N15多肽在制备真菌抑制剂中的用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体指n15多肽在制备真菌抑制剂中的用途。

背景技术：

真菌可引起动植物的多种病害，不仅影响农作物产量、经济动物生长生产，造成极大的经济损失，而且影响人体健康，威胁人类生命安全。为了抑制和消灭病原真菌，人们一直致力于寻找有效的抗真菌药物。红色毛癣菌是毛癣菌属下的一个种。红色毛癣菌是一种人源的皮癣菌，引起常见的皮肤浅部真菌病，如手癣、足癣、头癣等。近二十年来，由皮肤癣菌及其他真菌引起的感染明显增多。目前发现有四十余种皮肤癣菌主要有红色毛癣菌，须癣毛癣菌，犬小孢子菌等。红色毛癣菌(trichophytonrubrum)属于有丝分裂孢子真菌，ichangjiande亲人性治病性皮肤癣菌。为世界性分布，也是我国最常见的一种皮肤癣菌。

酵母菌是真菌中比较有代表性的一类，它是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称，可用于酿造生产，有的为致病菌。酵母菌是某些种类的真菌(真菌自然地存在于身体之内)。然而体内真菌过多也会造成问题，酵母菌感染可能会发生在身体的任何部位，主要是因为病人免疫力低下，导致体内菌群失衡引起的，瘙痒、灼痛是酵母菌感染的主要症状。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种多肽，该多肽能够抑制多种真菌，包括酵母菌生长，具有在制备真菌抑制剂中的用途，它已被现有技术公开，名为n15多肽。

n15多肽是一个具有15个氨基酸的短肽，其序列为甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸，它具有多种生物学功能，包括调节nf-κb转录因子结合目的基因的能力，影响nf-κb目的基因产物蛋白质的转录和表达；阻断pcna结合dna聚合酶，从而阻止细胞dna合成抑制细胞增殖；抑制上皮细胞增生，调节表皮增生及分化，使皮肤角化过程正常化等。

发明人发现在研究中发现n15多肽能够对各种真菌的生长产生抑制作用。

前期研究表明，在酵母中加入n15会起到抑制酵母增殖的效果。通过检测酵母细胞内dna含量发现，n15会引起酵母细胞内的dna含量的减少，因此n15抑制酵母细胞的增殖可能是通过抑制基因组dna复制而实现的。此外，我们的结果显示n15多肽还可以抑制红色毛癣菌、白色念珠菌的增殖。

本发明还提供了一种n15多肽制备的抗真菌药物，为n15多肽的水溶液，浓度大于等于500μg/ml。

本发明的有益效果：n15多肽是一种结构清晰，易于工业化生产的多肽，它可以抑制酵母、白色念珠菌、红色毛癣菌等多种真菌的增殖，效果好且无毒副作用。

附图说明

图1为n15对酿酒酵母的生长抑制实验的效果对比照片。

图2为流式细胞仪检测n15对酿酒酵母dna含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实验例对本发明作进一步的论证说明，以下实验例仅是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实验例。

实验例1：n15对酿酒酵母的生长具有抑制作用

实验方法：

在35mm直径的培养皿中制备yepd培养基固体平板，再将n15涂布在固体平板上(n15的终浓度为2mg/ml)。取过夜培养的饱和酿酒酵母菌液，用生理盐水，倍比稀释到10^-4浓度，取菌液50μl加入到固体平板中，用无菌玻璃棒涂布均匀，30度培养48小时，观察实验结果，结果见图1。

结果显示，平板上可见白色的圆形酵母菌单菌落，边缘整齐，表面光滑湿润。和对照酵母菌单菌落相比，加入n15多肽的酵母菌(b1)单菌落直径明显偏小，n15对酿酒酵母生长具有抑制效应。

实验例2：n15对酿酒酵母的dna复制具有抑制效应

实验方法：

制备yepd液体培养基，培养酿酒酵母，并加入n15到yepd液体培养基中，同时设置不加n15多肽的酿酒酵母作为对照(control)，首先使用α因子对酵母细胞进行细胞周期同步化处理，获得同步化的酵母细胞。再加入n15多肽(终浓度500μg/ml)，在处理0小时、1小时、2小时、15小时、15.5小时、16小时分别取样2ml酵母菌体，加入sytox-green染料对酵母细胞dna染色后，使用流式细胞仪进行酿酒酵母细胞的dna相对含量进行测定，结果见图2和表1。

表1.n15对酿酒酵母dna复制抑制结果对照表(酿酒酵母细胞的相对dna含量)

如实验结果所示，横坐标表示单个酵母细胞内dna的含量，纵坐标表示酵母细胞数量。在n15处理2小时内，n15处理细胞内的dna含量和对照细胞相比没有显著性差异，而随着时间的增加，在n15处理15小时以后，n15处理细胞内的dna含量和对照细胞相比明显减少。该结果表明n15会引起酵母细胞dna含量的减少。

实验例3：n15对白色念珠菌的生长具有抑制作用

称取n15多肽干粉1mg.将其溶解于1ml无菌h2o中，配制成1mg/ml的母液，再以倍比稀释法稀释成不同浓度梯度的n15溶液。将不同浓度的n15溶液滴加到无菌滤纸片上.制成n15剂量为100、50、20、10、5、2、0.5(单位μg/片)的药敏纸片。将白色念珠菌液涂至沙堡氏琼脂培养基平板上。将不同剂量的n15药敏纸片以及pbs空白对照药敏纸片贴至平扳上，置于28℃温箱内培养24小时，对结果进行测量。结果如表2所示。

表2.纸片法n15对白色念珠菌产生的抑菌环直径比较表

如结果所示，在递减剂量的n15药敏纸片中，前6个剂量梯度的n15药敏纸片对其周围的白色念珠菌均产生了明显抑菌环。其中高剂量组n15(100μg/片)药敏纸片对白色念珠菌的抑菌环直径为15±2.3mm，随着n15多肽的浓度降低，抑菌环的直径也逐渐减小，当n15多肽的剂量低于10μg/片时，未出现明显的抑菌环。

实验例4：n15对红色毛癣菌的生长具有抑制作用

称取n15多肽干粉1mg.将其溶解于1ml无菌h2o中，配制成1mg/ml的母液，再以倍比稀释法稀释成不同浓度梯度的n15溶液。将接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基(pda)上的红色毛癣菌室温培养转种2次后，无菌生理盐水反复冲洗菌落表面，收集菌丝片段和孢子液体，经洗涤震荡，采用血细胞计数板计数方法，rpmi-1640做稀释将悬液调制成(0.4～5)×10⁴cfu/ml菌悬液备用。1～8孔每孔加0.1ml终浓度药液，设阴性对照孔(加菌液不加药液)，空白对照孔(只加rpmi-1640培养液)，加0.1ml菌悬液，倍比稀释后得到1.024，0.512，0.256，0.128，0.064，0.032，0.016和0.008mg/ml的8个浓度混合液，室温孵育7天。

依照下列标准打分：0：肉眼清晰；1：略模糊(80％受抑制)；2：浊度显著减低(50％受抑制)；3：浊度轻度减低；4：浊度未减低。本实验取1(略模糊)或2(浊度显著减低)为判定终点。结果显示，n15的mic为500～700μg/ml。

n15多肽的抑菌效果可作用于多种真菌，上述实施例仅为对真菌抑制剂的举例，挑选了较有代表性的真菌，无法将所有真菌种类的抑制实验例一一列出，不因此限制本发明的范围。