一种人神经生长因子类似物及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种人神经生长因子类似物及其制备方法。

背景技术：

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是最早发现和最典型的神经营养因子，同时也是神经系统中最重要的生物活性分子之一。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。目前NGF已被开发成治疗外周神经损伤的药物应用于临床，并广泛应用于神经损伤、偏瘫、卒中、颅脑损伤、小儿脑瘫等神经性疾病领域。但目前，商品化的NGF为鼠源性神经生长因子(mNGF)，潜在免疫原性风险。天然的人神经生长因子(hNGF)分布于人体的脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织，原料来源有限，且其中hNGF含量低，分离纯化极其困难，无法直接提取获得。

hNGF基因位于1号染色体短臂上，完整的hNGF外显子编码241个氨基酸组成的hNGF前体，通常称为preproNGF，在内质网中preproNGF的信号肽(pre部分)被切割下来，生成hNGF原体，即proNGF(由223个氨基酸组成)，然后被转运至高尔基体内，再经蛋白酶酶切去除前导肽(pro部分)，生成hNGF成熟肽(由120个氨基酸组成)，被转运至细胞外，发挥生理功能。

在各大表达系统中，大肠杆菌表达系统因其表达水平高、生产成本低、便于工业化生产等优势成为制备重组人神经生长因子的首选。但目前存在的主要问题是：hNGF难于在大肠杆菌表达系统中实现重组人神经生长因子的稳定、可溶及高活性的表达。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人神经生长因子类似物，具有与天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，其避免了现有的鼠源性神经生长因子mNGF免疫原性风险问题。

本发明的另一个目的在于提供一种人神经生长因子类似物的制备方法，解决了重组人神经生长因子难于在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性表达的技术难题。

为实现本发明的目的，采用以下技术方案：

一种人神经生长因子类似物(GhNGF)，所述的人神经生长因子类似物含人神经生长因子正常氨基酸序列及其N末端增加一个甘氨酸残基。

如上所述的人神经生长因子类似物，优选地，所述人神经生长因子正常氨基酸序列为天然人神经生长因子氨基酸序列，或者具有与天然人神经生长因子氨基酸序列95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。

如上所述的人神经生长因子类似物，优选地，所述人神经生长因子类似物含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

如上所述的人神经生长因子类似物，优选地，用于编码所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第331～693位所示或其互补序列。

一种人神经生长因子类似物的制备方法，优选地，将改造的人神经生长因子原体(proNGF)cDNA插入原核表达载体，构建成重组表达载体，采用大肠杆菌表达系统表达制备；其中，所述改造的人神经生长因子原体(proNGF)cDNA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3中第8～231位所示序列，或者与其氨基酸序列同源性大于90％的序列。

如上所述的制备方法，优选地，所述原核表达载体为融合蛋白表达载体，为pMAL载体、pGEX载体或pET载体。

如上所述的制备方法，优选地，所述pMAL载体为pMAL-p5x、pMAL-p5E、pMAL-p5G，所述pET载体为pET39b或pET32a。

如上所述的制备方法，优选地，所述的融合蛋白表达载体经过了改造，其消除了载体自身的凝血酶酶切识别位点。

如上所述的制备方法，优选地，所述改造的人神经生长因子原体(proNGF)cDNA含如SEQ ID NO.2中第22～693位所示序列或其互补序列。

如上所述的制备方法，优选地，所述大肠杆菌表达系统表达制备的表达产物经纯化后，采用凝血酶酶切，再次纯化获得人神经生长因子类似物纯品。

本发明提供的人神经生长因子类似物，具有与天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，是利用基因工程重组蛋白技术制备的重组人神经生长因子(hNGF)。其取代了组织提取的鼠源性神经生长因子(mNGF)，有效避免了mNGF存在免疫原性风险的问题，也解决了天然的人神经生长因子不能直接获得的技术问题。

本发明提供一种人神经生长因子类似物的制备方法，在人神经生长因子正常氨基酸序列的N末端多增加1个甘氨酸残基(G)，使其在大肠杆菌中的稳定性和表达量得到明显提高，同时在选用融合蛋白表达体系时更有利于操作控制，从而实现重组人神经生长因子在大肠杆菌表达系统中的稳定、可溶及高活性的表达。

