一种改造环状多肽PV及其应用和抗菌制剂的制作方法

本发明涉及一种环状的合成多肽PV及其抗菌应用，具体地说是一种合成的衍生自LBDv活性多肽的结构改造环状多肽及其抗菌应用。

背景技术：

对虾的养殖在我国的水产养殖业中占有重要地位，近些年来，对虾养殖过程中的病害问题已经严重阻碍了其养殖生产的健康发展，抗生素的滥用与环境的恶化使海水养殖动物的病害难以从根本上得到控制。

抗菌肽(蛋白)被认为是鱼、虾、贝等防御细菌、病毒等外源病原感染的重要效应分子，在动物的先天免疫过程中发挥重要作用。目前从甲壳动物中发现的抗菌肽种类繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一种重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次从中国鲎(Tachypleus tridentatus)和北美鲎(Limulus polyphemus)的血细胞中分离得到ALF，并发现其能抑制LPS介导的凝血反应的激活。1985年，Morita等发现ALF还具有很强的抗革兰氏阴性菌活性。之后，人们相继在斑节对虾(Penaeus monodon)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、桃红对虾(Farfantepenaeus duorarum)等多种甲壳动物中发现ALF编码基因的存在，并证实ALF基因的重组蛋白具有广泛的抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的活性。另外，研究还发现对虾白斑综合征病毒(WSSV)预先与重组表达的ALF蛋白一起孵育后再注射入虾体中，能明显抑制注入虾体中的WSSV的复制。

与传统抗生素的作用机理不同，ALF能直接中和细菌细胞壁的脂多糖，溶解细菌，因此不易引起细菌的耐药性。ALF抗病毒的作用机理目前尚不清楚。随着抗生素的应用，许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新型抗生素的发现又极其困难，因此，ALF的研究为开发新型抗菌药物提供了重要基础。

研究发现，ALF氨基酸序列中的两个保守半胱氨酸之间形成二硫键，这两个半胱氨酸之间的氨基酸共同组成一段阴离子多肽，具有与LPS结合的能力，这段保守的结构被命名为LPS结合结构域，被认为是ALF降解革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根据锯缘青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS结合结构域合成的具24个氨基酸残基的多肽在抗菌免疫过程中作用，发现合成多肽SsALF24具有结合LPS的活性并且对大肠杆菌都具有明显的抑制作用，其最小抑制浓度为16.16～32.32uM(Sharma S，Yedery RD，Patgaonkar MS，Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterial activity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab，Scylla serrata anti-lipopolysaccharide factor(SsALF)also involved in the modulation of vaginal immune functions through NF-kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50∶179-191.)。

前期研究发现，中国明对虾中ALF的LPS结合结构域具有不同的抗菌抗病毒作用，通过中国明对虾ALF的LPS结合结构域改造获得的LBDv多肽分子表现出显著的抗菌抗病毒作用(Yang H，Li SH，Li FH，Xiang JH.Structure and bioactivity of a modified peptide derived from the LPS-binding domain of an anti-lipopolysaccharide factor(alf)of shrimp.Mar.Drugs 2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。基于发表的活性多肽LBDv的氨基酸序列，本发明对其序列进行氨基酸替换、序列缩短等进一步改造，利用化学合成的方法获得了改造后的环形多肽PV，它们显示出显著的抗菌生物学活性，具有重要的应用前景。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种经过结构改造的环状合成多肽PV，它们具有明显的抗菌活性。

本发明的技术方案如下：

利用化学合成的方法获得了环状的合成多肽PV，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其序列特征为：

SEQ ID No.1：Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH₂

所述的环状的合成多肽PV序列具有二硫键结构。其结构特征在于：合成多肽PV的氨基端第一个半胱氨酸(C)和羧基端第一个半胱氨酸(C)之间具有二硫键结构；多肽的氨基端C的氨基被乙酰化(Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH₂)。

所述的环状合成多肽PV衍生自活性多肽LBDv的结构改造。LBDv的特征在于：具有序列列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

所述的环状的合成多肽PV具有明显的抗菌活性。具体为：对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长或增殖均具有很强的抑制作用。

所述环状的合成多肽PV可作为抗菌的活性成份，可用于制备抗菌的药物或制剂中。

本发明有如下优点

1、本发明确定了一种衍生自活性多肽LBDv结构改造的抗菌多肽PV及其结构特征。

2、通过本发明可开发有效的细菌类疾病的防治药物。

附图说明

图1合成多肽PV的空间结构图；

图2合成多肽PV的HPLC纯度检测图；

图3合成多肽PV的MS质谱鉴定图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

一种化学合成的具有明显抗菌活性的对虾环状多肽PV，它们的序列及来源序列信息如下：

(1)SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

*长度：16氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键

*空间结构：两个半胱氨酸之间通过二硫键相连接，形成环状结构，具有图1所示空间结构：多肽序列形成两个相连的β折叠结构。

(b)分子类型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1

Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH₂

其中括号内的氨基酸为成环的氨基酸，括号外左侧的小写c表示括号内的氨基酸为形成环状结构氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙酰化；-NH₂表示氨基酸C的羧基被酰胺化。

