一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合及方法与流程

本发明属于食品检测技术领域，特别是涉及一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合及方法。

背景技术：

近年来，羊全脂奶粉由于它的低致敏性，高营养价值，易消化吸收及独特的风味等优势受到了市场的追捧，成为乳品行业热销产品。然而羊奶的产量较低并且受季节性变化影响，同时羊奶原料成本较高。因此受到经济利益的驱使，价格较低、产量较高的奶牛奶粉掺入羊奶粉的掺假现象频繁出现。这种掺假行为不仅对消费者的经济利益造成损害，掺入的奶牛奶过敏原更对奶牛奶过敏消费者的健康造成威胁。

现阶段定性鉴别奶牛奶和羊奶的方法主要是基于检测DNA的PCR法和检测蛋白质的ELISA法。

申请号为201610363584.8的中国发明专利公开了一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其是通过普通PCR对掺假模型进行分级，利用荧光定量PCR获得处于各个相应等级的Ct值与掺假比例的关系式，之后通过普通PCR确定待检样品的等级，然后对待检样品进行荧光定量PCR获取Ct值，代入到相应级别的关系方程中从而计算出羊奶粉中牛奶成分的百分含量。

PCR法操作简单，具有较高的特异性，同时相比于检测蛋白质的ELISA法，DNA受到温度和压力的影响较小，PCR方法更为稳定。但PCR法也存在明显的缺陷，由于PCR法基于指数扩增的检测机理，其检测误差较大，定量不准确；同时奶中的DNA主要来自白细胞与脱落的乳腺细胞，这与动物的品种，饲养以及生理期有关，所以奶中的DNA含量不稳定，难以建立标准化的检测方法。

授权公告号为CN 101271107B的中国发明专利公开了一种羊乳及其乳制品中掺入牛乳的快速免疫学检测方法，采用牛乳特异性酪蛋白免疫哺乳动物产生抗体，将制备的血清抗体与羊乳的共同抗原反应得到特异性抗体，再将待测羊乳(疑是掺假样品)进行脱脂处理，应用制备特异抗体建立间接ELISA定量出羊乳中掺入的牛乳含量。

ELISA法利用抗原抗体技术检测奶中的特异蛋白质，但是由于两种奶的蛋白质种类一致，性质接近，故抗体制备比较困难。另外ELISA法的主要缺陷是由于蛋白质变性导致测量结果的不准确性。

液相色谱-质谱法逐渐成为的物种鉴定主流方法。该方法通过比对选择特异性多肽作为生物标记物，对不同物种来源的食物进行溯源调查。在过去的十年间，许多文献报道了利用该方法可对鸡肉、猪肉和鱼肉等多种肉类进行了定性鉴定，但是很少涉及到定量检测方面的研究。与此同时，鲜有文献对乳蛋白的物种溯源分析的方法进行研究和报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合。使用该特征肽组合可以准确检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例，具有较高的特异性、灵敏度、回收率和精密度。

一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合，包括牛奶特征肽和羊奶特征肽，其中牛奶特征肽氨基酸序列为LSFNPTQLEEQCHI，羊奶特征肽氨基酸序列为LAFNPTQLEGQCHV。

基于上述特征肽组合，本发明又提供了一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的内标特征肽组合，包括内标牛奶特征肽和内标羊奶特征肽，所述内标牛奶特征肽的氨基酸序列为LSFNPTQL*EEQCHI*，内标羊奶特征肽的氨基酸序列为LAFNPTQL*EGQCHV*，其中L*、I*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸残基。使用时，可以通过向样品中添加内标特征肽组合，可以达到对检测结果进行校正的目的。

本发明还提供了一种检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的方法，包括以下步骤：

(1)向待检测样品中加入内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽；

(2)将添加内标特征肽的待检测样品经蛋白变性处理后，使用胰蛋白酶酶解；

(3)酶解产物用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；

(4)计算待检测样品中所述的羊奶特征肽和牛奶特征肽与对应的内标特征肽的峰面积比；

(5)将所述峰面积比代入标准曲线中，计算得到其中羊奶比例和牛奶比例，

所述内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽分别为所述羊奶特征肽和牛奶特征肽经同位素标记所得。

待检测样品通过高效液相色谱能够尽量分离纯化为一个个单一组分的峰，然后将单一的峰分别通过质谱分析确定成分，再通过质谱的结果确定高效液相色谱结果中所述的羊奶特征肽和牛奶特征肽以及对应的内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽各自的峰，而峰面积的大小即为各自成分的量。如果不加入内标特征肽，则通过配置已知浓度的牛奶粉标准样品和羊奶粉标准样品，检测后获得相应峰面积结果，通过浓度与峰面积之间的关系获得标准曲线，该标准曲线为线性。但是由于样品在处理过程中存在样品损失、高效液相色谱回收率存在损失和波动等问题存在，使得没有添加所述内标特征肽时，所得结果不够准确，而且检测结果波动较大，使得检测结果不够可靠和准确。

