石斛兰MYB转录因子及其编码蛋白与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及石斛兰MYB转录因子及其编码蛋白与应用。

背景技术：

石斛属(Dendrobium)包括1500多个种和许多人工杂种，主要生长和种植于亚洲热带和亚热带地区和大洋洲东部。石斛兰花色艳丽，花型多样，保鲜期长，是一种观赏价值极高的花卉，与蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、文心兰属(Oncidium)和卡特兰属(Cattleya)并称为世界四大观赏洋兰，在切花、盆花、胸花、花束、配餐花等方面得到广泛应用。花瓣、萼片和唇瓣的颜色和形状是石斛兰最主要的观赏性状。石斛兰花色主要有暗红色、紫红色、粉红色、黄色、绿色和白色等，并且有丰富的着色方式，如纯色、有花纹、唇瓣颜色特异等。花青素是石斛兰花朵中的主要色素，控制紫红、粉红、桃红等颜色的形成。近年来育种者关注于改变石斛兰花色和花着色方式。然而传统杂交育种要求非常全面地收集育种资源，而且很难实现预期育种目标。随着生物技术的迅速发展，利用基因工程技术改良花色和定向培育新花色石斛兰品种将成为可能。石斛兰花瓣/萼片与唇瓣的着色方式通常不同，这暗示了同一石斛兰花朵中存在着复杂的花青素合成的调控模式。研究调控花朵呈色模式的分子机理对石斛兰花色改良有重要贡献。

R2R3-MYB转录因子是决定植物花器官中花青素苷合成时空模式的关键因素。如金鱼草的ROSEA1、ROSEA2和VENOSA；矮牵牛的AN2、DPL、PHZ等。在兰科植物中，蝴蝶兰的3个MYB转录因子基因PeMYB2、PeMYB11和PeMYB12分别控制花瓣整体的红色、红色斑点和纹理的式样，在唇瓣中，PeMYB11决定唇瓣胼胝体红色斑点的形成，而PeMYB12控制唇瓣中裂片的整体着色。

石斛兰中仅见花青素合成途径上的酶基因如CHS、CHI、F3H、F3'5'H、DFR、ANS表达量与花色的相关性研究。然而，关于石斛兰中花青素生物合成的转录调控研究尚未报道。目前为止，石斛兰中调控花青素合成的MYB基因序列及功能还未见报道。

技术实现要素：

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了石斛兰MYB转录因子及其编码蛋白与应用。

本发明所提供的石斛兰MYB转录因子，名称为DhMYB2，来源于石斛兰品种Dendrobium Blue sapphine No.3。

本发明的一个目的是提供一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与花青素合成相关的由a)衍生的蛋白质。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

将该编码基因命名为DhMYB2，将其编码的蛋白命名为DhMYB2。获得的DhMYB2基因全长的cDNA为881bp，如序列表中序列2所示；其中，序列表中序列2自5’末端第3位到第872位为开放阅读框，开放阅读框部分为870bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白，序列1由290个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的R2R3重复序列，与单子叶植物花青素合成相关MYB具有较高的保守性，C-端拥有保守的“KAx[K/R]C[S/T]”的基序。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示。

所述蛋白在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白、所述编码基因在调控花青素合成中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的转录因子DhMYB2是从石斛兰中获得的，属于单子叶植物中正调控花青素合成的MYB转录因子家族。通过反转录RT-PCR，获得了该基因的完整编码框，随后构建超量表达载体并同源瞬时转化石斛兰花瓣，发现该转录因子具有促进花青素积累的能力。

附图说明

图1为DhMYB2与已报道的单子叶植物调控花青素合成的MYB氨基酸序列比对图。PeMYB2，蝴蝶兰Phalaenopsis equestris；PsUMYB6，蝴蝶兰Phalaenopsis schilleriana；OhMYB1，文心兰Oncidium hybrid，ZmC1，玉米Zea mays。

图2为DhMYB2在不同颜色石斛兰花瓣中的表达。BS No.3,‘Blue sapphine No.3’；RB,‘Red bull’；PS,‘Pink stripe’；BWD,‘Burana white dove’。

图3为基因枪瞬时转化结果。A，转化重组质粒pCXSN-DhMYB；B，转化空载质粒pCXSN；C，转化空载质粒pCAMBIA(1303)；标尺为200μm。

图4为DhMYB2转录激活活性检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、石斛兰DhMYB2基因的克隆

