一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用的制作方法

本发明涉及无细胞表达领域，具体涉及一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用。

背景技术：

结构和功能分析需要大量的膜蛋白样本，但是一个瓶颈是如何大批量高效的获得膜蛋白。无细胞表达系统是偶联的转录翻译系统，降低了表达蛋白的复杂性。采用助表达序列的策略可以基于翻译起始的优化带来无细胞表达效率的快速提高。高频使用稀有密码子以及不利起始翻译已被确定为蛋白质生物合成的主要限制步骤，在mRNA的5'端区域，如核糖体结合位点涉及高风险的二级结构的形成可以减缓甚至阻止启动程序，高频的稀有密码子可能造成翻译停顿，错配的氨基酸，甚至过早终止事件，但这样的问题可以由合成基因表达的优化来解决。

腺苷酸环化酶，简称ADCY，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白，是G蛋白的效应物，能催化ATP生成cAMP，引起细胞应答。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并释放焦磷酸。腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。腺苷酸环化酶(ADCY)是G蛋白偶联受体(GPCRs)下游的关键信号分子。基本上标准的无细胞是无法表达出完整的蛋白分子的，所以需要对无细胞表达条件进行改进。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用，能解决无细胞蛋白表达量低的问题。

本发明通过以下技术方案实现：本发明的一种助表达序列，所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示或与其具有至少75％的同源性的氨基酸序列。

进一步地，所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。

本发明还提供了一种如上述所述的助表达序列在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用，其应用方法如下：

步骤(1)：将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接；

步骤(2)：设计引物并引入双酶切位点，将步骤(1)中连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上，获得表达质粒；

步骤(3)：配制无细胞蛋白表达体系，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将步骤(2)中获得的表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，ADCY2基因和助表达序列还含有蛋白酶酶切位点序列，所述蛋白酶酶切位点序列为凝血酶酶切位点或肠激酶酶切位点。

作为进一步的优选，所述表达时为半连续性物质交换反应，将表达体系中的成分放入透析管中，并将透析管置于含有供应试剂的离心管中进行表达。

作为进一步的优选，所述供应试剂包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、氨基酸、磷酸烯醇式丙酮酸、PET8000、大肠杆菌抽提物。

本发明的有益效果为：本发明通过在ADCY2基因上添加助表达序列进行无细胞表达，蛋白表达量高，解决了无细胞蛋白表达量低的问题。

附图说明

图1为构建后pET28a-ADCY2载体图谱；

图2为实施例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图；

图3为对比例1和对比例2的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

本发明提供的一种助表达序列，所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示或与其具有至少75％的同源性的氨基酸序列。所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。

本发明的助表达序列在无细胞表达ADCY2蛋白中的具体应用方法如下：

步骤(1)：将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接；

步骤(2)：设计引物并引入双酶切位点，将步骤(1)中连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上，获得表达质粒；

步骤(3)：配制无细胞蛋白表达体系，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将步骤(2)中获得的表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。

步骤(1)中，ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签，三段序列连接成整个序列，作为PCR反应的模板，ADCY2基因和助表达序列还含有蛋白酶酶切位点序列，所述蛋白酶酶切位点序列为凝血酶酶切位点或肠激酶酶切位点；

步骤(2)中，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)，以连接目的片段为模板，加入DNA聚合酶和10倍的DNA聚合酶缓冲液进行PCR扩增反应，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化，纯化后的待表达基因片段进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收，将含酶切位点的待表达基因片段与线性pET28a质粒混合，加入T4DNA连接酶、10×T4DNA连接酶缓冲液，连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，取阳性克隆菌株进行DNA测序，对经测序确证认、含pET28a重组质粒的菌落进行质粒提纯，得到pET28a-ADCY2质粒。

步骤(3)中，所述表达为半连续性物质交换反应，将表达体系中包括如下反应液成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；供应试剂装于离心管中；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。

实施例1

1.对ADCY2基因进行密码子优化，优化后的密码子序列见序列表2，在密码子优化后序列的ADCY2基因的N段添加助表达序列B-tag(ATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTAT；氨基酸序列为IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCY)，C端添加10×his(丝氨酸)标签(CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT；HHHHHHHHHH)，基因合成整个序列，作为基因克隆的模板。

2.取上述合成的含B-tag和10×his标签目的片段作为PCR反应的模板，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)。分别取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶缓冲液、5.0μL dNTP混合作为PCR反应体系。用无菌水将反应液调至50μL，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化。纯化后的ADCY2片段进行双酶切，反应体系如下：30μL添加了酶切位点的ADCY2片段、5μL 10×缓冲液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用无菌水将反应液调至50μL后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pET28a质粒载体转化大肠杆菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

