别蛋白和分离的核酸以及应用、抗菌药物的有益效果是：本发明首次从中国大鲵(Andrias davidianus)克隆出编码短型肽聚糖识别蛋白的cDNA，短型肽聚糖识别蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并通过细胞实验验证了该短型肽聚糖识别蛋白的功能，无论在细胞内、还是在细胞外，该短型肽聚糖识别蛋白均具有较强的抑菌功能，为深入开展大鲵病原菌防御机制研究，对保护大鲵种质资源，促进大鲵养殖业的可持续健康发展具有重要的现实意义。同时，为基于PGRPs开发抗菌药物、免疫增强剂、保健品以及饲料添加剂等潜在的应用领域奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白对胞外迟缓爱德华氏菌增殖的影响结果；

图2为本发明实施例1提供的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白对胞内迟缓爱德华氏菌增殖的影响结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种短型肽聚糖识别蛋白及其制备方法、分离的核酸以及应用和抗菌药物进行具体说明。

本发明首次出人意料地发现来自中国大鲵(Andrias davidianus)的短型肽聚糖识别蛋白(也称作中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该短型肽聚糖识别蛋白无论是在细胞内还是细胞外都具有较强的抑菌效果，同时首次克隆分离出编码该短型肽聚糖识别蛋白的核酸序列。

一方面，本发明提供了一种短型肽聚糖识别蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的发明人通过细胞实验，验证了该短型肽聚糖识别蛋白无论是在细胞内还是细胞外对细菌均有较强的抑制作用。

容易理解到，在SEQ ID NO:1的基础上，经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或缺失所得到的，且具有与SEQ ID NO:1具有相同活性(例如对细菌的抑制作用)的衍生序列也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸编码上述的短型肽聚糖识别蛋白。

根据密码子的简并性，在短型肽聚糖识别蛋白的氨基酸序列确定的基础上，任何编码该序列的短型肽聚糖识别蛋白均属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明提供了一种优化的用于编码该短型肽聚糖识别蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明提供了一种载体，该载体含有上述的核酸。

进一步地，该载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。再进一步地，表达载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体。再进一步地，表达载体为p2xFLAG-CMV-14。

进一步地，上述的核酸连接至该表达载体p2xFLAG-CMV-14的EcoR I和Xba I酶切位点之间。

容易理解到，通过基因工程操作技术，可将含有上述核酸的上述载体转化细胞或细菌，表达出上述的短型肽聚糖识别蛋白，再经过分离、纯化等步骤进而可以获得高纯度的短型肽聚糖识别蛋白。

因此，另一方面，本发明还提供了含有上述载体的重组细胞或重组菌。通过该重组细胞或重组菌可以获得重组表达的短型肽聚糖识别蛋白(SEQ ID NO:2)。

进一步地，重组菌的类型可以是大肠杆菌，也可以是酵母菌或者其他细菌等；进一步地，重组细胞的类型可以是昆虫动物细胞系，也可以是脊椎动物细胞系。再进一步地，脊椎动物细胞系可以人细胞系，或者是小鼠细胞系，又或者是草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella Kidney cell line,CIK)。

容易理解到，本领域技术人员可以根据实际需求，将上述的载体转入不同的细菌或细胞中，因此，只要是含有上述载体的重组细胞或重组菌均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供了制备上述短型肽聚糖识别蛋白的方法，其包括：用编码短型肽聚糖识别蛋白的核酸在宿主细胞中表达，纯化后得到所述短型肽聚糖识别蛋白。

进一步地，该制备方法例如可包括：

利用带有限制性内切酶位点的引物adPGRP-F和adPGRP-R扩增中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白的cDNA序列的开放阅读框片段得到PCR扩增产物；

将PCR扩增产物和p2xFLAG-CMV-14质粒经EcoR I和Xba I双酶切，连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞得到重组菌；

