本发明涉及蛋白质研究领域，特别是涉及一种红树植物秋茄抗香蕉炭疽病菌蛋白的提取方法。
背景技术：
香蕉炭疽病(Calletotrichum musae)是危害香蕉生产最严重的病菌之一，浸染具有潜伏性，使得采后香蕉在运输期间的发病十分严重。采取化学手段对香蕉炭疽病进行控制容易造成农药残留超标和环境污染，且长期大量使用化学药物易使病菌产生耐药性，所以从自然界中寻找高效、无毒、环保的植物天然抑菌成分，用于果蔬的炭疽病害防治，越来越受到人们的重视。
红树林(Mangrove)是自然分布于热带与亚热带海潮间带(能受到潮水周期性浸淹的海岸地带)的植物群落，包括常绿灌木或乔木、藤本及草本红树植物。红树植物群落通常生长在港湾河口地区的淤泥质滩涂上,是海滩上特有的森林类型，是陆地向海洋过渡的特殊生态系，有碧海绿洲的美称。独特的地理环境使得生长在这里的红树林群落也具有其一定的特殊性，有着重要的生态价值和科研价值。秋茄(Kandelia candel(Linn.)Druce)是红树植物中的常见物种，其抗逆性强，分布广泛，其蛋白质的研究具有重要的科研和经济价值。
具有抗菌活性的蛋白是植物生理反应中一种重要的免疫分子，具有天然、无副作用等优点，用具重要的研究和利用价值。有由于红树植物中含有大量的单宁、多糖、多酚、色素等刺激代谢产物，严重影响了蛋白提取时的构象和活性的保存，并且红树植物中的蛋白质含量相对较低，所以活性蛋白的提取变得更加困难。秋茄叶片组织中含有的单宁含量很高，使其蛋白质的提取十分困难，如何获得具有抗菌活性的蛋白对于秋茄蛋白组学的研究和应用显得至关重要。
William S等报道了pvpp在植物蛋白的提取过程中能够有效去除多酚物质，Haslam E等人也报道了去除蛋白中的单宁的方法，但仍然不能很好地将干扰物质从红树植物中去除，这表明还是有很多干扰杂质的存在。目前，还未见有关红树植物秋茄蛋白的抗菌活性应用的报道，尤其是作用于香蕉炭疽病菌。本发明改良了提取缓冲体系的配方，并联合传统的硫酸铵分级沉淀法，具有经济、安全、操作简便等优点。
技术实现要素：
针对上述存在的不足，本发明的目的是提供一种高效、稳定的秋茄抗香蕉炭疽蛋白的一种提取方法，采用这样的提取方法操作简便、蛋白质稳定、抗菌活性高，且提取过程经济、安全、绿色环保，符合现代化绿色生产的要求。
本发明通过以下技术方案解决上述问题：
一种红树植物秋茄抗香蕉炭疽病菌蛋白的提取方法，包括如下步骤：
步骤1：取秋茄新鲜叶片，在4℃条件下剪碎，加入液氮和10％的pvpp，充分冷冻研磨，并将研磨好的粉末保存至-20℃冰箱备用；
步骤2：将ris-HCl提取液与研磨的秋茄粉末以1:10的比例混匀，并在4℃条件下，使用超声并浸提24h；
步骤3：待步骤2结束后，在4℃条件下12000r/min离心25min，取上清液；
步骤4：4℃条件下，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵沉淀24h；
步骤5：4℃条件下12000r/min离心30min，取沉淀，用超纯水复溶；
步骤6：4℃条件下在步骤5中剩下的上清液中继续缓慢加入硫酸铵沉淀24h，重复步骤5 1-3次。
步骤7：用Sephadex-G25脱盐，冷冻干燥，得到所提取抗菌蛋白干粉；
步骤8：将抗菌蛋白干粉溶解于pH7.2的PBS缓冲液中，即可用于抑菌实验。
上述方案中，优选的是步骤2中的Tris-HCl提取液，其配方为，在0.5mol/l Tris和30mmol/l HCl配制成的缓冲液中加入20.53％蔗糖、1.46％EDTA、0.29％NaCl、0.37％KCl、1％pvp、1.63％抗坏血酸和0.80％芦丁。
上述方案中，优选的是Tris-HCl提取液的pH调整为7-10。
上述方案中，优选的是Tris-HCl提取液于4℃条件下预冷2h。
上述方案中，优选的是步骤2中超声条件为200w，时间6min。
上述方案中，优选的是步骤4中加入的硫酸铵至饱和度为40-45％。
上述方案中，优选的是步骤6中加入的硫酸铵至饱和度为65-75％。
本发明的优点与效果是：
1、本发明在提取缓冲体系中加入适量的pvpp,有效增强了秋茄叶子组织中多酚物质的去除；
