本发明属于分子生物学基因检测技术领域,具体涉及FOXC1基因H446HG突变体及其在儿童急性淋巴细胞白血病筛查试剂盒中的应用。
背景技术:
:
急性白血病是危害儿童健康的重大疾病之一,为造血干细胞在分化过程中于某一阶段出现阻滞的一种恶性增殖疾病,其中急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)更是儿童最常见的恶性血液病,约占白血病的75%。随着儿童ALL诊断与治疗方案的不断完善,多种药物联合治疗、支持治疗及造血干细胞移植的应用,其5年无病生存率已超过80-90%,成为一种可以治愈的恶性肿瘤。但是,仍然有相当部分的ALL病人因治疗无效或复发而死亡。
化学因素、放射因素、遗传因素及免疫因素等在白血病的发病中发挥着重要作用,其中免疫系统在肿瘤的发生发展过程中扮演了非常复杂的角色,ALL患儿免疫功能紊乱是其发生难治复发和死亡率较高的一个重要原因之一。研究者已经发现,T细胞免疫及其调节网络异常是ALL发病和转归过程中的一个重要参与因素。炎症以及肿瘤使得环境中的抑制型调节性T细胞数量(RegμLatory T cells,Treg)大大增加,Treg会分泌大量抑制型细胞因子(TGF,IL10等)来抑制免疫反应。研究显示,Treg细胞亚群在多种血液系统恶性疾病包括ALL患儿中的比例较正常人显著升高,同时,Treg在ALL患儿中的异常分布也被鉴定与患者预后较差密切相关。在白血病的发生发展过程中,Treg可以通过分泌CD25抑制IL-2依赖的其他效应T细胞(Effector T cell,Teff)的抗肿瘤效应。而在针对白血病的免疫治疗中,由特异性白血病细胞负载的DC-CIK治疗后,ALL患者外周中Treg分布明显下降。虽然针对Treg在儿童ALL发生发展中的免疫抑制效应及促瘤作用已逐渐被研究者所阐明,但在儿童ALL的发生过程中促进Treg分化增加的具体调控机制仍不明确。
遗传因素及环境因素在儿童ALL的发生中具有重要的联系,本课题组也已筛选出一系列在环境诱导的儿童ALL发生中具有潜在患病风险的特异性突变位点以及单核苷酸多态性位点,揭示遗传因素在儿童ALL发病中的重要作用。而在针对儿童ALL发病过程中Treg分化增加的机制研究中,已有研究者发现在T细胞分化过程中,基因组特异性基因产生的突变会导致T细胞异常分化。但目前为止,从遗传学角度探索儿童ALL发病过程中Treg分布异常增加的调控机制尚未见报道。因此,深入研究儿童ALL的发病机制,可以为发现新的生物学标志及新的靶向治疗位点提供坚实的理论基础,也可以为儿童ALL提供新的诊断和治疗依据。
技术实现要素:
:
解决的技术问题:本发明的目的在于针对T细胞中是否存在相关突变与儿童ALL发生相关的问题,提供一种FOXC1基因H446HG突变体及其应用,通过全外显子测序技术对比分析ALL患儿T细胞突变和正常对照T细胞突变,筛选出ALL特异性的T细胞突变,为临床上儿童ALL患者的早期诊断提供新的方法。
技术方案:FOXC1基因H446HG突变体,所述突变位于第446个氨基酸组氨酸之后插入一个甘氨酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
FOXC1基因H446HG突变体,所述突变位于1337位之后插入了核苷酸CGG(c.1337A>ACGG),其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述突变体在制备儿童急性淋巴细胞白血病筛查试剂盒中的应用。
检测上述FOXC1基因H446HG突变的引物对,如SEQ ID NO.1所示的上游引物:5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’,SEQ ID NO.2所示的下游引物:5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。
检测上述FOXC1基因H446HG突变的探针,核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
儿童急性淋巴细胞白血病筛查试剂盒,含有上述探针。
优选的,上述试剂盒还含有上述引物对。
优选的,上述试剂盒还含有PCR技术所需的试剂。
本发明所述的FOXC1基因H446HG突变通过下述步骤获得:
1)采集标本:收集新发急性淋巴细胞白血病患儿和特发性血小板减少性紫癜患儿的骨髓1-2mL,原代分离培养T淋巴细胞;
2)提取T淋巴细胞基因组DNA,通过全基因组外显子测序,对比分析急性淋巴细胞白血病患儿和特发性血小板减少性紫癜患儿的T细胞测序结果,筛选出儿童急性淋巴细胞白血病特异性的T细胞突变;
3)扩大样本量采用Sanger测序法对候选T细胞突变进行验证,在更大样本中验证筛选ALL特异性的T细胞突变。
FOXC1基因H446HG突变检测方法
1)提取原代分离T淋巴细胞基因组DNA;
2)PCR扩增;
3)回收并纯化所扩增的PCR片段;
4)采用Sanger法测定所纯化的PCR扩增片段序列,得到样本测序序列;
5)用FOXC1基因标准序列与样本测序序列比对,分析FOXC1检测位点突变型类别。
有益效果:本发明首次从遗传学角度筛选与儿童急性淋巴细胞白血病发生相关的T细胞突变,从分子水平为儿童急性淋巴细胞白血病早期筛查提供了新的方向,提供FOXC1基因H446HG突变在制备儿童急性淋巴细胞白血病筛查试剂盒中的应用,具有重大的实用价值和应用前景。
附图说明
图1为Sanger法检测FOXC1野生型及突变型中具体碱基变化示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。本实施力在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
实施例1:研究对象的选择和骨髓样本收集
所有病例骨髓样本来自南京医科大学附属儿童医院血液肿瘤科经MICM分型明确诊断的新发白血病患者,胸骨穿刺采集1-2mL新鲜骨髓。
所有对照骨髓标本来自新发特发性血小板减少性紫癜(ATP)患者。
样本的收集和DNA提取:
1).采集新发儿童ALL患者骨髓和新发ITP患者的骨髓(对照)1-2mL,在生物安全柜内通过Ficoll法原代分离浸润性淋巴细胞。