而通过加入已知浓度和量的内标特征肽，可以通过计算羊奶特征肽和牛奶特征肽与对应的内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽的峰面积比，这样就尽量避免了样品在处理过程中存在样品损失、高效液相色谱回收率存在损失和波动等问题，因为内标特征肽也是按相同比例在损失，所以可以通过内标特征肽来校准。

优选的，所述的方法中，所述内标牛奶特征肽的氨基酸序列为LSFNPTQL*EEQCHI*，内标羊奶特征肽的氨基酸序列为LAFNPTQL*EGQCHV*，其中L*、I*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸残基。

优选的，所述标准曲线由以下方法获得：

将标准羊奶粉与标准牛奶粉按不同比例混合获得一系列标准品，重复上述步骤(1)～(4)，计算得到各个标准品中内标羊奶特征肽和牛奶特征肽与对应的内标特征肽的峰面积比，最后绘制得到标准曲线。

通过将标准羊奶粉和标准牛奶粉按不同比例混合获得一系列标准品，相较于使用单一样品的标准羊奶粉和标准牛奶粉来获取标准曲线更加接近实际，也能够消除羊奶粉和牛奶粉相互之间对检测结果可能存在的影响，因为总蛋白和肽的量的多少可能会影响高效液相色谱的结果。

优选的，所述内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽的添加比例分别为8～12μmol/L。最优选的，所述内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽的添加比例分别为10μmol/L。当然，两种内标特征肽的使用量可以在较宽范围内选择，只要结果能够检测到。但是，最优的情况是所添加的内标特征肽的量与所检测样品中相应的特征肽的量接近，这样可以使校准结果最准确。

优选的，所述内标羊奶特征肽和内标牛奶特征肽按质量比1∶1进行添加。

优选的，使用DTT进行蛋白变性。

优选的，高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Acquity BEH 300C18柱，1.7μm，2.1×100mm；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：0.1％甲酸/水；流动相B：0.1％甲酸/乙腈；流速：0.3mL/min。

优选的，质谱的条件为：

电喷雾离子源电离模式：ESI+，毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3Mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明不仅实现了对羊奶粉中牛奶粉掺假定性，而且实现了对羊奶粉与牛奶粉的掺假比例的定量。本发明选择了牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白作为候选标记物，筛选出代表牛奶和羊奶的特异特征肽，并设计合成对应的内标物，以具有代表性的牛奶和羊奶作为标准品，采用高效液相色谱与质谱联用的分析技术，实现样品中羊奶粉与牛奶粉的掺假比例定量，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度；

(2)本发明选择蛋白中的特征肽段作为检测物质，适用于变性蛋白质的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性与非变性蛋白，保证了方法的准确性。

附图说明

图1为DTT还原反应条件优选结果柱状图，其中黑色、灰色、白色分别为DTT在反应液中的终浓度分别为1.0、2.5和5.0mmol/L时得到的检测值；

图2为含有0.1％牛奶粉的羊奶粉样品检测结果图，其中曲线a为内标羊奶特征肽的高效液相色谱检测峰，曲线b为羊奶特征肽的高效液相色谱检测峰，曲线c内标牛奶特征肽的高效液相色谱检测峰，曲线d为牛奶特征肽的高效液相色谱检测峰。

具体实施方式

实施例1样品前处理条件的优化

β-乳球蛋白具有较为紧密的空间结构，其空间结构主要通过在半胱氨酸之间形成的二硫键以及其他的非共价键维持。如果不破坏β-乳球蛋白的空间结构，酶切位点无法暴露将导致酶切无法完全进行。通过使用二硫苏糖醇(DTT)可水解二硫键达到破坏蛋白质空间结构的作用。利用胰蛋白酶只作用于精氨酸(R)和赖氨酸(K)的专一性，将蛋白质分解为多肽进行检测。本发明通过优化还原温度和DTT浓度，最终达到酶切效率最高的目的。

本发明设计了一套DTT浓度和还原温度的正交实验来优化还原反应条件。其中DTT在反应液中的终浓度分别为1.0、2.5和5.0mmol/L，还原反应的温度为60、70、80、90℃，碘乙酰胺(IAA)溶液的浓度也须与DTT溶液保持一致，保证过量的DTT溶液不会对后续的酶解过程产生影响。结果表明在70℃的条件下加入100mmol/L的DTT溶液进行还原反应后的酶解效率最高，见图1。最终的优化前处理步骤如下：准确称取约100mg混合均匀的样品于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。取10μL稀释液，加入10μL内标溶液(两种同位素标记内标浓度分别为10μmol/L)，10μL的100mM DTT溶液与825μL水，在70℃水浴锅中反应30min。待冷却后加入30μL的100mM IAA溶液，在暗处室温静置30min。加入100μL 500mM的碳酸氢铵缓冲液与10μL 200μg/mL的碱性胰蛋白酶，在37℃水浴锅中反应2h。最后加入5μL甲酸溶液终止反应，用0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

