本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种应用特异的洗脱液组合的离子交换色谱法制备收率高的硫酸鱼精蛋白的方法。
背景技术：
1868年，Miescher从鱼精子头部细胞核内发现一种含氮的碱性物质命名为鱼精蛋白（protamine）。其三分之二由精氨酸组成，带大量正电荷，生物学作用是同带负电的核酸磷酸盐基团结合。1936年，Hagedorn等人应用鱼精蛋白加胰岛素皮下注射延长后者的吸收。选择鱼精蛋白是因为它的碱性PH值能够使胰岛素处于离子化状态，从而延缓吸收。1937年首先提出鱼精蛋白能中和强酸性的肝素，以后作为肝素拮抗剂应用于体外循环(CPB)结束后和外科肝素化病人。近年来，随着CPB心内直视手术和冠状动脉一主动脉搭桥术(CABG)的广泛开展，鱼精蛋白的使用日益增多，国内外专家对鱼精蛋白的药理作用和临床应用也做了大量研究工作。在体外循环手术中, 鱼精蛋白是一种无法替代的肝素中和剂。
鱼精蛋白，是一类存在于各类雄性动物成熟精巢组织中的多聚阳离子肽，主要存在鱼类(如鲑鱼、虹鳟鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中，以核精蛋白的形式存在，且与DNA结合紧密。鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白，能溶于水或稀酸中，但可被稀氨水沉淀。鱼精蛋白加热不易凝固且较为稳定。鱼精蛋白在鱼类精巢中的含量极不稳定，随性腺的成熟度而变化很大。
鱼精蛋白的结构也因鱼种不同而有差异，但是它们存在许多相似的特征，如N．端均为精氨酸或者丙氨酸，各种鱼精蛋白分子肽链中都含有4个较长的和2个较短的精氨酸簇，并且分别被特征性的残基Ser或Thr，Pro．Ile，Gly．Gly或Val-Val分隔开。
根据碱性氨基酸组成种类和数量的不同，可以将鱼精蛋白分为单鱼精蛋白 ( monoprotamine)、双鱼 精 蛋 白 ( diprotamine ) 和 三 鱼 精 蛋 白( triprotamine) 3 种。其中，单鱼精蛋白仅含一种组分精氨酸，如鲑、鲱和虹鳟精蛋白等; 双鱼精蛋白含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸，如鲤精蛋白; 三鱼精蛋白含有 3 种碱性氨基酸，如鲢、鲟精蛋白。然而鱼精蛋白并不是单一组分，它们是通常由数种成分组成的混合物，如鲱鱼精蛋白经离子交换层析后分离出 3 种成分，且成分之间彼此非常相似，而红鳟鱼精蛋白则由 6 种差别极小的成分组成。不同鱼种鱼精蛋白在氨基酸组成比例上有很大的差别，但是它们存在很多相似的特征。Yoshiko 研究了 12 种鱼类的鱼精蛋白结构，发现这 12 种鱼精蛋白的 N-末端均为精氨酸或丙氨酸，且均含有 4 个较长的和 2个较短的精氨酸簇，分别被 Thr 或 Ser、Gly-Gly、Pro-Ile 或 Val-Val 特征性残基分隔开。硫酸鱼精蛋白（Ulinastatin）系从健康成年男性新鲜鱼白中分离纯化出来的一种酸性糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，主要在肝脏中合成，由肾脏代谢随鱼白排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。硫酸鱼精蛋白由143个氨基酸组成，相对分子质量约37000~43000，属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制心肌抑制因子（MDF）产生、清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。硫酸鱼精蛋白还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。
技术实现要素：
本发明提供了一种离子交换色谱纯化硫酸鱼精蛋白的方法，是为了攻克耐酸性混合模式吸附等传统方法提取硫酸鱼精蛋白收率过低、效价不高不稳定的难题，不断改进和完善工艺，采用多种现代蛋白质高端生化分离技术来纯化硫酸鱼精蛋白，从而提高了硫酸鱼精蛋白的收率。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种应用特异洗脱液组合的离子交换色谱法制备高收率、效价稳定的硫酸鱼精蛋白的方法，其特征在于：选用特异洗脱液组合，大幅提高离子交换色谱的效率，可以将硫酸鱼精蛋白的总收率提高到80%以上。
该技术方案中，还具有以下技术特征：所述离子交换色谱法包括如下步骤：
1）硫酸鱼精蛋白粗加工
称取1T pH小于6.5的澄清鱼白，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸鱼精蛋白粗品。
2）阴离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
2.1）称取硫酸鱼精蛋白粗品1kg，用洗脱液 A溶解，搅拌50分钟，离心50分钟，留取离心液；
2.2）阴离子交换柱用洗脱液 B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在130~150ml/min左右；
2.3）用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在130~150ml/min，得洗脱液；
2.4）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约2.7L。
3）阳离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
3.1）用洗脱液C平衡阳离子交换柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在130~150ml/min；
3.2）上样结束后，用洗脱液C洗脱，流速130~150ml/min左右，收集洗脱液；