以石斛兰品种Dendrobium Blue sapphine No.3(购自东方市迦南兰花种植农民专业合作社，产品目录号为D20)花朵为材料，利用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP441)法提取总RNA，使用Thermo Scientific反转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技，产品目录号为K1622)合成cDNA，以此为模板。设计全长cDNA扩增引物：F:5'-CAATGGGAAAAAATCCGTGCT-3'；R:5'-TTGTCCCTAGAATTCACTTCCTAT-3'。

用上述模板进行扩增，该反应程序为94℃3min,94℃30S,56℃30S,72℃1min 30S,30个循环，72℃。所用DNA聚合酶为Takara ExTaq酶。扩增体系：Extaq酶0.4μL，10×Extaq buffer 5μL,dNTP mix 4μL，正向引物和反向引物各1μL，模板cDNA1μL，用无菌水补足总体系50μL。扩增产物进行1％琼脂糖电泳，回收目的条带并克隆到pMD 18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6011)上测序。

结果见图1。获得的DhMYB2基因全长的cDNA为881bp，如序列表中序列2所示；其中，序列表中序列2自5’末端第3位到第872位为开放阅读框，开放阅读框部分为870bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白，序列1由290个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的R2R3重复序列，与单子叶植物花青素合成相关MYB具有较高的保守性，C-端拥有保守的“KAx[K/R]C[S/T]”的基序。

经序列比对，DhMYB2与已发表的蝴蝶兰PeMYB2和玉米ZmC1的氨基酸同源性分别为62.0％、43.9％。将该基因命名为DhMYB2，将其编码的蛋白命名为DhMYB2。

实施例2、DhMYB2基因在不同颜色的石斛兰花瓣中的表达水平比较

选取石斛兰花朵发育过程中的3个阶段：第一阶段为小蕾期(～0.5×1.0–1.5cm:宽×高)、第二阶段为大蕾期(1.5–2.0cm)、第三阶段为初开期(花朵刚刚开放)。利用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法分别提取石斛兰品种‘Blue sapphine No.3’(蓝紫色)、‘Red bull’(紫红色)(购自东方市迦南兰花种植农民专业合作社，产品目录号为D4)、‘Pink stripe’(粉红色)(购自东方市迦南兰花种植农民专业合作社，产品目录号为D10)、‘Burana white dove’(白色)(购自东方市迦南兰花种植农民专业合作社，产品目录号为D16)3个发育阶段的花瓣中总RNA，将总RNA反转录为cDNA(使用Thermo Scientific反转录试剂盒，合成cDNA)。使用Takara SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为RR420A)荧光定量试剂盒分析DhMYB2基因在不同颜色石斛兰花瓣中的表达水平。实时荧光定量PCR检测DhMYB2基因所用的引物如下：

DhMYB2-qF：5′-TGATTGCTGGAAGGCTACCC-3′；

DhMYB2-qR：5′-TCTTTGTATGATGCTTGGGCG-3′。

实时荧光定量PCR的扩增反应程序：95℃3min；95℃10s、56℃30s、72℃30s，40个循环。

DhMYB2基因的相对表达水平以18S基因为内参进行归一化，用2^–△CT法表示基因的相对定量。

结果见图2。在蓝紫色、紫红色和粉红色花瓣中，DhMYB2基因在花朵开放前表达量增加，在第三阶段花朵初开时表达量急剧下降。且DhMYB2基因在蓝紫色和紫红色花瓣中的表达量比其在粉红色和白色花瓣中的表达量高得多。

实施例3、石斛兰DhMYB2基因表达载体的构建和功能分析

以已测序的pMD 18-T-DhMYB2质粒为模板，用Extaq酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为RR001A)扩增(扩增所用的引物F:5'-CAATGGGAAAAAATCCGTGCT-3'；R：5'-TTGTCCCTAGAATTCACTTCCTAT-3'，引物同实施例1)出包含完整ORF和终止密码子的DhMYB2片段，通过TA克隆连接到pCXSN(T-载体)(Chen S,Songkumarn P,Liu J,Wang G.A versatile zero background T-Vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiology,2009,150:1111–1121)上，并测序确认连接无误，提取构建好的过表达质粒pCXSN-DhMYB2备用。