将重组菌进行培养，提取质粒，获得adPGRP-Flag真核表达质粒。

将adPGRP-Flag真核表达质粒电转染入CIK细胞中，得到重组细胞；

重组细胞经培养、纯化后即可得到短型肽聚糖识别蛋白。

容易理解到，在本发明提供的短型肽聚糖识别蛋白的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员也可以通过其他的基因工程技术获得本发明的短型肽聚糖识别蛋白，其也属于本发明的保护范围。

还有一方面，本发明还提供了上述的短型肽聚糖识别蛋白在制备抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂中的应用。

容易理解到，本发明通过细胞实验，首次中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其无论是在细胞内还是细胞外都具有较强的抑菌效果。因此，该中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白可以应用到制备抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂等领域中。得到的含有上述中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白的抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂的主体能够具有抗细菌感染、增强免疫力等作用。

再一方面，本发明还提供了一种抗菌药物，该抗菌药物的活性成分为上述的短型肽聚糖识别蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。该抗菌药物具有具有抗菌消炎、增强免疫力等作用。

需要说明的是，本发明还提供了一种免疫增强剂，其活性成分为为上述的短型肽聚糖识别蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。该免疫增强剂具有抗菌消炎、增强免疫力等作用。

本发明还提供了一种保健品，其活性成分为为上述的短型肽聚糖识别蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。该保健品具有抗菌消炎、增强免疫力等作用。

本发明还提供了一种饲料添加剂，其活性成分为为上述的短型肽聚糖识别蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。该饲料添加剂具有抗菌消炎、增强免疫力等作用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白，其氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)为：

MGECLLLHAAVTDQDDIQVPTLLSSPRFALKVPRMCPLALLLSALCTVTYGCPSIISRSQWGARNVSCLAPMKTPVPYVIIHHTEGRACTTVPACAALVRGIQDFHISERKRCDIGYSFLVGEDGNVYERRSWDYVGTHAPNYNNRSIGISIIGTFTEKT PTLLP；由165个氨基酸残基组成。

本实施例提供的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白其无论是在细胞内还是细胞外都具有较强的抑菌效果。该中国大鲵短型肽聚糖识别蛋白可以应用到制备抗菌药物、免疫增强剂、保健品或饲料添加剂等领域中。

实施例2

真核表达载体的构建及转化

(1)提取中国大鲵(Andrias davidianus，购自自湖北省嘉鱼祥德水产有限责任公司)的总RNA，所采取的试剂盒为 Reagents(Invitrogen公司，USA)。

具体步骤为：冰上将100mg大鲵脾脏组织充分匀浆；4℃、12000g离心10min，将上清液转移到无RNase的离心管中，室温静置10min；加入氯仿0.2mL，涡旋30sec，室温静置3-5min；4℃、12000g离心10min；吸取上清至无RNase的EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min；4℃、12000g离心12min；弃上清，加入800μL 75％乙醇重悬沉淀，4℃、12000g离心5min；弃上清，待乙醇完全挥发后加入适量DEPC水稀释总RNA。

采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA。

具体步骤为：取2μg总RNA，加入1μL oligo(dT)₁₈引物，加DEPC水至终体积11μL，离心，于PCR扩增仪70℃处理5min后迅速冰浴；加入4μL 5×反应缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)，2μL dNTP mix(10mmol/L each)，1μL M-MuLV反转录酶，离心，42℃反应60min，70℃、10min终止反应，得到后续PCR模板的cDNA。

(2)采用特异性引物adPGRP-F和adPGRP-R扩增出能够编码中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白(adPGRP)的cDNA序列。中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，上游引物adPGRP-F的碱基序列为：

5’-CCGGAATTCATGGGTGAGTGTCTGTTAT-3’，下划线为EcoR I酶切位点；

下游引物adPGRP-R的碱基序列为：

5’-TGCTCTAGACGGTAACAGGGTCG-3’，下划线为Xba I酶切位点。

(3)PCR反应体系：25μL反应体积中包括：2.5μL dNTP mix(dNTPs各10mM)；上下游引物(10μM)各1μL；0.25μL Ex Taq酶(5U/μL)；1μL大鲵脾脏cDNA；补水至总体积25μL。