(2)SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

*长度：24氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：环形，两个半胱氨酸之间形成二硫键

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.2

Ac-Yc(CKFRVKPKFKRWRLRFKGRMWC)P-NH₂

所述抗菌多肽PV的合成、环化、纯化、鉴定及生物活性分析：

通过人工化学合成途径，利用固相合成方法获得粗品多肽，经固相环化、质谱鉴定和液相色谱纯化获得含有二硫键的合成多肽PV。具体为：

1)多肽合成

采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，从C端向N端方向合成。用10mg Rink-Amide-Resin树脂(AAPPTec，货号RRZ001)作为载体，依靠载体本身的活性基团与5mg被Fmoc进行氨基保护的第一个氨基酸(Fmoc-Pro-NH₂)的羧基相连(详细方法参考文献：Panagiotis Stathopoulos，Serafim Papas，Vassilios Tsikaris.C-terminal N-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rink amide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of Peptide Science 2006；12：227-232.)。

用N-甲基毗咯皖酣(NMP)冲洗树脂除去多余保护氨基酸，向反应器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(体积分数)脱除Fmoc基团，反应20min，排空反应器，用5mL NMP振荡冲洗树脂，重复3次，脱除第一个氨基酸残基的Fmoc保护；裸露出的活性氨基基团与下一个被Fmoc进行氨基保护的氨基酸(5mg)的羧基相连，形成第一个肽键(Cys-Trp)。此段的以上步骤循环进行(不同之处在于：只是每次需采用对应的被Fmoc进行氨基保护的氨基酸)直至多肽序列Ac-CKPKFKRWKLKFKKWC-NH₂合成完毕，得约20mg线性多肽。

2)多肽环化

20mg线性多肽偶联完最后一个氨基酸后，配置0.1mol/L的I₂溶液(I₂溶于体积比1∶1的甲醇∶DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮气吹拂反应，约6小时。

3)多肽纯化和鉴定

用50mL切肽试剂三氟乙酸∶苯甲硫醚∶苯酚∶乙二硫醇∶双蒸水(体积比82.5∶5∶5∶2.5∶5)将20mg环化后的多肽从载体树脂上裂解下来，2小时后，加入4℃预冷的乙醚100ml使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到的多肽粗品经反向液相色谱纯化，纯化后的多肽冻干后进行HPLC纯度检测(图2)和质谱鉴定(图3)。检测HPLC色谱柱为250*4.6mm，Kromasil-C18-5μm；流动相A：0.1％TFA/乙腈，流动相B：0.1％TFA/H₂O；线性洗脱梯度：15％A-100％A；流速为1ml/min，检测波长为220nm；一次进样量为10μl。HPLC和MS检测结果显示，合成多肽PV的纯度为96.05％，分子量为2193.82，与预测分子量(2193.82)一致。

4)抑菌试验

合成多肽PV分别用50mmol/LpH7.4的PBS溶解至浓度为640μmol/L的溶液，同时以50mmol/L pH7.4的PBS为阴性对照。采用最低抑菌浓度(MIC)方法检测合成多肽PV对革兰氏阴性菌包括哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.piscicida)和革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等细菌的抑菌活性。即：将待测大肠杆菌、表皮葡萄球菌分别在37℃，200r/min培养条件下于LB培养基中培养至1×10⁸cells/mL，哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌分别在30℃，200r/min培养条件下于TSB培养基中培养至1×10⁸cells/mL；培养的细菌分别加入到48孔培养板中，用新鲜的LB或TSB培养基将待测菌液稀释至终浓度1×10⁶cells/mL；向48孔培养板中分别加入梯度稀释的多肽PV溶液至终体积为200μl，多肽H终浓度依次为64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；用PBS作为阴性对照，终浓度58μmol/L的氨苄青霉素(大肠杆菌、表皮葡萄球菌)或88μmol/L的卡那霉素(哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌)分别作为阳性对照；在37℃或28℃条件下培养3h后，分别加入300μl新鲜LB或TSB培养基，继续培养18h，测定每孔中细菌的OD600吸光值，计算细菌浓度。

结果表明，1-2μmol/L的合成多肽PV能够有效抑制哈维氏弧菌和美人鱼发光杆菌的生长，2-4μmol/L的合成多肽PV能够有效抑制大肠杆菌和表皮葡萄球菌的生长。结果说明合成多肽PV具有显著的抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性。

合成多肽PV的发现及生物活性鉴定，在新型抗菌药物的开发上具有重要的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种改造环状多肽PV及其应用和抗菌制剂

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(16)

<223> 1和16位氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 1

Cys Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Lys Leu Lys Phe Lys Lys Trp Cys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 2

Tyr Cys Lys Phe Arg Val Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Arg Leu Arg

1 5 10 15

Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro

20