附图说明

图1为MBP-GhNGF融合表达的SDS-PAGE图。

图2为MBP-GhNGF融合表达Western Blot鉴定图。

图3为Trx-GhNGF融合表达的SDS-PAGE图。

图4为不同IPTG浓度于28℃诱导对MBP-GhNGF融合表达影响的SDS-PAGE图。

图5为不同IPTG浓度于25℃诱导对MBP-GhNGF融合表达影响的SDS-PAGE图。

具体实施方式

发明人通过对NGF分子结构的深入研究，提出了一种人神经生长因子类似物。该类似物是指在人神经生长因子正常氨基酸序列的N末端增加了一个甘氨酸残基(G)，记作GhNGF，其中，人神经生长因子正常氨基酸序列为天然人神经生长因子氨基酸序列，或者具有与天然人神经生长因子氨基酸序列95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。通过优化表达，使其在大肠杆菌中的稳定性和表达量得到明显提高，同时在选用融合蛋白表达体系时更有利于操作控制。

本发明在制备人神经生长因子类似物的过程中，对人神经生长因子原体(proNGF)进行改造，使其编码的proNGF第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造为甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一个甘氨酸(Gly¹⁰⁴)；改造后编码的氨基酸序列Gly¹⁰²-Arg¹⁰³-↓Gly¹⁰⁴(↓为酶切位点)可被凝血酶识别，并在Arg¹⁰³羧基端切开，产生N末端多一个甘氨酸的hNGF成熟肽，即本发明所制备的人神经生长因子类似物(GhNGF)。经免疫印迹(Western Blot)鉴定和生物活性检测证明，GhNGF具有与天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，而且，GhNGF能够实现在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性的表达。因GhNGF为具有新结构的生物分子，其在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性的表达，使其产业化生产成为可能，有利于新药开发和临床应用。

下面通过具体实施例来说明本发明，应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。

在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

实施例1：GhNGF基因的获得

本发明的人神经生长因子类似物，是在天然人神经生长因子氨基酸序列及其N末端增加了一个甘氨酸残基，具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：

GSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA。

为了实现重组人神经生长因子在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性的表达，发明人参照大肠杆菌偏爱密码子表，同时对proNGF前导肽编码序列进行改造，将proNGF第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造为甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一个甘氨酸(Gly¹⁰⁴)，另外还结合密码子简并性、GC含量、转录的mRNA结构、稳定性等因素，设计适用于重组蛋白表达的序列，具体如SEQ ID NO.2所示的proNGF cDNA序列，其中，5’端含有AvaⅠ限制性酶切位点(CTCGGG)，3’端含有HindⅢ限制性酶切位点(AAGCTT)和终止密码子TAA，其中SEQ ID NO.2中第331～693位所示或其互补序列编码的氨基酸序列对应为SEQ ID NO.1所示序列。

SEQ ID NO.2：(proNGF cDNA设计序列)

5’-CTCGGGGATGACGATGACAAAGAACCGCACTCCGAATCAAACGTTCCGGCTGGCCATACGATTCCGCAGGCGCACTGGACCAAACTGCAACATTCGCTGGATACCGCCCTGCGTCGCGCTCGTAGCGCACCGGCAGCAGCAATTGCTGCGCGCGTGGCCGGTCAGACGCGTAATATCACCGTTGATCCGCGCCTGTTTAAAAAACGTCGCCTGCGTTCCCCGCGCGTCCTGTTCTCAACGCAGCCGCCGCGTGAAGCAGCAGACACCCAAGATCTGGACTTTGAAGTGGGCGGTGCTGCGCCGTTCAACCGTACCCATCGCTCTGGCCGTGGTAGCTCTAGTCATCCGATTTTTCACCGTGGCGAATTCAGTGTTTGCGATAGCGTGAGCGTTTGGGTCGGTGATAAAACCACGGCCACGGACATTAAAGGCAAAGAAGTGATGGTTCTGGGTGAAGTTAACATCAACAACAGCGTCTTCAAACAGTATTTCTTTGAAACCAAATGCCGCGATCCGAACCCGGTTGACTCTGGCTGTCGTGGTATCGATTCTAAACACTGGAATAGTTACTGTACCACGACCCATACGTTTGTCAAAGCTCTGACCATGGATGGCAAACAAGCCGCATGGCGCTTCATTCGTATCGACACCGCATGCGTCTGTGTGCTGAGCCGCAAAGCCGTGCGTCGCGCATAAAAGCTT-3’。

通过化学合成的方式合成了该序列。上述proNGF cDNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中GRG为凝血酶酶切识别位点。