(4)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃50s，72℃50s，35个循环；72℃延伸10min。

(5)对扩增的目的片段进行回收纯化。将表达载体p2xFLAG-CMV-14进EcoRI和XbaI双酶切。采用E.Z.N.A^TM cycle-pure kit胶回收试剂盒(Omega公司)对酶切产物纯化回收。将酶切的目的片段与酶切后的p2xFLAG-CMV-14用T4连接酶连接过夜；得到表达载体p2xFLAG-CMV-14-adPGRP，然后将其转化大肠杆菌Top10感受态细胞。

实施例3

采用QIAGEN plasmid Mini Kit从上述含有p2xFLAG-CMV-14-adPGRP的大肠杆菌中进行质粒提纯，将提纯的质粒p2xFLAG-CMV-14-adPGRP采用Lonza公司的细胞电转染试剂盒进行CIK细胞(Ctenopharyngodon idella Kidney cell line,)转染。具体如下：

(1)取生长状态良好的CIK细胞，加入适量培养基反复吹打使分散为单个细胞，计数后取约1×10⁶个细胞分装于无菌EP管中；

(2)室温400g离心10min，弃上清；

(3)用电转缓冲液悬浮细胞，加入3μg待转染质粒混匀，全部转移到电转杯中，置于电转仪卡槽中，运行T20程序进行电转染；将细胞混合液从电转杯吸出，加入到已事先添加2ml新鲜培养基的24孔板，28℃培养；得到含有p2xFLAG-CMV-14-adPGRP的CIK细胞。

实施例4

本实施例提供了用于制备实施例1的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白(SEQ ID NO:1)的方法。

按实施例3的方法培养得到含有p2xFLAG-CMV-14-adPGRP的CIK细胞。将该CIK细胞继续培养，分离提纯后得到含中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白。

实施例5

抑菌活性实验，以验证实施例1提供的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白的抗菌作用。实验方法如下。

(1)将迟缓爱德华氏菌(Edward siellatarda，又称迟钝爱德华氏菌)接种于TSB培养基中，28℃静置培养至OD₅₄₀＝0.5左右，取菌液离心收集菌体，并重悬稀释于适量无血清的M199培养基中；

(2)去除24孔板中的细胞培养基(由实施例3中步骤(3)培养后得到的，以含p2xFLAG-CMV-14-adPGRP的CIK细胞，作为实验组)，分别加入500μl稀释好的含有迟缓爱德华氏菌的M199培养基，170g离心6min，使迟缓爱德华氏菌充分接触细胞；

(3)25℃培养箱孵育90min后，分别在3h和6吸取培养基进行胞外细菌计数；

(4)对于胞内细菌计数，去除培养基，用无血清的培养基轻轻漂洗细胞两次，再加入500μl含有100μg/ml庆大霉素的M199培养基，以杀死胞外菌，并继续培养，分别在3h和6h后，去除培养基，用无血清的培养基漂洗四次，每孔加入500μl含1％Triton-X100的PBS缓冲液，置于摇床上室温裂解细胞20min；将裂解液用TSB进行10倍梯度稀释，然后进行细菌计数；

(5)以转化空载体(不含编码编码中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白(adPGRP)的cDNA序列的p2xFLAG-CMV-14表达载体)的CIK细胞作为对照组，并分析数据，结果如图1和图2所示。

图1的结果显示(图中：“flag”代表对照组，“PGRP1”代表实验组，横坐标表示检测时间，纵坐标表示每3×10⁵个CIK细胞浓度的细胞外迟缓爱德华氏菌的数量，“*”代表差异显著、p<0.05，“**”代表差异极显著、p<0.01)，转染p2xFLAG-CMV-14-adPGRP表达质粒3h后，实验组的CIK细胞胞外迟缓爱德华氏菌的细胞数量为3.3×10⁷个；6h后胞外迟缓爱德华氏菌的细胞数量为6.0×10⁷个。胞外细菌数量远远低于对照组(转化空载体p2xFLAG-CMV-14)对应时间的胞外细菌数量(3h为3.9×10⁷个；6h为1.0×10⁸个)；