2).取两支15mL离心管,首先分别在每只管中加入Ficoll-paque PLUS试剂5mL,然后用滴管把5mL血液沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。
3).Eppendorf centrifuge 5810R离心机,22℃,500g,离心30min,加速度1,减速度0。
4).离心后管内分为四层,上层为血浆,最下层主要为红细胞和粒细胞。第二层为淋巴细胞分离液,在二、三层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
5).用1mL移液枪先把上层血清吸掉,然后吸取中间的白色云雾状狭窄带所包含的细胞,至另一只15mL的离心管中。
6).加入5倍以上体积的TexMACS GMP Medium培养液(一般加至10mL左右),1500rpm×10分钟,加减速度各为5,洗涤细胞两次。
7).倒掉上清液,加入10mL TexMACS GMP Medium和20μL人源性IL-2于10cm培养皿进行体外扩增。
8).72h后收集细胞提取DNA,DNA的提取参照QIAGEN DNA提取试剂盒的操作步骤进行。
Agilent全外显子捕获测序和数据分析
从现有的标本中选取3例白血病患者和2例对照DNA进行外显子测序,DNA要求满足要求如下:DNA总量≥2μg,OD260/280>1.8,经琼脂糖电泳检测,基因组DNA电泳条带清晰,无明显弥散,无RNA污染。
本发明采用Illumina HiSeq 2500作为测序平台:1)对基因组DNA进行片段化处理;2)对片段化的双链DNA进行末端修复;3)将“A”碱基加到DNA片段的3’末端;4)连接特定的测序接头DNA片段的两端;5)纯化连接产物以去除未连接的接头序列;6)PCR扩增有接头的片段DNA并纯化;7)样本文库检测;8)样本文库、SureSelect capture library在杂交缓冲液中进行杂交;9)Dynal磁珠捕获杂交的目的DNA片段并分离纯化,除去未结合的DNA片段并消化RNA;10)PCR扩增捕获的DNA片段并纯化PCR产物;11)上机测序。
测序后数据使用Fastqc软件对下机原始数据进行质控。使用ngsQCToolkit软件过滤掉低质量reads和有引物污染的reads。使用bwa软件将各样品的clean reads回贴到参考基因上,并使用Picard软件对回贴结果进行质控。使用GATK软件分别检测各样本的SNP和Small Indel,得到SNP的碱基突变情况及对应染色体的物理位置定位信息,发生small Indel区段的大小及在对应染色体上的位置。最后将检测到的SNP和Small InDel与1000Genomes,dbSNP,COSMIC,5000Exomes数据库进行交叉比对获得最终SNP及InDel。
该步骤在北京博奥晶典生物技术有限公司完成。
突变位点的筛选
基于上述测序筛选结果,对比分析3例ALL患儿和2例对照组中的SNP及InDel分布,筛选出ALL特异性的突变,同时,通过VENNY法将3组交叉比对后数据进行合并分析,最终获得10个InDel满足在3例ALL患儿中共同存在。将筛选获得的10个InDel作为候选研究对象。
表1.候选突变信息
扩大样本对测序结果进行验证
(1)DNA提取
采集25例新发儿童ALL患者骨髓和10例新发ITP患者的骨髓(对照),Ficoll法原代分离浸润性淋巴细胞并培养72h后,采用CD4特异性磁珠筛选获得T细胞并提取其基因组DNA,DNA的提取参照QIAGEN DNA提取试剂盒的操作步骤进行。
(2)PCR扩增
DNA样本取1μL 1%agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计,然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL,对于没有明显DNA条带的样本则不稀释。
PCR反应体系为1x GC buffer I(TAKARA),2.5mM Mg2+,0.2mM dNTP,0.2μM的上游引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)0.4μL,0.2μM的下游引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’)0.4μL,HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc.)1U,DNA模板1μL。
扩增程序:95℃15分钟;96℃、10秒,68℃、60秒,扩增35个循环。
(3)回收纯化PCR片段
在8μL的PCR产物中加1U SAP和6U Exo I,37℃孵育60min后,再70℃孵育10min。
(4)Sanger法测序
反应体系包括3μL BigDye3.1mix,2μL sequencing primer(0.4uM)and 1-2μL
纯化了的PCR产物。测序引物:5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。程序:96℃1分钟;96℃、10秒,50℃、5秒,60℃,4分钟,28个循环。
(5)测序文件用Polyphred软件分析。
在25例ALL患者中,有11例患者在FOXC1基因外显子I区存在与筛选结果一致的InDel,而在对照组中均未发现有相关突变存在。此外,其他候选基因中,其突变分布比例在对照组与ALL组中无明显差别。
试剂盒的制备
制备儿童ALL的分子诊断试剂盒,其中含有下列可扩增出核酸序列的第446位氨基酸突变的引物:正向引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)、反向引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’),用于检测所述特异位点的测序用的探针,其序列5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。还可以有相关PCR技术常用的试剂,如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂,这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(2mL)骨髓,即可检测T细胞FOXC1基因H446HG突变是否存在,可用于儿童急性淋巴细胞白血病的筛查和早期诊断。