利用GJ-1000高压气体基因枪将pCXSN-DhMYB2和对照质粒pCXSN空载和pCAMBIA1303(Hajdukiewicz P,Svab Z,Maliga P.The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol.Biol.,1994,25(6):989-994)空载轰击导入石斛兰品种‘Burana charming’(购自东方市迦南兰花种植农民专业合作社，产品目录号为D5)的白色花瓣中。基因枪轰击参数为：压力7MPa，轰击距离55cm，真空度为-0.085MPa。轰击后将花瓣转移至MS培养基上，封口。在25℃,16h光/8h黑暗的光周期下培养2天，用体式显微镜进行观察。

结果见图3。瞬时表达DhMYB2基因导致白色花瓣组织产生了紫色的色素斑点。转化pCXSN空载的花瓣没有产生任何色素斑点。转化pCAMBIA1303后的花瓣组织，经GUS染色产生了蓝色的斑点，表明瞬时表达成功。

实施例4、DhMYB2蛋白的转录激活活性分析

将DhMYB2基因亚克隆于pGBKT7载体(clontech，产品序列号630489)中，步骤如下：

以实施例1中DhMYB2-pMD 18-T质粒为模板，以引物：F：5'-CCCATATGGGAAAAAATCCGTGCT-3'；R：5'-CATGCCATGGCTAGAATTCACTTCCTATATC-3'扩增包含NdeI和NcoI酶切位点、完整ORF和终止密码子的DhMYB2片段。

DNA片段和pGBKT7载体用NdeI(购自赛默飞世尔科技，产品序列号FD0583)和NcoI(购自赛默飞世尔科技，产品序列号FD0573)限制性内切酶双酶切后，用T4DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为2011A)连接构建融合载体，测序确认连接无误，提取构建好的质粒pGBK-DhMYB2备用。

使用杰美基因的小量酵母细胞完全转化试剂盒，依照说明书将pGBK-DhMYB2导入酵母Y2HGold菌株(clontech)中表达，以转化pGBKT7空载为阴性对照。

将转化目的基因以及空载体后的酵母Y2HGold菌株接种到SD-Trp(色氨酸)一缺酵母缺陷培养基上，筛选阳性克隆。将阳性克隆转接到SD-Trp-Ade(腺嘌呤)-His(组氨酸)三缺酵母缺陷培养基进一步筛选，最后用含有X-α-gal的三缺培养基验证α-galactosidase活性的方法，检测其转录激活活性。

SD培养基配方：0.67％YNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids)，2％葡萄糖，0.06％Ade/-His/-Leu/-Trp DO supplement，1％100×AA(氨基酸)溶液，2％琼脂。

其中100×AA配方：分别称取腺嘌呤0.5g，组氨酸2.0g，亮氨酸10.0g溶于1000ml的水中。

其中YNB购自上海生工，产品序号A610507；葡萄糖购自Sigma，产品序号G8270；Ade/-His/-Leu/-Trp DO supplement购自Clontech，产品序号630428；L-亮氨酸，购自上海生工，产品序号A100811-0025；腺嘌呤，购自上海生工，产品序号A600013-0025；L-组氨酸，购自上海生工，产品序号5934-29-2。

结果见图4。在Trp-一缺培养基上转化pGBKT7空载和重组质粒pGBKT7-DhMYB2均可以正常生长，表明转化成功。在三缺培养基上，转化pGBKT7空载的酵母菌株不能生长，而转化重组质粒pGBKT7-DhMYB2的酵母菌株可以正常生长，且经X-gal活性检测，能够与X-gal反应显色。上述结果证明，DhMYB2具有转录激活活性。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所

<120> 石斛兰MYB转录因子及其编码蛋白与应用

<130> P160686/RKY

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 石斛兰品种Dendrobium Blue sapphine No. 3

<400> 1

Met Gly Lys Asn Pro Cys Cys Phe Lys Glu Gly Leu Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Thr Ser Glu Asp Met Leu Leu Lys Ala Phe Val Asn Ile His

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Trp Thr Thr Val Pro His Lys Ala Gly Leu Arg Arg

35 40 45

Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn

50 55 60

Val Lys His Gly Asn Phe Ser Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile Ile Arg