SEQ ID NO.3：

LGDDDDKEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSGRGSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA。

本发明所改造的proNGF cDNA，是根据氨基酸的密码子简并性和大肠杆菌密码子偏爱性，再综合考虑cDNA序列及其转录的mRNA序列结构、GC含量、稳定性等因素，优化、改造碱基序列，使其编码的proNGF在大肠杆菌中的稳定性和表达量得到提高，编码的proNGF氨基酸序列等同于天然人proNGF氨基酸序列的第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造为甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一个甘氨酸(Gly¹⁰⁴)后的序列。编码的proNGF氨基酸序列如SEQ ID NO.3中第8～231位所示序列，或者与该氨基酸序列同源性大于90％的序列。

上述设计的proNGF cDNA如SEQ ID NO.2所示的第22～693位序列结合不同的融合蛋白表达载体，均能实现本发明的目的蛋白——人神经生长因子类似物的表达。选用不同的融合蛋白表达载体需要设计不同PCR扩增引物，引入相应的酶切位点。其中用于pET39b和pET32a表达载体的PCR扩增引物序列如下：

SEQ ID NO.4：(正向引物，5’端引入KpnⅠ限制性酶切位点GGTACC)

5'-CGG GGTACC GATGACGATGACAAAGAACCGC-3'

SEQ ID NO.5：(反向引物，引入HindⅢ限制性酶切位点AAGCTT和终止密码子TAA。)

5'-CCC AAGCTTTTATGCGCGACGCACG-3'。

实施例2：GhNGF重组表达载体的构建及工程菌的获得

融合蛋白表达是在目的蛋白的N端或C端添加特殊蛋白序列，以提高目的蛋白的可溶性，促进其正确折叠，实现其快速亲和纯化，或者实现其细胞表达定位。该特殊蛋白序列被称作为融合蛋白标签(tag)，常用的融合蛋白标签有麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、二硫键形成蛋白(Dsb)、硫氧还蛋白(Trx)以及His-tag、S-tag等。采用该方式表达的载体就称作融合蛋白表达载体，比如pMAL载体采用MBP作为融合蛋白标签，pGEX载体采用GST作为融合蛋白标签。

本发明采用原核表达载体，可实现本发明的目的，优选为融合蛋白表达载体；具体可用pMAL载体、pGEX载体或pET载体；更为优选地，为pMAL-p5x、pMAL-p5E、pMAL-p5G或pET39b或pET32a；最为优选地，为pET39b或pET32a。列举如下来说明：

2.1以pMAL-p5x为融合蛋白表达载体，构建GhNGF重组表达载体及融合表达工程菌。

将人工合成的proNGF cDNA序列(SEQ ID NO.2)，用AvaⅠ和HindⅢ双酶切后通过T4DNA连接酶连接到同样经双酶切的pMAL-p5x表达载体上，构建pMAL-p5x-GhNGF重组表达载体，转化大肠杆菌克隆菌株Top10，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养筛选重组子，经PCR与酶切鉴定正确后，测序验证其序列正确性。

提取鉴定正确的重组子为pMAL-p5x-GhNGF重组表达载体，转化到大肠杆菌感受态表达菌株BL21(DE3)中，在含有50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上，37℃培养筛选重组子，获得的重组子即为MBP融合表达的GhNGF工程菌，命名为MBL-GhNGF。将其保存于15％甘油中，冻存于－80℃冰箱。其中，MBL-GhNGF工程菌表达产生的融合蛋白应含有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、hNGF原体的pro部分以及GhNGF序列，理论分子量约为70kDa。

取甘油管冻存的MBL-GhNGF工程菌，按0.2％接种于含有新鲜LB抗性培养基(含50μg/ml Amp)的试管中，振荡培养过夜，活化菌株；再转接至100mL的LB培养基中，37℃振荡培养约3h，测其OD600值在0.6～0.8时，加入0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于37℃诱导表达4h，离心收集菌体；称量菌体湿重，按菌体和破菌液(25mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH10.0)重量比为1∶15的比例加入破菌液，超声破菌后，将破菌上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。结果如图1所示，其中M为蛋白Marker；1为0.5mM IPTG、37℃诱导4h的破菌上清；2为0.5mM IPTG、37℃诱导4h的破菌沉淀。结果说明破菌上清中有分子量约70kDa的融合蛋白表达。

