本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种以片段法固液结合制备替度鲁肽的方法。
背景技术：
替度鲁肽，英文名称为Teduglutide，由33个天然氨基酸组成，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复，是一种天然生成的激素，在临床上用于治疗成人短肠综合征，其肽序为：H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。
目前，替度鲁肽的制备方法有以下报道；专利CN104072603A先合成替度鲁肽2-33位氨基酸片段，而后采用特殊保护基保护的His进行1位偶联，该方法减少了1位His的消旋杂质生成，但与逐个氨基酸偶联的方法无异，固相合成步数多，溶剂用量大，三废严重；专利CN104418949A公开的替度鲁肽合成方法是将肽序分为两段，先合成1-3位和4-33位氨基酸片段，而后再偶联而成，该方法降低了合成过程中3-Asu杂质的生成，但并未解决长肽链合成后期偶联困难，粗肽纯度不高，工艺杂质繁多的问题；专利CN104072605A采取了片段法进行替度鲁肽合成，先将肽链分为三个片段，再将三个片段偶联得替度鲁肽，粗肽纯度有较大的改善，但片段法成本太大，且片段纯化费时费力，工业规模生产时成本不可控，且该专利在进行片段法合成时，并未针对性的控制特殊杂质，例如1-His消旋，3-Asu杂质。
替度鲁肽是由33个氨基酸组成的多肽，从固相合成的角度而言，肽链较长，随着肽链的延伸偶联反应会较为困难，容易产生较多工艺杂质而不利于后期纯化。目前存在的替度鲁肽固相合成方法主要分为两类，其一为针对性控制重点杂质，但忽视了长肽链偶联困难，粗肽纯度不高，工艺杂质繁多，溶剂用量巨大的问题；其二为着重解决长链偶联困难而采用片段法合成，但并未对重点杂质进行针对性控制，导致后期纯化困难，总体收率不高。
技术实现要素：
为解决替度鲁肽合成中存在的以上缺陷，本发明提供了一种片段法固液结合制备替度鲁肽的新方法。具体技术方案如下：
一种片段法固液结合制备替度鲁肽的方法，包括如下步骤：
(a)液相条件下合成所需短肽片段：Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH；
(b)以Wang Resin或CTC树脂为固相载体，在偶联剂存在下，依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，
得侧链保护的替度鲁肽肽树脂，其结构如下：
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(OtBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
(c)替度鲁肽肽树脂经过裂解，纯化，冻干得到替度鲁肽精肽。
其中步骤(a)中，
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备方法为：首先将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-His(Trt)-OSu，然后将生成的Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-His(Trt)-Gly-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu，然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH；
Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu，然后将生成的Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH；
Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu，然后将生成的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Met-OH在碱A条件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH；
Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu，然后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu，最后将生成的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH；
Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-OSu，然后将生成的Fmoc-Asn(Trt)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu，将生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu，将生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu和H-Ala-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu，然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu，然后将生成的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH；
Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu，然后将生成的Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu,最后将生成的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH；
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制备方法为：首先将Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu，然后将生成的Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Ile-OH在碱A条件下生成Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH。
优选的，步骤(a)中二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的具体制备方法为：
步骤1)首先制备Fmoc-His(Trt)-OSu：将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-His(Trt)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-His(Trt)-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去80％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-His(Trt)-OSu。
步骤2)制备二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH：将H-Gly-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶，完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤1)中制备Fmoc-His(Trt)-OSu的有机溶剂B溶液滴加到H-Gly-OH的溶液中，其中H-Gly-OH的摩尔量为Fmoc-His(Trt)-OSu的1.2～1.5倍；TLC监测反应终点，待反应结束后减压蒸馏除去有机溶剂B，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种；有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
优选的，步骤(a)中三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制备方法为：
步骤1)首先制备Fmoc-Thr(tBu)-OSu：将Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去80％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-OSu；
步骤2)然后制备Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH：将H-Ile-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶，完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤1)中制备的Fmoc-Thr(tBu)-OSu有机溶剂B溶液滴加入至H-Ile-OH溶液中，其中，H-Ile-OH的摩尔量为Fmoc-Thr(tBu)-OSu摩尔量的1.2～1.5倍，TLC监测反应终点，待反应结束，减压蒸发去掉有机溶剂B后，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH；
步骤3)Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制备方法为：将步骤2)中的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu；
步骤4)三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制备方法为：
将H-Leu-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶；完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤3)中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的有机溶剂B溶液滴加入H-Leu-OH溶液中，其中，H-Leu-OH的摩尔量为Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu摩尔量的1.2～1.5；TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸馏除去有机溶剂B后，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种。有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
优选的，步骤(a)中四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH制备方法为，
步骤1)制备Fmoc-Asn(Trt)-OSu：将Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去80％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-OSu；
步骤2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH：将H-Leu-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶。完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤1)中的Fmoc-Asn(Trt)-OSu的有机溶剂B溶液滴加入至H-Leu-OH溶液中，其中，H-Leu-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-OSu摩尔量的1.2～1.5倍；TLC监测反应终点，待反应结束，减压蒸发去掉有机溶剂B后，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH；
步骤3)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu：将步骤2)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h；反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去80％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu；