65 70 75 80

Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ile Thr Leu

100 105 110

Cys Lys Lys Ala Ser Phe Gln His Gln Met His Gln Pro Ser Arg Pro

115 120 125

Ser Ile Ile Gln Arg Pro Pro Thr Ser Asn Leu Gly Phe Pro Thr Ser

130 135 140

Ser Ser Thr Thr Gln Ser Gln Ala Ala Thr Asn Asp Thr Thr Leu Ile

145 150 155 160

Leu Thr Thr Ala Ile Arg Cys Asn Lys Leu Ala Ile Pro Met Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Ser Ser Thr Ser Lys Gln Glu Ile Pro Asn Met Gln Leu Ala

180 185 190

Glu Glu Ser Ile Ala Lys Val Ala Ser Met Ile Pro Glu Ser Ser Lys

195 200 205

Val Gly Pro Leu Val Glu Glu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Phe Gln Val

210 215 220

Glu Glu Asn Met Val Leu Asn Asn Asp Lys Phe Asn Asp Asp Asn Ile

225 230 235 240

Val Ser Phe Pro Asp Gln Ala Ala Val Met Glu Phe Glu Arg Leu Gln

245 250 255

Asp Phe Glu Lys Trp Met Leu Asn Asp Glu Asp Val Asp Cys Leu Pro

260 265 270

Pro Asn Asp Gln Met Arg Met Leu Thr Ser Leu Phe Asp Ile Gly Ser

275 280 285

Glu Phe

290

<210> 2

<211> 881

<212> DNA

<213> 石斛兰品种Dendrobium Blue sapphine No. 3

<400> 2

caatgggaaa aaatccgtgc tgcttcaagg aagggcttaa caagggagca tggactactt 60

cggaagacat gctcttgaag gctttcgtca atattcatgg agaaggcaaa tggacgacgg 120

tgccacacaa agcagggctg agaaggtcgg ggaagagctg tcgactccga tggctaaatt 180

acctgaggcc caacgttaaa catggaaact tttccgagga agaggacgac ctcatcatca 240

gacttcataa actccttggc aatagatggt ctctgattgc tggaaggcta cccggtcgga 300

cagataatga aataaaaaac tattggaaca taaccttatg taagaaagca agctttcaac 360

atcaaatgca tcagccaagc cgcccaagca tcatacaaag acctccaact tctaatcttg 420

gatttccaac atcatcatct acaacacaat cacaagctgc cacaaatgat acaactttga 480

tcctaacaac ggccataagg tgcaataaac tggctattcc aatgctactt ccatcttctt 540

caacaagtaa gcaggagatc ccaaacatgc aattagcaga agagtcaata gctaaagtgg 600

ctagtatgat tcctgaaagc agcaaagttg gtcccttggt agaagaagat ctttttaagg 660

aactatttca ggtggaggag aatatggttt tgaataacga caaatttaat gatgacaata 720

ttgtttcatt tcctgatcaa gcggctgtaa tggagtttga aagattacaa gattttgaga 780

aatggatgct gaatgatgaa gatgttgatt gccttcctcc taatgatcaa atgcgtatgt 840

tgacctcttt atttgatata ggaagtgaat tctagggaca a 881

<210> 3

<211> 870

<212> DNA

<213> 石斛兰品种Dendrobium Blue sapphine No. 3

<400> 3

atgggaaaaa atccgtgctg cttcaaggaa gggcttaaca agggagcatg gactacttcg 60

gaagacatgc tcttgaaggc tttcgtcaat attcatggag aaggcaaatg gacgacggtg 120

ccacacaaag cagggctgag aaggtcgggg aagagctgtc gactccgatg gctaaattac 180

ctgaggccca acgttaaaca tggaaacttt tccgaggaag aggacgacct catcatcaga 240

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caaatgcatc agccaagccg cccaagcatc atacaaagac ctccaacttc taatcttgga 420

tttccaacat catcatctac aacacaatca caagctgcca caaatgatac aactttgatc 480

ctaacaacgg ccataaggtg caataaactg gctattccaa tgctacttcc atcttcttca 540

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ctatttcagg tggaggagaa tatggttttg aataacgaca aatttaatga tgacaatatt 720

gtttcatttc ctgatcaagc agctgtaatg gagtttgaaa gattacaaga ttttgagaaa 780

tggatgctga atgatgaaga tgttgattgc cttcctccta atgatcaaat gcgtatgttg 840

acctctttat ttgatatagg aagtgaattc 870

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA扩增引物F

<400> 4

caatgggaaa aaatccgtgc t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA扩增引物R

<400> 5

caaaacttca tccctagcca ca 22