将上述表达的分子量约70kDa的融合蛋白分别用proNGF单抗(Abcam公司产品，货号：ab68151，下同。)和NGF单抗(Abcam公司产品，货号：ab52918，下同。)进行蛋白质免疫印迹(Western Blot)鉴定，结果如图2所示，其中图2A为采用proNGF单抗杂交鉴定；图2B为采用NGF单抗杂交鉴定；1为未经诱导的BL21(DE3)空载菌；2为未诱导MBL-GhNGF工程菌菌体全蛋白；3为0.2mM IPTG、28℃诱导4h的破菌沉淀；4为0.2mM IPTG、28℃诱导4h的破菌上清。结果表明破菌上清中的70kDa的融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

2.2以pET39b为融合蛋白表达载体，构建GhNGF重组表达载体及融合表达工程菌。

以2.1构建的重组载体pMAL-p5x-GhNGF为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列为引物，扩增proNGF cDNA序列，使其序列5’端带有KpnⅠ限制性酶切位点，3’端序列不变，仍含有HindⅢ限制性酶切位点和终止密码子TAA。

具体地，PCR反应体系为50μl，其中pMAL-p5x-GhNGF的模板1μl，运用实施例1中的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的正、反向引物(10μM)各1μl，dNTPs 3μl，5×Buffer 10μl，Taq DNA聚合酶1μl，ddH₂O33μl。扩增反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后一个循环后72℃延伸10min。用1.2％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，回收后的PCR扩增产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，通过T4DNA连接酶连接到同样经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的pET39b表达载体上，构建pET39b-GhNGF重组表达载体，转化大肠杆菌克隆菌株DH5α，在含有50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB培养基上37℃培养筛选重组子，经PCR与酶切鉴定正确后，测序验证其序列正确性。提取鉴定正确的重组载体pET39b-GhNGF的重组质粒，转化大肠杆菌感受态表达菌株BL21(DE3)，在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基上37℃培养筛选重组子，获得的重组子即为DsbA融合表达的GhNGF工程菌，命名为D39BL-GhNGF。其中，D39BL-GhNGF工程菌表达产生的融合蛋白应含有二硫键形成蛋白(DsbA)标签、hNGF原体的pro部分以及GhNGF序列，理论分子量约为53kDa。

取甘油管冻存的D39BL-GhNGF工程菌，按0.2％接种于含有新鲜LB抗性培养基(含50μg/ml Kan)的试管中，振荡培养过夜，活化菌株；再转接至100mL的LB培养基中，37℃振荡培养约3h，测其OD600值在0.6～0.8时，加入0.2mM IPTG，于25℃诱导表达4h，离心收集菌体；称量菌体湿重，按菌体和破菌液(20mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)重量比为1∶15的比例加入破菌液，超声破菌后，将破菌上清和沉淀进行SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定。结果说明破菌上清中有分子量约53kDa的融合蛋白表达；且该融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

2.3以pET32a为融合蛋白表达载体，构建GhNGF重组表达载体及融合表达工程菌。

为提高表达的融合蛋白DsbA-proNGF被凝血酶酶切的效率，可通过PCR定点突变的方法消除载体本身自带的凝血酶酶切识别位点(LVPRGS)的编码序列，如将该氨基酸序列从LVPRGS突变为LVPKGS。

2.3.1改造pET32a，消除其自带的凝血酶酶切识别位点(LVPRGS)的编码序列。

合成以下引物(SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7)，以定点突变凝血酶酶切识别位点(LVPRGS)的编码序列，将其中R(精氨酸)的编码序列突变为K(赖氨酸)的编码序列。

SEQ ID NO.6：(正义链引物，其中AAA为赖氨酸编码序列)

5’-AAAAGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGC-3’

SEQ ID NO.7：(反义链引物，其中TTT为赖氨酸编码序列)

5’-TCATACCAGAACCTTTTGGCACCAGACCAG-3’

以pET32a载体为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行扩增。PCR体系为30μl，其中pET32a载体的模板质粒1μl，上述引物(10μM)各0.8μl，dNTPs(10μM)0.6μl，5×Buffer 6μl，Phusion高保真DNA聚合酶0.3μl，补加ddH₂O至30μl。扩增反应条件为98℃1min；98℃5s，61℃30s，72℃3min，32个循环；72℃10min。用1.2％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，经DpnⅠ酶切消化模板质粒后，转化大肠杆菌克隆菌株Top10，挑选克隆菌落，测序验证其序列正确性。测序正确的克隆菌所含质粒即为改造的pET32a载体，记作pET32a-deT。

