本发明涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术：
鸡的病毒性疾病是危害养鸡业最为严重的疾病之一。目前，我国预防和控制鸡病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸡alpha干扰素(chIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸡的病毒性疾病如新城疫、传染性法氏囊炎、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等具有良好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留等优点，因此chIFN-α产品的研发对鸡病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。
目前chIFN-α产品的研发方法主要包括诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法和基因工程技术表达干扰素蛋白两种方法。诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法生产的干扰素产品面临两个问题：一是大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，二是以病毒作为诱生剂存在潜在病毒污染的情况。此外，这种方法提取的干扰素产量有限、产物成分复杂、价格昂贵，从而限制了其在临床上的应用。以基因工程技术为依托生产的基因重组鸡干扰素产品因产物成分单一、操作简单、产量高和适应于大规模生产等特点而得到了广泛的应用。
基因重组chIFN-α的表达系统根据表达宿主的不同分为原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞表达系统和昆虫表达系统。其中原核表达系统相比于其他的表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉等优点成为重组基因工程chIFN-α大规模工业生产的优选表达系统。而大肠杆菌因具有操作简单和能在廉价的培养基中迅速生长的特征，成为原核表达系统首选的表达菌株。常用于基因重组蛋白表达的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21和JM系列；常用的大肠杆菌表达载体有pBV220、pBV321、pET28a和pET32a等。其中pBV220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为PL和PR强启动子，该启动子受λ噬菌体CI基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。pET28a和pET32a表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达目的蛋白。与IPTG诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。
技术实现要素：
本发明的目的是选择pBV220温控表达载体用于构建chIFN-α-pBV220重组菌株作为生产菌株，通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白，用于病毒性疾病的治疗和预防用药。
本发明市基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，本研究选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒)在人羊毛膜细胞(wish细胞)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为235250IU/ml。本发明的产品不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新的药物。
本发明技术方案
1.一种鸡alpha干扰素，其特征在于该鸡alpha干扰素是一种由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCC No.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。
2.本发明所述一种鸡alpha干扰素的制备方法，其特征在于该方法为：
(1)种子培养：用含氨苄青霉素的25ml SOB液体培养基培养重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌；
(2)菌液的制备：用生产用培养基按按0.5％～1％(V/V)比例接种种子液37℃通气培养8～10小时。迅速升温至42℃，经温度诱导4～6小时后，终止培养；
(3)细菌破碎：将发酵菌液连续通过高压匀质机或者超声波进行破碎；
(4)包涵体的制备：破碎后的细菌经离心收集沉淀得到鸡干扰素包涵体蛋白；加入3mol/L尿素洗涤液，高速匀浆，经离心收集沉淀，再经溶解、离心收集上清液，即为粗制鸡alpha干扰素；
(5)重组鸡干扰素的纯化：采用AKTA pure纯化系统(GE产品)进行重组鸡干扰素的纯化；收集洗脱下来的蛋白吸收峰，即为纯化后的重组鸡干扰素蛋白。纯化后的蛋白经0.22μm过滤器过滤除菌，2～8℃贮存。
本发明具体实施方式
基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，本研究选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株，保藏编号为CGMCC No.13431，并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。本发明构建的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌能够诱导表达鸡干扰素蛋白，在42℃诱导条件下重组菌株在19KD处能够显现出表达目的蛋白，而空载体菌株由于没有目的基因片段，不能表达目的蛋白；未经42℃诱导表达的重组菌株在19KD处也无目的蛋白的表达。参见图1。
细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒)在人羊毛膜细胞(wish细胞)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为2～4×105IU/ml。该产品的研发不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新的药物。
本发明鸡alpha干扰素的制备方法为：
1.鸡alpha干扰素的制备
本发明所述的该鸡alpha干扰素是本发明人由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCC No.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。
其chIFN-α蛋白制备方法为：
(1)生产菌种 为本发明人由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCC No.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株。
(2)制备方法：
1)用含氨苄青霉素的25ml SOB液体培养基培养种子。
2)菌液的制备 用生产用培养基按0.5％～1％(V/V)比例接种种子液，37℃通气培养8～10小时。迅速升温至42℃，经温度诱导4～6小时后，停止发酵。
3)细菌破碎 将发酵菌液连续通过高压匀质机或者超声波进行破碎.。
4)包涵体的制备 破碎后的细菌经离心收集沉淀得到鸡干扰素包涵体蛋白；加入3mol/L尿素洗涤液，高速匀浆，经离心收集沉淀，再经溶解、离心收集上清液，即为粗制鸡alpha干扰素。
5)重组鸡干扰素的纯化 采用AKTA pure纯化系统(GE公司产品)进行重组鸡干扰素的纯化。收集洗脱下来的蛋白吸收峰，即为纯化后的重组鸡干扰素蛋白。纯化后的蛋白经0.22μm过滤器过滤除菌，2～8℃贮存。
2.重组chIFN-α蛋白生物活性鉴定
将Wish细胞(人羊膜细胞，该细胞株购自上海极威生物科技有限公司)消化后，以3.0×105个/ml细胞量铺96孔细胞培养板，100μl/孔。铺板后，置于37℃5％二氧化碳培养箱培养24h。粗提取的重组chIFN-α蛋白作100倍稀释，以100倍稀释液为起始浓度作4倍系列稀释，共12个稀释度，每个稀释度做6个重复。取培养24h的wish细胞，弃培养基，分别按100μl/孔量加干扰素样品和标准品到相应的细胞孔，然后置于37℃5％二氧化碳培养箱继续培养24h。培养24h后，按100μl/孔量加入100TCID50的VSV(水泡性口炎病毒，购自北京北纳创联生物技术研究院)稀释液到细胞孔中，然后置于37℃5％二氧化碳培养箱培养。每组同时设置病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照孔75％的细胞出现病变时判定各实验组结果，结果判定方法见表1。根据Reed-Muench法计算粗提取的重组chIFN-α蛋白的生物学活性。计算公式为干扰素效价＝干扰素半数细胞保护力稀释度×log4的值对log10的反对数。