3.pET28a-ADCY2重组表达载体的构建(构建后的pET28a-ADCY2载体图谱如图1所示)：将上述含酶切位点的ADCY2片段与线性pET28a质粒按2:1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μL T4DNA连接酶、2μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-ADCY2重组质粒的菌落进行质粒提纯。

4.无细胞蛋白半连续反应表达体系的合成，反应液包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于D-Tube^TM透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；取4.5mL供应试剂装于50mL离心管中，供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。

对比例1

1.对ADCY2基因进行密码子优化，优化后的密码子序列见序列表2，在密码子优化后序列的ADCY2基因的C端添加10×his标签(CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT；HHHHHHHHHH)，基因合成整个序列，作为基因克隆的模板。

2.取上述合成的含10×his标签目的片段作为PCR反应的模板，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGG ATGTGGCAGGAA

GCTATG-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)。分别取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶缓冲液、5.0μL dNTP混合作为PCR反应体系。用无菌水将反应液调至50μL，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化。纯化后的ADCY2片段进行双酶切，反应体系如下：30μL添加了酶切位点的ADCY2片段、5μL 10×缓冲液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用无菌水将反应液调至50μL后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pET28a质粒载体转化大肠杆菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

3.pET28a-ADCY2重组表达载体的构建：将上述含酶切位点的ADCY2片段与线性pET28a质粒按2:1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μL T4DNA连接酶、2μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-ADCY2重组质粒的菌落进行质粒提纯。

4.无细胞蛋白半连续反应表达体系的合成，反应液包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物。取300μl反应液于D-Tube^TM透析管(3.5kDa)中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；取4.5mL供应试剂装于50mL离心管中，供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。

对比例2

1.取含ADCY2基因的克隆片段作为PCR反应的模板，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATGTGGCAGGAGGCG-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGGGATGCCACGTTGCTCTGGG-3’)。分别取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶缓冲液、5.0μL dNTP混合作为PCR反应体系。用无菌水将反应液调至50μL，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化。纯化后的ADCY2片段进行双酶切，反应体系如下：30μL添加了酶切位点的ADCY2片段、5μL 10×缓冲液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用无菌水将反应液调至50μL后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pET28a质粒载体转化大肠杆菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

2.pET28a-ADCY2重组表达载体的构建：将上述含酶切位点的ADCY2片段与线性pET28a质粒按2:1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μL T4DNA连接酶、2μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-ADCY2重组质粒的菌落进行质粒提纯。

3.无细胞蛋白半连续反应表达体系的合成，反应液包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于D-Tube^TM透析管(3.5kDa)中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；取4.5mL供应试剂装于50mL离心管中，供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。

实施例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图如图2所示，对比例1和对比例2的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图如图3所示。由图2和图3可知，通过添加本发明的助表达序列后ADCY2无细胞表达明显，且表达量高。

<110> 武汉华美生物工程有限公司

华, 权高

<120> 一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr

20 25

<210> 2

<211> 3273

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgtggcagg aagctatgcg tcgtcgtcgt tacctgcgtg accgttctga agaagctgct 60