2.3.2构建pET32a-deT-GhNGF重组表达载体及工程菌

取2.2中采用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物扩增的产物，用KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，通过T4DNA连接酶连接到同样经KpnⅠ和HindⅢ双酶切的pET32a-deT表达载体上，构建pET32a-deT-GhNGF重组表达载体，转化大肠杆菌克隆菌株Top10，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养筛选重组子，重组子经PCR与酶切鉴定正确后，测序验证其序列正确性。

提取鉴定正确的重组载体pET32a-deT-GhNGF的重组质粒，转化大肠杆菌感受态表达菌株Origami B(DE3)，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养筛选重组子，获得的重组子即为TrxA融合表达的GhNGF工程菌，命名为T32deTOB-GhNGF。将其保存于15％甘油中，冻存于－80℃冰箱。其中，T32deTOB-GhNGF工程菌表达产生的融合蛋白应含有硫氧还蛋白(TrxA)标签、hNGF原体的pro部分以及GhNGF序列，理论分子量约为42kDa。

取活化后的T32deTOB-GhNGF工程菌，按体积比1∶100的比例接种至100ml LB培养基中，在OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导表达4h；对照不加IPTG，同样条件培养。离心收集菌体，加入15ml的PBS，超声破菌，条件为超声2s、间歇3s，80％功率；破菌后于4℃12000rpm离心15min，分出破菌上清和沉淀，沉淀用同等体积的PBS重悬。分别取20μl的菌液、破菌上清及沉淀重悬液，均加入5μl 5×上样Buffer，混匀，于100℃沸水浴变性5min，各取10μl，行SDS-PAGE检测。结果如图3所示，其中1为未诱导全菌蛋白；2为未诱导破菌沉淀；3为未诱导破菌上清；4为诱导表达的全菌蛋白；5为诱导表达的破菌沉淀；6为诱导表达的破菌上清。结果表明破菌上清中有分子量大小约42kDa的目标蛋白。

将上述表达的分子量约42kDa的融合蛋白分别用proNGF单抗和NGF单抗进行Western Blot鉴定，结果表明42kDa的融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

实施例3：GhNGF的表达及纯化

3.1MBP融合表达GhNGF及纯化

3.1.1MBP融合表达GhNGF的条件优化

将实施例2.1中活化的MBL-GhNGF工程菌，接种于LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时，分别于诱导温度28℃，IPTG浓度为0mM、0.05mM、0.2mM诱导4h；诱导温度25℃，IPTG浓度为0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM诱导4h，离心收集菌体，超声破菌后，将破菌上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。实验结果如图4、图5所示，其中，图4中1为蛋白Marker；2为未诱导全菌蛋白；3为0.05mM IPTG诱导表达的破菌上清；4为0.05mM IPTG诱导表达的破菌沉淀；5为0.2mM IPTG诱导表达的破菌上清；6为0.2mM IPTG诱导表达的破菌沉淀；图5中，1为蛋白Marker；2为未诱导全菌蛋白；3为0.05mM IPTG诱导表达的破菌上清；4为0.05mM IPTG诱导表达的破菌沉淀；5为0.1mM IPTG诱导表达的破菌上清；6为0.1mM IPTG诱导表达的破菌沉淀。7为0.2mM IPTG诱导表达的破菌上清；8为0.2mM IPTG诱导表达的破菌沉淀；9为0.5mM IPTG诱导表达的破菌上清；10为0.5mM IPTG诱导表达的破菌沉淀。

结果表明，在诱导温度为25℃，IPTG浓度0.2mM诱导4h时，可溶性蛋白表达量相对较多。

3.1.2MBP融合表达GhNGF的纯化

重组GhNGF蛋白的表达是采用实施例2.1构建的MBL-GhNGF工程菌来完成。发酵后发酵液离心收集菌体，压力匀浆破菌，收集上清上Dextrin Sepharose HP层析柱，用含麦芽糖的缓冲液(200mM麦芽糖-20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0)洗下融合蛋白，加入凝血酶25℃酶切2小时，然后通过Dextrin Sepharose HP层析柱除去杂蛋白(未酶切的全长融合蛋白和融合蛋白标签-hNGF前导肽(MBP-pro peptide))，切下的GhNGF经SP Sepharose FF层析获得纯度大于95％的GhNGF。