具体试剂盒组成如下:
PCR引物:正向引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)、反向引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’)。
测序探针:5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。
试剂盒中还可以含1x GC buffer I(TAKARA),2.5mM Mg2+,0.2mM dNTP,HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc.)1U,1U SAP和6U Exo I。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于PCR扩增的相应试剂。
在该试剂盒的基础上对回收纯化的PCR产物进行Sanger测序,用Polyphred软件对测序结果与正常序列进行对比分析。
应理解,在阅读了本发明的上述内容后,本领域技术人员可以对本发明进行各种修改和润色,然而均是以检测本发明所述的SNP位点相关,或者是该位点的各种形式的应用,这些修改或润色均属于本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京医科大学附属儿童医院
<120> FOXC1基因H446HG突变体及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacctgcaag ccatgagcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accgagtgga agttctgctg 20
<210> 3
<211> 554
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gln Ala Arg Tyr Ser Val Ser Ser Pro Asn Ser Leu Gly Val Val
1 5 10 15
Pro Tyr Leu Gly Gly Glu Gln Ser Tyr Tyr Arg Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Gly Tyr Thr Ala Met Pro Ala Pro Met Ser Val Tyr Ser
35 40 45
His Pro Ala His Ala Glu Gln Tyr Pro Gly Gly Met Ala Arg Ala Tyr
50 55 60
Gly Pro Tyr Thr Pro Gln Pro Gln Pro Lys Asp Met Val Lys Pro Pro
65 70 75 80
Tyr Ser Tyr Ile Ala Leu Ile Thr Met Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asp
85 90 95
Lys Lys Ile Thr Leu Asn Gly Ile Tyr Gln Phe Ile Met Asp Arg Phe
100 105 110
Pro Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Gln Gly Trp Gln Asn Ser Ile Arg His
115 120 125
Asn Leu Ser Leu Asn Glu Cys Phe Val Lys Val Pro Arg Asp Asp Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Lys Gly Ser Tyr Trp Thr Leu Asp Pro Asp Ser Tyr Asn
145 150 155 160
Met Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Arg Arg Phe Lys Lys
165 170 175
Lys Asp Ala Val Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Arg Leu His Leu Lys
180 185 190
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Arg Gln Pro Pro Pro Ala Pro Pro Glu Gln
195 200 205
Ala Asp Gly Asn Ala Pro Gly Pro Gln Pro Pro Pro Val Arg Ile Gln
210 215 220
Asp Ile Lys Thr Glu Asn Gly Thr Cys Pro Ser Pro Pro Gln Pro Leu
225 230 235 240
Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Ser Gly Ser Ala Ala Ala Val Pro Lys
245 250 255
Ile Glu Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Gly Ser Ser
260 265 270
Pro Pro Gly Ser Leu Pro Ser Ala Arg Pro Leu Ser Leu Asp Gly Ala
275 280 285
Asp Ser Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ser Ala Pro Pro Pro His His
290 295 300