ggtggtggtg acggtctgcc gcgttctcgt gactggctgt acgaatctta ctactgcatg 120

tctcagcagc acccgctgat cgttttcctg ctgctgatcg ttatgggttc ttgcctggct 180

ctgctggctg ttttcttcgc tctgggtctg gaagttgaag accacgttgc tttcctgatc 240

accgttccga ccgctctggc tatcttcttc gctatcttca tcctggtttg catcgaatct 300

gttttcaaaa aactgctgcg tctgttctct ctggttatct ggatctgcct ggttgctatg 360

ggttacctgt tcatgtgctt cggtggtacc gtttctccgt gggaccaggt ttctttcttc 420

ctgttcatca tcttcgttgt ttacaccatg ctgccgttca acatgcgtga cgctatcatc 480

gcttctgttc tgacctcttc ttctcacacc atcgttctgt ctgtttgcct gtctgctacc 540

ccgggtggta aagaacacct ggtttggcag atcctggcta acgttatcat cttcatctgc 600

ggtaacctgg ctggtgctta ccacaaacac ctgatggaac tggctctgca gcagacctac 660

caggacacct gcaactgcat caaatctcgt atcaaactgg aattcgaaaa acgtcagcag 720

gaacgtctgc tgctgtctct gctgccggct cacatcgcta tggaaatgaa agctgaaatc 780

atccagcgtc tgcagggtcc gaaagctggt cagatggaaa acaccaacaa cttccacaac 840

ctgtacgtta aacgtcacac caacgtttct atcctgtacg ctgacatcgt tggtttcacc 900

cgtctggctt ctgactgctc tccgggtgaa ctggttcaca tgctgaacga actgttcggt 960

aaattcgacc agatcgctaa agaaaacgaa tgcatgcgta tcaaaatcct gggtgactgc 1020

tactactgcg tttctggtct gccgatctct ctgccgaacc acgctaaaaa ctgcgttaaa 1080

atgggtctgg acatgtgcga agctatcaaa aaagttcgtg acgctaccgg tgttgacatc 1140

aacatgcgtg ttggtgttca ctctggtaac gttctgtgcg gtgttatcgg tctgcagaaa 1200

tggcagtacg acgtttggtc tcacgacgtt accctggcta accacatgga agctggtggt 1260

gttccgggtc gtgttcacat ctcttctgtt accctggaac acctgaacgg tgcttacaaa 1320

gttgaagaag gtgacggtga catccgtgac ccgtacctga aacagcacct ggttaaaacc 1380

tacttcgtta tcaacccgaa aggtgaacgt cgttctccgc agcacctgtt ccgtccgcgt 1440

cacaccctgg acggtgctaa aatgcgtgct tctgttcgta tgacccgtta cctggaatct 1500

tggggtgctg ctaaaccgtt cgctcacctg caccaccgtg actctatgac caccgaaaac 1560

ggtaaaatct ctaccaccga cgttccgatg ggtcagcaca acttccagaa ccgtaccctg 1620

cgtaccaaat ctcagaaaaa acgtttcgaa gaagaactga acgaacgtat gatccaggct 1680

atcgacggta tcaacgctca gaaacagtgg ctgaaatctg aagacatcca gcgtatctct 1740

ctgctgttct acaacaaagt tctggaaaaa gaataccgtg ctaccgctct gccggctttc 1800

aaatactacg ttacctgcgc ttgcctgatc ttcttctgca tcttcatcgt tcagatcctg 1860

gttctgccga aaacctctgt tctgggtatc tctttcggtg ctgctttcct gctgctggct 1920

ttcatcctgt tcgtttgctt cgctggtcag ctgctgcagt gctctaaaaa agcttctccg 1980

ctgctgatgt ggctgctgaa atcttctggt atcatcgcta accgtccgtg gccgcgtatc 2040

tctctgacca tcatcaccac cgctatcatc ctgatgatgg ctgttttcaa catgttcttc 2100

ctgtctgact ctgaagaaac catcccgccg accgctaaca ccaccaacac ctctttctct 2160

gcttctaaca accaggttgc tatcctgcgt gctcagaacc tgttcttcct gccgtacttc 2220

atctactctt gcatcctggg tctgatctct tgctctgttt tcctgcgtgt taactacgaa 2280

ctgaaaatgc tgatcatgat ggttgctctg gttggttaca acaccatcct gctgcacacc 2340

cacgctcacg ttctgggtga ctactctcag gttctgttcg aacgtccggg tatctggaaa 2400

gacctgaaaa ctatgggttc tgtttctctg tctatcttct tcatcaccct gctggttctg 2460

ggtcgtcaga acgaatacta ctgccgtctg gacttcctgt ggaaaaacaa attcaaaaaa 2520

gaacgtgaag aaatcgaaac tatggaaaac ctgaaccgtg ttctgctgga aaacgttctg 2580

ccggctcacg ttgctgaaca cttcctggct cgttctctga aaaacgaaga actgtaccac 2640

cagtcttacg actgcgtttg cgttatgttc gcttctatcc cggacttcaa agaattctac 2700

accgaatctg acgttaacaa agaaggtctg gaatgcctgc gtctgctgaa cgaaatcatc 2760

gctgacttcg acgacctgct gtctaaaccg aaattctctg gtgttgaaaa aatcaaaacc 2820

atcggttcta cctacatggc tgctaccggt ctgtctgctg ttccgtctca ggaacactct 2880

caggaaccgg aacgtcagta catgcacatc ggtactatgg ttgaattcgc tttcgctctg 2940

gttggtaaac tggacgctat caacaaacac tctttcaacg acttcaaact gcgtgttggt 3000

atcaaccacg gtccggttat cgctggtgtt atcggtgctc agaaaccgca gtacgacatc 3060

tggggtaaca ccgttaacgt tgcttctcgt atggactcta ccggtgttct ggacaaaatc 3120

caggttaccg aagaaacctc tctggttctg cagaccctgg gttacacctg cacctgccgt 3180

ggtatcatca acgttaaagg taaaggtgac ctgaaaacct acttcgttaa caccgaaatg 3240

tctcgttctc tgtctcagtc taacgttgct tct 3273