一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程的制作方法

本发明涉及生物材料应用，特别是一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程。

背景技术：

羚羊角是我国传统的名贵中药，具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效，临床主要用于高热惊厥，在对小儿发热有很好的疗效。药典中规定羚羊角为牛科动物赛加玲羊Saiga tatarica Linnaeus的角。赛加羚羊数量稀少，属于濒危动物，是国家一级保护动物，已经严禁捕杀，这导致羚羊角的短缺，价格昂贵，一些不法商家在利益的驱动下在羚羊角粉末中掺入价格便宜的山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角。目前羚羊角成分的检测方法主要是性状和显微鉴定法，性状、显微鉴别法虽然简单快捷，但对于比较相近的角类药材缺乏专属性。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程。

实现上述目的本发明的技术方案为，一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列为SQQQEPLVCPNYQSYFR。

蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括如下步骤：

步骤一：将角类样品采用胰蛋白酶酶解处理：取角样品粉末1mg，加1ml水超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加入0.5ml变性缓冲液；加入25μl 1M DTT；90℃处理1h，加入60μl 1M IAA，暗处反应1h，10000rpm离心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超滤管，10000rpm离心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗涤3次；加100μ l25mM NH₄HCO₃溶液到超滤管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反应16h；10000rpm离心10min收集滤液。

步骤二：进行液质联用分析：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→3min，流动相A为96％；3→8min，流动相A为96％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为96％，流速为0.3ml/min。

步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择离子对715.33→572.28，910.52进行MRM扫描。

步骤一中，所述变性缓冲液为6M盐酸胍，1.2MTris-HCl，2.5m MEDTA，pH8.4

步骤二中，所述色谱柱的内径为2.1mm。

步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器。

步骤三中，所述电喷雾离子源为ESI+。

利用本发明的技术方案制作的一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。角中含有大量的角蛋白，本发明提供一种山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中掺伪的检测方法，能够快速的检出羚羊角药材中掺入的山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角成分。

附图说明

图1是本发明所述一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程的结构示意图；

图2是本发明所述一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的不同角类样品中特征肽SQQQEPLVCPNYQSYFR的MRM色谱图；

图3是本发明所述一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的掺入不同角类药材的羚羊角样品中特征肽SQQQEPLVCPNYQSYFR的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1-3所示，一种角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列为SQQQEPLVCPNYQSYFR；角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将角类样品采用胰蛋白酶酶解处理：取角样品粉末1mg，加1ml水超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加入0.5ml变性缓冲液；加入25μl 1M DTT；90℃处理1h，加入60μl 1M IAA，暗处反应1h，10000rpm离心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超滤管，10000rpm离心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗涤3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超滤管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反应16h；10000rpm离心10min收集滤液；步骤二：进行液质联用分析：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→3min，流动相A为96％；3→8min，流动相A为96％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为96％，流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择离子对715.33→572.28，910.52进行MRM扫描；步骤一中，所述变性缓冲液为6M盐酸胍，1.2M Tris-HCl，2.5mM EDTA，pH8.4；步骤二中，所述色谱柱的内径为2.1mm；步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器；步骤三中，所述电喷雾离子源为ESI+。

本实施方案的特点为，包括黄牛角、水牛角、山羊角和绵羊角共有的特征肽,所述特征肽的序列为SQQQEPLVCPNYQSYFR，角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将角类样品采用胰蛋白酶酶解处理：取角样品粉末1mg，加1ml水超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加入0.5ml变性缓冲液；加入25μl 1M DTT；90℃处理1h，加入60μl 1M IAA，暗处反应1h，10000rpm离心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超滤管，10000rpm离心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗涤3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超滤管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反应16h；10000rpm离心10min收集滤液；步骤二：进行液质联用分析：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→3min，流动相A为96％；3→8min，流动相A为96％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为96％，流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择离子对715.33→572.28，910.52进行MRM扫描，液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。角中含有大量的角蛋白，本发明提供一种山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中掺伪的检测方法，能够快速的检出羚羊角药材中掺入的山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角成分。

在本实施方案中，试验中使用的碳酸氢铵，胰蛋白酶购自Sigma公司、乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。角蛋白特征肽在羚羊角掺假检测中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将角类样品采用胰蛋白酶酶解处理：取角样品粉末1mg，加1ml水超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加1ml 50％乙醇超声10min，10000rpm离心10min收集沉淀；加入0.5ml 6M盐酸胍，1.2M Tris-HCl，2.5mM EDTA，pH8.4的变性缓冲液；加入25μl 1M DTT；90℃处理1h，加入60μl 1M IAA，暗处反应1h，10000rpm离心10min，收集上清；取100μl上清加入10kd超滤管，10000rpm离心20min；加入0.4ml 25mM NH₄HCO₃洗涤3次；加100μl 25mM NH₄HCO₃溶液到超滤管中，加入2μg胰蛋白酶；37℃反应16h；10000rpm离心10min收集滤液；步骤二：进行液质联用分析：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其色谱柱的内径为2.1mm；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→3min，流动相A为96％；3→8min，流动相A为96％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为96％，流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，其电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，选择离子对715.33→572.28，910.52进行MRM扫描，其电喷雾离子源为ESI+，角中含有大量的角蛋白，本发明提供一种山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角的角蛋白共有的特征肽用于羚羊角中掺伪的检测方法，能够快速的检出羚羊角药材中掺入的山羊角、绵羊角、水牛角、黄牛角成分。

在本实施方案中，实施例1，角类样品的检测：

称取1mg角类样品粉末按照样品处理方法和液相质谱方法分析样品，检测结果如图2。

在本实施方案中，实施例2，羚羊角药材中其他角类成分的检测：

《中国药典》2015年版中规定，药屑杂质通常不得过3％的要求，考虑到质谱仪器的检测误差，本实施例在羚羊角粉末中掺入了3％的其他角类样品，具体为称取3mg角类样品粉末加入到97mg羚羊角粉末中混匀，称取混匀的角类样品粉末按照样品处理方法和液相质谱方法分析样品，检测结果如图3。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。