3.2DsbA融合表达GhNGF及纯化

重组GhNGF蛋白的表达是采用实施例2.2构建的D39BL-GhNGF工程菌来完成。发酵后发酵液离心收集菌体，压力匀浆破菌，收集上清上Ni-Sepharose 6FF层析柱，用50mM-200mM咪唑(Imidazole)梯度洗脱收集融合蛋白，经凝血酶25℃酶切2小时，然后通过Ni-Sepharose 6FF层析柱除去杂蛋白(未酶切的全长融合蛋白和融合蛋白标签-hNGF前导肽(Dsb-pro peptide))，切下的GhNGF经SP Sepharose FF层析获得纯度大于95％的GhNGF。

3.3TrxA融合表达GhNGF及纯化

重组GhNGF蛋白的表达是采用实施例2.3构建的T32deTOB-GhNGF工程菌来完成。发酵后发酵液离心收集菌体，压力匀浆破菌，收集上清，同3.2方法纯化，获得纯度大于95％的GhNGF。

上述三种方法获得纯化后的GhNGF分别用proNGF单抗和NGF单抗进行Western Blot再次鉴定，上述纯化后的GhNGF均具有proNGF和NGF免疫活性。

实施例4：GhNGF的鉴定

4.1N末端氨基酸序列检测

实施例3中三种表达体系表达制备的GhNGF，N末端15个氨基酸的测序结果均为：GSSSHPIFHRGEFSV，与设计值一致。

4.2生物活性检测

以中国药品生物制品检定研究院分发的鼠神经生长因子参考品为参照，采用《中国药典》2015年版三部通则3530“TF-1细胞/MTS比色法”进行检测，实施例3中三种表达体系表达制备的GhNGF的比活性分别为6.37×10⁵U/mg、5.71×10⁵U/mg和7.12×10⁵U/mg。

以上实施例表明，GhNGF能够实现在大肠杆菌表达系统中稳定、可溶及高活性的表达，从而有利于其产业化生产制备，以及新药开发和临床应用。

应当指出，以上所述仅为本发明的优选实施例，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海特生物制药股份有限公司

<120> 一种人神经生长因子类似物及其制备方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile

20 25 30

Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser

35 40 45

Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro

50 55 60

Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr

65 70 75 80

Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys

85 90 95

Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val

100 105 110

Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala

115 120

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcggggatg acgatgacaa agaaccgcac tccgaatcaa acgttccggc tggccatacg 60

attccgcagg cgcactggac caaactgcaa cattcgctgg ataccgccct gcgtcgcgct 120

cgtagcgcac cggcagcagc aattgctgcg cgcgtggccg gtcagacgcg taatatcacc 180

gttgatccgc gcctgtttaa aaaacgtcgc ctgcgttccc cgcgcgtcct gttctcaacg 240

cagccgccgc gtgaagcagc agacacccaa gatctggact ttgaagtggg cggtgctgcg 300

ccgttcaacc gtacccatcg ctctggccgt ggtagctcta gtcatccgat ttttcaccgt 360

ggcgaattca gtgtttgcga tagcgtgagc gtttgggtcg gtgataaaac cacggccacg 420

gacattaaag gcaaagaagt gatggttctg ggtgaagtta acatcaacaa cagcgtcttc 480

aaacagtatt tctttgaaac caaatgccgc gatccgaacc cggttgactc tggctgtcgt 540

ggtatcgatt ctaaacactg gaatagttac tgtaccacga cccatacgtt tgtcaaagct 600

ctgaccatgg atggcaaaca agccgcatgg cgcttcattc gtatcgacac cgcatgcgtc 660

tgtgtgctga gccgcaaagc cgtgcgtcgc gcataaaagc tt 702

<210> 3

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Gly Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro

1 5 10 15

Ala Gly His Thr Ile Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser

20 25 30

Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile

35 40 45

Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg

50 55 60

Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr

65 70 75 80

Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val

85 90 95

Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Gly Arg Gly Ser

100 105 110

Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser

115 120 125

Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly

130 135 140

Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe

145 150 155 160

Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp

165 170 175

Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr

180 185 190

Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala

195 200 205

Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser

210 215 220

Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala

225 230

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggggtaccg atgacgatga caaagaaccg c 31

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccaagcttt tatgcgcgac gcacg 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaggttct ggtatgaaag aaaccgctgc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcataccaga accttttggc accagaccag 30