图2的结果显示(图中：“flag”代表对照组，“PGRP1”代表实验组，横坐标表示检测时间，纵坐标表示每3×10⁵个CIK细胞浓度细胞内迟缓爱德华氏菌的数量，“*”代表差异显著、p<0.05，“**”代表差异极显著、p<0.01)，转染p2xFLAG-CMV-14-adPGRP表达质粒3h后，实验组的CIK细胞胞内迟缓爱德华氏菌的细胞数量为1.2×10⁶个；6h后胞内迟缓爱德华氏菌的细胞数量为8×10⁶个。胞内细菌数量远远低于对照组对应时间的胞内细菌数量(3h为2.1×10⁶个；6h为1.4×10⁷个)。

上述结果表明，无论是在细胞内还是细胞外，实验组的细菌数量均低于对照组，表明p2xFLAG-CMV-14-adPGRP载体上表达出的中国大鲵短型短型肽聚糖识别蛋白(adPGRP)具有较强的细菌抑制作用，能够抑制细菌至少是迟缓爱德华氏菌的生长。

综上，本发明提供的中国大鲵肽聚糖识别蛋白为短型肽聚糖识别蛋白，转染真核细胞后，提取的重组蛋白对胞内和胞外迟缓爱德华氏菌均具有较强的抑菌效果。本发明首次在大鲵中进行PGRPs抗菌功能研究与应用将为深入开展大鲵病原菌防御机制研究，揭示了中国大鲵肽聚糖识别蛋白(SEQ ID NO:1)的抗菌作用，这对保护大鲵种质资源，促进大鲵养殖业的可持续健康发展具有重要的现实意义。同时，为基于PGRPs开发抗菌药物、免疫增强剂、保健品以及饲料添加剂等潜在的应用领域奠定了基础。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 盐城工学院

<120> 一种短型肽聚糖识别蛋白及其制备方法、分离的核酸以及应用和抗菌药物

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Glu Cys Leu Leu Leu His Ala Ala Val Thr Asp Gln Asp Asp

1 5 10 15

Ile Gln Val Pro Thr Leu Leu Ser Ser Pro Arg Phe Ala Leu Lys Val

20 25 30

Pro Arg Met Cys Pro Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ala Leu Cys Thr Val

35 40 45

Thr Tyr Gly Cys Pro Ser Ile Ile Ser Arg Ser Gln Trp Gly Ala Arg

50 55 60

Asn Val Ser Cys Leu Ala Pro Met Lys Thr Pro Val Pro Tyr Val Ile

65 70 75 80

Ile His His Thr Glu Gly Arg Ala Cys Thr Thr Val Pro Ala Cys Ala

85 90 95

Ala Leu Val Arg Gly Ile Gln Asp Phe His Ile Ser Glu Arg Lys Arg

100 105 110

Cys Asp Ile Gly Tyr Ser Phe Leu Val Gly Glu Asp Gly Asn Val Tyr

115 120 125

Glu Arg Arg Ser Trp Asp Tyr Val Gly Thr His Ala Pro Asn Tyr Asn

130 135 140

Asn Arg Ser Ile Gly Ile Ser Ile Ile Gly Thr Phe Thr Glu Lys Thr

145 150 155 160

Pro Thr Leu Leu Pro

165

<210> 2

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggggagccc gcaatgtcag ctgcctcgct cccatgaaga ccccggtgcc ctacgtcatc 60

atccatcaca cagaaggacg cgcctgcacc accgtacctg cctgcgccgc cctcgtgagg 120

ggcatccaag acttccacat cagtgagcgg aaaaggtgtg acatcggcta cagcttcctg 180

gttggcgagg acggcaatgt gtatgaaagg cgcagctggg actatgtggg aacgcacgcc 240

cccaactaca ataacaggtc cattggcatc agcatcattg gcaccttcac agaaaaaacg 300

ccgactctgc tgccctga 318