实施例2特征肽的筛选和确定

牛和羊同属于牛属，但分属于不同的亚属：牛亚属(Subfamily Bovidae)和羊亚属(Subfamily Caprinae)。通过Uniprot数据库比对，发现在奶牛奶与羊奶中的蛋白质同源性高，氨基酸序列差异小。本发明选择奶中含量较高的乳清蛋白β-乳球蛋白作为标记物，通过数据库筛选比对，选择奶牛奶和羊奶中氨基酸序列具有差异性的特异性多进行检测，最终达到定量检测全脂羊奶粉中全脂奶牛奶粉的掺假比例的目的。

本发明同时满足山羊奶和绵羊奶中的奶牛奶掺假检测，因此所选择的羊奶特征肽段满足山羊奶和绵羊奶的一致性，同时与所选择的牛奶特征性肽段具有差异性的特点。根据Uniprot数据库比对，发现满足以上条件的氨基酸多肽共有两对，分别是VYVEELKPTPEGDLEILLQK(牛奶)和VYVEELKPTPEGNLEILLQK(羊奶)、LSFNPTQLEEQCHI(牛奶)和LAFNPTQLEGQCHV(羊奶)。特异性特征多肽的长度理论上应该小于15个氨基酸，如果过长将导致多肽灵敏度低、较差的色质谱性质和高昂的合成费用。多肽VYVEELKPTPEGDLEILLQK和VYVEELKPTPEGNLEILLQK在筛选过程中未检出。因此本发明最终选择了多肽LSFNPTQLEEQCHI和LAFNPTQLEGQCHV分别作为牛奶和羊奶的特征肽。其质谱参数见表1。

表1：MRM检测参数。

实施例3内标特征肽的设计与确定

由于多肽在不同样品中基质效应不同，因此通过外标法测得的峰面积响应值差异较大，同时由于蛋白质在酶解过程中可能受到基质效应的干扰，导致酶解不完全，影响结果的准确性。所以有必要设计内标，使之能够校正基质效应在酶解效率以及检测过程中带来的影响。故本发明按照天然蛋白质序列，在特异肽LSFNPTQLEEQCHI和LAFNPTQLEGQCHV的基础上，利用同位素标记的多肽合成了内标牛奶特征肽LSFNPTQL*EEQCHI*和内标羊奶特征肽LAFNPTQL*EGQCHV*，L*指[13C6,15N]-leucine(亮氨酸)，I*指[13C6,15N]-isoleucine(异亮氨酸)，V*指[13C5,15N]-Valine(缬氨酸)。

为了验证内标对基质效应的抗干扰能力，本发明进行了标准奶粉添加法实验。取标准牛奶粉与非标准羊奶粉按比例10∶90、50∶50及90∶10配制混合样品溶液，按照最优方法进行预处理后进样分析，同时取标准牛奶粉和标准羊奶粉按比例0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2和10∶1混合后，分别按照外标法和内标法计算该样品的牛奶比例。标准羊奶粉添加法同标准牛奶粉添加法。

检测结果见表2：当检测非标准羊奶粉中的标准牛奶粉时，外标法计算所得结果的RSD分别为20.42％、17.00％和3.47％。内标法计算所得结果的RSD分别为0.71％、2.93％和1.76％。当检测实际样品中的低比例浓度标准牛奶时，外标法的检测值波动较大，精密度较差，而内标法精密度较好。当检测非标准牛奶粉中的标准羊奶粉时，外标法所测得结果的回收率分别为48.16％、73.68％和97.65％，内标法所得结果回收率分别为107.85％、100.45％和98.13％。当检测实际样品中的低比例浓度标准牛奶时，外标法的回收率偏低，而内标法的回收率满足实验要求。因此可得，无论从实验结果的准确性和精密度上，内标法都明显优于外标法。

表2：标准添加回收实验回收率(n＝3)。

实施例4方法学验证

取标准牛奶粉和标准羊奶粉按比例0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2和10∶1混合后，建立内标法标准曲线，在4天内分别配制4条标准曲线，进样分析，结果见表3，线性R²均在0.99以上。

表3：回归方程与线性。

分别取100mg标准牛奶粉与标准羊奶粉配制标准牛羊奶溶液。分别按1∶9、3∶7、5∶5、7∶3和9∶1比例混合制备混合样品溶液后进行预处理。每天平行处理6个样品，共进行5天，计算回收率，结果见表4。

表4：不同比例的混合牛奶粉和羊奶粉样品的测定(n＝30)。

由表4可得，在牛羊奶粉混合比例在10％到90％之间时，本发明方法所测得回收率在96.15％～102.34％之间，RSD在3.75％～6.47％之间。本发明所建立方法在灵敏度、线性、回收率和精密度方面均满足检测需求，本发明方法可以检测全脂牛奶粉掺假量在0.1％的全脂羊奶粉，见图2。

实施例5实际样品的检测

选择了不同品牌不同类型的羊奶粉按照上述检测方法进行检测，分析计算结果见表5。

表5：样品检测结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ala Phe Asn Pro Thr Gln Leu Glu Gly Gln Cys His Val

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Ser Phe Asn Pro Thr Gln Leu Glu Glu Gln Cys His Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asn Leu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asp Leu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys

20