步骤4)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH：将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶。完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤3)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的有机溶剂B溶液滴加入至H-Ala-OH溶液中，其中，H-Ala-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu摩尔量的1.2～1.5倍；TLC监测反应终点，待反应结束，减压蒸发去掉有机溶剂B后，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH；
步骤5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu：将步骤4)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物质量比例溶于有机溶剂B中，冰水浴下将1.0-1.2倍物质量的DCC/有机溶剂B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的量计)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH/HOSu溶液中，1h内滴加完毕，撤冰浴，25℃继续搅拌反应2h。反应完成后抽滤，滤液浓缩，减压蒸去60％的有机溶剂，剩余油状物加入石油醚，直至上层溶液不再变白为止，析出白色固体，抽滤，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu；
步骤6)四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备：将H-Ala-OH和碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶；完全溶解后，冰浴搅拌下将步骤5)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的有机溶剂B溶液滴加入H-Ala-OH溶液中，其中，H-Ala-OH的摩尔量为Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu摩尔量的1.2～1.5倍。TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸馏除去有机溶剂B后，再以10％的柠檬酸/水将反应液pH值调至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH。
其中以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾中的一种。有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、丙酮、乙腈中的一种或几种。
其中步骤(b)中，以Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH投料偶联30～31位，以Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH投料偶联25～27，以Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH投料偶联21～23位，以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH投料偶联16～19位，以Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH投料偶联12～14位，以Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH投料偶联9～10位，以Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH投料偶联5～6位，以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH投料偶联3～4位，以Fmoc-His(Trt)-Gly-OH投料偶联1～2位。
步骤(b)中，Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的摩尔投料比为树脂的3～5倍，其余单个氨基酸的摩尔投料比为树脂的2～3倍。
步骤(b)中的Wang Resin或CTC Resin初始替代度为0.3～0.5mmol/g，改造后树脂替代度为0.25～0.45mmol/g，改造后树脂优选替代度为0.30～0.35mmol/g；步骤(b)中偶联剂为HOBt/DIC，HOAt/DIC，HOBt/HBTU/DIEA，HOAt/HATU/DIEA，PyBOP/DIEA，TBTU/DIEA中的一种或几种；步骤(c)中的裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本申请将替度鲁肽中所有不带功能侧链的氨基酸Ile，Leu，Ala，Phe，Met，Gly做成二肽，三肽，及四肽片段，将固相合成步数由33步降低为19步，使31位，27位，26位，23位，22位，19位，18位，17位，14位，13位，10位，6位，4位，2位这些位点的固相偶联效率达到了百分之百，提高了目标肽纯度，粗肽纯度达到70％以上，同时避免了这些位点缺失肽的形成，降低了工艺杂质的个数，提升了后期纯化的效率，最终收率达到45.08％。
2、1位2位以Fmoc-His(OH)-Gly-OH的方式进行投料，从原料角度上杜绝了1位His的消旋杂质的产生；3位4位以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的方式投料，同样从原料角度上避免了引入3-Asu杂质。
3、固相偶联步数由33步缩短至19步，大大降低固相合成中溶剂的用量，降低了物料成本，减少了三废排放。
4、选取Ile，Leu，Ala，Phe，Met，Gly这些不含侧链功能基团的氨基酸进行短肽片段的合成，结合成熟的HOSu/DCC偶联方法，可大大降低片段液相合成的成本，能够应用于工业大规模生产。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC树脂 2-氯三苯甲基氯树脂
Wang Resin 王树脂
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羟基苯并三唑
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
EA 乙酸乙酯
THF 四氢呋喃
PE 石油醚
DCC 二环己基碳二亚胺
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比，或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
实施例1：Fmoc-His(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-His(Trt)-OH 1239.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-His(Trt)-OSu 1340.4g，收率93.5％。
实施例2：Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制备
准确称取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例1中制备的Fmoc-His(Trt)-OSu(1290.2g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，剩余油状物加入2000ml甲醇，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中静置过夜，析出大量白色固体，抽滤，干燥得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH 916.1g，收率75.2％。
实施例3：Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml乙睛中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml乙睛中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu937.8g，收率92.3％。
实施例4：Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制备
准确称取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸钾447.7g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例3中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.42g,1.8mol)的乙睛溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去乙睛，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，剩余油状物加入2000ml甲醇，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中静置过夜，析出大量白色固体，抽滤，干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH 686.6g，收率81.5％。
实施例5：Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 766.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六环中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml二氧六环中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Ser(tBu)-OSu884.2g，收率92.1％。
实施例6：Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制备
准确称取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸氢钠272.16g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例5中制备的Fmoc-Ser(tBu)-OSu(864.9g,1.8mol)的二氧六环溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去二氧六环，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至3000ml，加入石油醚4000ml析晶，得Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH 838.2g，收率85.6％。
实施例7：Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 850.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六环中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml二氧六环中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Glu(OtBu)-OSu 941.7g，收率90.2％。
实施例8：Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制备
准确称取H-Met-OH 402.3g(2.7mol)和碳酸氢钾324.5g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例7中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu(940.6g,1.8mol)的二氧六环溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去二氧六环，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至4000ml，加入石油醚4000ml析晶，得Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH 832.6g，收率83.2％。