2、本发明在提取缓冲体系中加入适量的蔗糖、EDTA、NaCl、KCl，有效保持了在提取过程中蛋白的抗菌活性；
3、本发明在提取缓冲体系中加入适量的抗坏血酸和芦丁，有效地防止了蛋白在提取过程中被氧化而失活；
4、本发明联合传统的硫酸铵分级沉淀法提取的秋茄抗菌蛋白具有很高的抗菌活性，具有经济、安全、操作简便等优点，符合现代化绿色生产的要求；对其他红树植物的抗菌蛋白的提取具有借鉴意义，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明使用称干重法测得提取蛋白对香蕉炭疽病菌的抑菌率柱形图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
一种红树植物秋茄抗香蕉炭疽病菌蛋白的提取方法，包括如下步骤：
步骤1：取秋茄新鲜叶片，在4℃条件下剪碎，加入液氮和10％的pvpp，充分冷冻研磨，并将研磨好的粉末保存至-20℃冰箱备用。
步骤2：将ris-HCl提取液与研磨的秋茄粉末以1:10的比例混匀，并在4℃条件下，使用超声并浸提24h。其中，Tris-HCl提取液，其配方为，在0.5mol/l Tris和30mmol/l HCl配制成的缓冲液中加入20.53％蔗糖、1.46％EDTA、0.29％NaCl、0.37％KCl、1％pvp、1.63％抗坏血酸和0.80％芦丁。Tris-HCl提取液的pH调整为7-10，Tris-HCl提取液于4℃条件下预冷2h，超声条件为200w，时间6min。
步骤3：待步骤2结束后，在4℃条件下12000r/min离心25min，取上清液。
步骤4：4℃条件下，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵沉淀24h，硫酸铵至饱和度为40-45％。
步骤5：4℃条件下12000r/min离心30min，取沉淀，用超纯水复溶；
步骤6：4℃条件下在步骤5中剩下的上清液中继续缓慢加入硫酸铵沉淀24h，重复步骤5 1-3次；其中，硫酸铵至饱和度为65-75％。
步骤7：用Sephadex-G25脱盐，冷冻干燥，得到所提取抗菌蛋白干粉。
步骤8：将抗菌蛋白干粉溶解于pH7.2的PBS缓冲液中，即可用于抑菌实验。
具体实验过程：
配制PDA液体培养基，经121℃灭菌20min后，在无菌条件下加入抗菌蛋白液，配制成浓度为10μg/mL的含抗菌蛋白培养基，并接种香蕉炭疽病菌的孢子悬液5μL(浓度为106个/mL)，以PBS为阴性对照，以多菌灵为阳性对照，于28℃恒温摇床培养4d，观察培养液中菌丝球的生长情况，并以称量菌体干重的方法计算抑菌率。抑菌率＝(阴性对照组菌体干重-处理组菌体干重)/阴性对照组菌体干重×100％
表1秋茄抗菌蛋白对香蕉炭疽病菌的抑制作用
注：抗菌蛋白Ⅰ为45％硫酸铵沉淀蛋白，Ⅱ为75％硫酸铵沉淀蛋白
从表1的数据可以看出抗菌蛋白Ⅰ和Ⅱ都具有很强的抗菌能力，在30μg/mL浓度的处理下，其抑菌率分别达到95.71％和95.18％，而相同浓度的多菌灵对香蕉炭疽病菌的抑菌率为95.09％，说明从秋茄中提取的抗菌蛋白对香蕉炭疽病菌的抑制能力与多菌灵相当，甚至强于多菌灵对香蕉炭疽病菌的抑制力。
如图1所示，横轴的1,2,3分别代表30μg/mL的抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ和多菌灵阳性对照，从柱状图可以看出，抗菌蛋白Ⅰ、Ⅱ对香蕉炭疽病菌的抑制率与相同浓度下的多菌灵相当甚至略高于多菌灵。说明用此种方法从秋茄中提取的抗菌蛋白具有比常规的抗菌药多菌灵更强的抑菌能力。
在实际实验对比中可以发现在阴性对照组培养基中的香蕉炭疽病菌形成了形状规则的菌丝球，且培养基液体澄清。而抗菌蛋白处理组中的香蕉炭疽病菌并没有形成菌丝球，培养基呈浑浊的状态，说明在抗菌蛋白的作用下香蕉炭疽病菌的菌丝生长遭到一定程度的破坏，从而生长被抑制。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明并不限于实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请的范围内。