3.3）柱中的阳离子交换树脂经洗脱液C洗脱后，用洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在130~150ml/min，密封待用；
3.4）洗脱液经超滤膜超滤至一定体积，超滤液中加入一定量磷酸氢二钠溶液，继续超滤至同一体积，然后再加入等量磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至相同体积。
4）沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得硫酸鱼精蛋白。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
应用特异洗脱液组合的离子交换色谱,可以更有效的去除硫酸鱼精蛋白中的多种杂蛋白，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得硫酸鱼精蛋白总收率达到80%以上，创造了巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
实施例1
1）硫酸鱼精蛋白粗加工
称取1T pH小于6.5的澄清鱼白，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质, 并用精密pH试纸测定，调节鱼白pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸鱼精蛋白粗品。
2）阴离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
2.1）称取硫酸鱼精蛋白粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌50分钟，离心50分钟，留取离心液；
2.2）阴离子交换柱用2.5L的洗脱液 A平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在150ml/min左右；
2.3）用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在150ml/min，得洗脱液；
2.4）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约2.7L。
3）阳离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
3.1）用3.0L的洗脱液C平衡阳离子交换柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在150ml/min；
3.2）上样结束后，用10L的洗脱液C洗脱，流速150ml/min左右，收集洗脱液；
3.3）柱中的阳离子交换树脂经洗脱液C洗脱后，用5.0L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在150ml/min，密封待用；
3.4）洗脱液经超滤膜超滤至170ml，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液830ml，继续超滤至170ml，然后再加入830mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至170mL。
4）沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得硫酸鱼精蛋白。
实施例2
1）硫酸鱼精蛋白粗加工
称取1T pH小于6.5的澄清鱼白，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质, 并用精密pH试纸测定，调节鱼白pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸鱼精蛋白粗品。
2）阴离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
2.1）称取硫酸鱼精蛋白粗品1kg，用8.5L的洗脱液 A溶解，搅拌50分钟，离心50分钟，留取离心液；
2.2）阴离子交换柱用3.0L的洗脱液 A平衡，将上述离心液流经平衡好的树脂柱，流速控制在150ml/min左右；
2.3）用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在150ml/min，得洗脱液；
2.4）将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约2.7L。
3）阳离子交换色谱（以0.25L柱体为例）
3.1）用3.0L的洗脱液C平衡阳离子交换柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在150ml/min；
3.2）上样结束后，用10L的洗脱液C洗脱，流速150ml/min左右，收集洗脱液；
3.3）柱中的阳离子交换树脂经洗脱液C 洗脱后，用7.5L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在150ml/min，密封待用；
3.4）洗脱液经超滤膜超滤至170ml，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液830ml，继续超滤至170ml，然后再加入830mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至170mL。
4）沉淀
超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。
5）冻干
将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得硫酸鱼精蛋白。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。