Ser Gln Gly Phe Ser Val Asp Asn Ile Met Thr Ser Leu Arg Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Ser Ala Ala Ala Glu Leu Ser Ser Gly Leu Leu Ala Ser Ala
325 330 335
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ala Pro Pro Leu Ala Leu Gly Ala
340 345 350
Tyr Ser Pro Gly Gln Ser Ser Leu Tyr Ser Ser Pro Cys Ser Gln Thr
355 360 365
Ser Ser Ala Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala
370 375 380
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr Tyr His Cys Asn Leu Gln Ala Met
385 390 395 400
Ser Leu Tyr Ala Ala Gly Glu Arg Gly Gly His Leu Gln Gly Ala Pro
405 410 415
Gly Gly Ala Gly Gly Ser Ala Val Asp Asp Pro Leu Pro Asp Tyr Ser
420 425 430
Leu Pro Pro Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser His Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln Glu Ala Gly His His Pro
450 455 460
Ala Ala His Gln Gly Arg Leu Thr Ser Trp Tyr Leu Asn Gln Ala Gly
465 470 475 480
Gly Asp Leu Gly His Leu Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Gly Tyr Pro Gly Gln Gln Gln Asn Phe His Ser Val Arg Glu Met Phe
500 505 510
Glu Ser Gln Arg Ile Gly Leu Asn Asn Ser Pro Val Asn Gly Asn Ser
515 520 525
Ser Cys Gln Met Ala Phe Pro Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Arg Thr Ser
530 535 540
Gly Ala Phe Val Tyr Asp Cys Ser Lys Phe
545 550
<210> 4
<211> 3455
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgcaggcgc gctactccgt gtccagcccc aactccctgg gagtggtgcc ctacctcggc 60
ggcgagcaga gctactaccg cgcggcggcc gcggcggccg ggggcggcta caccgccatg 120
ccggccccca tgagcgtgta ctcgcaccct gcgcacgccg agcagtaccc gggcggcatg 180
gcccgcgcct acgggcccta cacgccgcag ccgcagccca aggacatggt gaagccgccc 240
tatagctaca tcgcgctcat caccatggcc atccagaacg ccccggacaa gaagatcacc 300
ctgaacggca tctaccagtt catcatggac cgcttcccct tctaccggga caacaagcag 360
ggctggcaga acagcatccg ccacaacctc tcgctcaacg agtgcttcgt caaggtgccg 420
cgcgacgaca agaagccggg caagggcagc tactggacgc tggacccgga ctcctacaac 480
atgttcgaga acggcagctt cctgcggcgg cggcggcgct tcaagaagaa ggacgcggtg 540
aaggacaagg aggagaagga caggctgcac ctcaaggagc cgcccccgcc cggccgccag 600
cccccgcccg cgccgccgga gcaggccgac ggcaacgcgc ccggtccgca gccgccgccc 660
gtgcgcatcc aggacatcaa gaccgagaac ggtacgtgcc cctcgccgcc ccagcccctg 720
tccccggccg ccgccctggg cagcggcagc gccgccgcgg tgcccaagat cgagagcccc 780
gacagcagca gcagcagcct gtccagcggg agcagccccc cgggcagcct gccgtcggcg 840
cggccgctca gcctggacgg tgcggattcc gcgccgccgc cgcccgcgcc ctccgccccg 900
ccgccgcacc atagccaggg cttcagcgtg gacaacatca tgacgtcgct gcgggggtcg 960
ccgcagagcg cggccgcgga gctcagctcc ggccttctgg cctcggcggc cgcgtcctcg 1020
cgcgcgggga tcgcaccccc gctggcgctc ggcgcctact cgcccggcca gagctccctc 1080
tacagctccc cctgcagcca gacctccagc gcgggcagct cgggcggcgg cggcggcggc 1140
gcgggggccg cggggggcgc gggcggcgcc gggacctacc actgcaacct gcaagccatg 1200