表1细胞病变判断标准
附图说明
图1重组chIFN-α蛋白诱导表达结果，图中：M为Blue Plus Protein Marker(14-100KD)；1为pBV220空载体诱导表达样品；2为chIFN-α诱导表达蛋白样品；3为chIFN-α未诱导表达蛋白样品。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明涉及的生物材料为本发明人应用生物技术构建的pBV220温控表达载体构建的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的鸡chIFN-α蛋白。该重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.13431。人羊毛膜细胞(Wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司，上海市崇明县上海泰和经济发展区长兴镇潘园公路1800号2号楼9703室；水泡性口炎病毒(VSV病毒，购自北京市朝阳区北三环东路北京北纳创联生物技术研究院)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种鸡alpha干扰素及其制备方法。本发明选择pBV220温控表达载体用于构建重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，用该重组菌株作为生产菌株通过调节培养温度成功诱导并大量表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。该重组菌株表达的具有生物活性的chIFN-α蛋白不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供一种新产品。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——chIFN-α的制备
1.生产菌种为本发明人由pBV220温控表达载体构建的保藏编号为CGMCC No.13431的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株(该菌株已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13431)，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。
2.培养基的组成
(1)SOB液体培养基(SOB+Amp+)：大豆蛋白胨40.0g，酵母粉10.0g，氯化钠0.60g，氯化钾0.20g，适当体积的纯化水溶解以上各成分，再加纯化水至1000ml，调整pH值至7.0，高压灭菌。待培养基冷却到50℃，加入氨苄青霉素(无盐)0.1g/L。
(2)发酵培养基：大豆蛋白胨300.0g，酵母粉225.0g，氯化钠5.0g，KH2PO4 9.4g，K2HPO42.2g，MgC12·6H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 1.0g，适当体积的纯化水溶解无机盐后，加入大豆蛋白胨、酵母粉和葡萄糖，定容体积至10L。
3.制备方法：
(1)一级种子的制备及鉴定取重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌种，划线接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的营养琼脂平板上，置37℃培养过夜，选取光滑圆润的单个菌落若干，分别接种于含氨苄青霉素的25ml SOB液体培养基内，37℃培养18～24h，纯粹检验合格后，作为一级种子。
(2)二级种子的制备
将一级种子接种于含氨苄青霉素的500ml SOB液体培养基内，37℃振荡培养4～6h，纯粹检测后作为二级种子。
(3)重组鸡干扰素基因工程菌株的培养与表达将培养基预热至37℃，按0.5％～1％接种量接种种子液，37℃通气发酵培养8～10h。迅速升温至42℃，经温度诱导4～6h后，停止培养。
(4)细菌破碎
将培养后菌液连续通过高压匀质机或者超声波进行破碎，一直破碎到98％以上的细菌已经破碎或者是细菌连续通过匀质机两次以后，细菌的破碎率不再发生变化为止。
(5)包涵体的制备
破碎后的细菌以6000r/min在2～8℃离心30min，收集沉淀，得到鸡干扰素包涵体蛋白。加入3mol/L尿素洗涤液，高速匀浆，以6000r/min在2～8℃离心30min，收集沉淀。加入6mol/L尿素溶解液，以6000r/min在2～8℃离心30min，收集上清液，即为粗制鸡alpha干扰素的样品。
(6)重组鸡干扰素的纯化采用AKTA pure纯化系统进行重组鸡干扰素的纯化。纯化时，采用Ni Sepharose 6Fast Flow填料装柱，先用5个柱体积的清水清洗Ni柱，再用10个柱体积的Binding Buffer(6M尿素，20mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.4)平衡Ni柱。采用上样泵将粗制重组鸡alpha干扰素上样过层析柱，再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到A280稳定。之后用复性缓冲液(20mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.4)过柱，最后用Elution Buffer(20mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.4)收集洗脱下来的蛋白吸收峰，即为纯化后的重组鸡干扰素蛋白。纯化后的蛋白经0.22μm过滤器过滤除菌，2～8℃贮存。
实施例2
——重组chIFN-α蛋白生物学活性测定
重组chIFN-α大肠杆菌菌株能够在42℃条件下表达chIFN-α蛋白，本发明采用经典细胞病变抑制法对重组chIFN-α-pBV220菌株表达的目的蛋白进行生物学活性检测。结果表明，该重组菌株表达的chIFN-α蛋白能够显著抑制VSV病毒对Wish细胞的侵染，结果见表2-4。根据表2中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.6，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.6时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.6log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100x2352.5＝235250IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(100％-50％)/(100％-16.7％)＝50％/83.3％＝0.6。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.6＝5.6。
表2重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染Wish细胞显微镜下观察结果
根据表3中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.5，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.5时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.5log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100x 2048＝204800IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(77.8％-50％)/(77.8％-25.0％)＝27.8％/52.8％＝0.5。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.5＝5.5。
表3重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染Wish细胞显微镜下观察结果
根据表4中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.8，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.8时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.8log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100x 3104＝310400IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(88.9％-50％)/(88.9％-42.9％)＝38.9％/46.0％＝0.8。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.8＝5.8。
表4重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染Wish细胞显微镜下观察结果