agcctgtacg cggccggcga gcgcgggggc cacttgcagg gcgcgcccgg gggcgcgggc 1260
ggctcggccg tggacgaccc cctgcccgac tactctctgc ctccggtcac cagcagcagc 1320
tcgtcgtccc tgagtcacgg cggcggcggc ggcggcggcg gcgggggagg ccaggaggcc 1380
ggccaccacc ctgcggccca ccaaggccgc ctcacctcgt ggtacctgaa ccaggcgggc 1440
ggagacctgg gccacttggc gagcgcggcg gcggcggcgg cggccgcagg ctacccgggc 1500
cagcagcaga acttccactc ggtgcgggag atgttcgagt cacagaggat cggcttgaac 1560
aactctccag tgaacgggaa tagtagctgt caaatggcct tcccttccag ccagtctctg 1620
taccgcacgt ccggagcttt cgtctacgac tgtagcaagt tttgacacac cctcaaagcc 1680
gaactaaatc gaaccccaaa gcaggaaaag ctaaaggaac ccatcaaggc aaaatcgaaa 1740
ctaaaaaaaa aaaatccaat taaaaaaaac ccctgagaat attcaccaca ccagcgaaca 1800
gaatatccct ccaaaaattc agctcaccag caccagcacg aagaaaactc tattttctta 1860
accgattaat tcagagccac ctccactttg ccttgtctaa ataaacaaac ccgtaaactg 1920
ttttatacag agacagcaaa atcttggttt attaaaggac agtgttactc cagataacac 1980
gtaagtttct tcttgctttt cagagacctg ctttcccctc ctcccgtctc ccctctcttg 2040
ccttcttcct tgcctctcac ctgtaagata ttattttatc ctatgttgaa gggaggggga 2100
aagtccccgt ttatgaaagt cgctttcttt ttattcatgg acttgtttta aaatgtaaat 2160
tgcaacatag taatttattt ttaatttgta gttggatgtc gtggaccaaa cgccagaaag 2220
tgttcccaaa acctgacgtt aaattgcctg aaactttaaa ttgtgctttt tttctcatta 2280
taaaaaggga aactgtatta atcttattct atcctctttt ctttcttttt gttgaacata 2340
ttcattgttt gtttattaat aaattaccat tcagtttgaa tgagacctat atgtctggat 2400
actttaatag agctttaatt attacgaaaa aagatttcag agataaaaca ctagaagtta 2460
cctattctcc acctaaatct ctgaaaaatg gagaaaccct ctgactagtc catgtcaaat 2520
tttactaaaa gtctttttgt ttagatttat tttcctgcag catcttctgc aaaatgtact 2580
atatagtcag cttgctttga ggctagtaaa aagatatttt tctaaacaga ttggagttgg 2640
catataaaca aatacgtttt ctcactaatg acagtccatg attcggaaat tttaagccca 2700
tgaatcagcc gcggtcttac cacggtgatg cctgtgtgcc gagagatggg actgtgcggc 2760
cagatatgca cagataaata tttggcttgt gtattccata taaaattgca gtgcatatta 2820
tacatccctg tgagccagat gctgaataga tattttccta ttatttcagt cctttataaa 2880
aggaaaaata aaccagtttt taaatgtatg tatataattc tcccccattt acaatccttc 2940
atgtattaca tagaaggatt gcttttttaa aaatatactg cgggttggaa agggatattt 3000
aatctttgag aaactatttt agaaaatatg tttgtagaac aattattttt gaaaaagatt 3060
taaagcaata acaagaagga aggcgagagg agcagaacat tttggtctag ggtggtttct 3120
ttttaaacca ttttttcttg ttaatttaca gttaaaccta ggggacaatc cggattggcc 3180
ctcccccttt tgtaaataac ccaggaaatg taataaattc attatcttag ggtgatctgc 3240
cctgccaatc agactttggg gagatggcga tttgattaca gacgttcggg ggggtggggg 3300
gcttgcagtt tgttttggag ataatacagt ttcctgctat ctgccgctcc tatctagagg 3360
caacacttaa gcagtaattg ctgttgcttg ttgtcaaaat ttgatcattg ttaaaggatt 3420
gctgcaaata aatacacttt aatttcagtc aaaaa 3455