实施例9：Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 794.6g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml丙酮中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml丙酮中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Thr(tBu)-OSu910.9g，收率92.2％。
实施例10：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例9中制备的Fmoc-Thr(tBu)-OSu(1248.7g,1.8mol)的丙酮溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去丙酮，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油状物加入2000ml甲醇复溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 773.8g，收率84.3％。
实施例11：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制备
准确称取实施例10中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 765.2g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml丙酮中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml丙酮中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至3000～3500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu 812.2g，收率89.2％。
实施例12：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例11中制备的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu(728.4g,1.2mol)的丙酮溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去丙酮，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加热至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH 607.1g，收率81.2％。
实施例13：Fmoc-Asn(Trt)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 1193.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asn(Trt)-OSu 1279.3g，收率92.2％。
实施例14：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例13中制备的Fmoc-Asn(Trt)-OSu(1248.7g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油状物加入2000ml甲醇复溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1100.2g，收率86.1％。
实施例15：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的制备
准确称取实施例14中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1063.9g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至3000～3500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu 1079.6g，收率89.2％。
实施例16：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的制备
准确称取H-Ala-OH 160.2g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例15中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu(968.28g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加热至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 760.1g，收率81.1％。
实施例17：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的制备
准确称取实施例16中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 702.9g(0.9mol)和HOSu 103.5g(0.9mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 185.7g(1.5mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至3000～3500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu 704.9g，收率89.2％。
实施例18：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制备
准确称取H-Ala-OH 93.5g(1.05mol)和碳酸钠133.5g(1.26mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例17中制备的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu(614.6g,0.7mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加热至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH 510.5g，收率85.6％。
实施例19：Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu 926.6g，收率91.2％。
实施例20：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH的制备
准确称取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例19中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.4g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油状物加入2000ml甲醇复溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 877.2g，收率85.2％。
实施例21：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu的制备
准确称取实施例20中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 858.3g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至3000～3500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu 915.2g，收率91.2％。
实施例22：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例21中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu(802.8g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加热至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH 676.6g，收率82.3％。
实施例23：Fmoc-Trp(Boc)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Trp(Boc)-OH 1053.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Trp(Boc)-OSu 1135.3g，收率91.6％。
实施例24：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的制备
准确称取H-Leu-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例23中制备的Fmoc-Trp(Boc)-OSu(1115.5g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩除去乙酸乙酯，加入2500ml甲醇复溶，溶液澄清，置于-20℃析晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 905.1g，收率78.6％。
实施例25：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu的制备
准确称取实施例24中制备的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 896.4g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu 1096.3g，收率90.2％。
实施例26：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸钠228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例25中制备的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu(932.5g,1.2mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加热至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 725.5g，收率81.6％。
实施例27：Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制备
准确称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 937.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氢呋喃中，冰水浴搅拌。准确称取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氢呋喃中，缓慢滴加到上述溶液中，冰浴搅拌1h后25度继续反应2h。反应完成后抽滤，滤液旋蒸浓缩至2000～2500ml。浓缩完成后抽滤，滤液加入8000ml石油醚，析出大量白色固体，溶液-20度冰箱静置1h。静置后抽滤，滤饼以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固体，抽滤，滤饼干燥，称重，得Fmoc-Lys(Boc)-OSu 1036.8g，收率92.3％。
实施例28：Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制备
准确称取H-Ile-OH 355.6g(2.7mol)和碳酸钠343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)缓慢加入实施例28中制备的Fmoc-Lys(Boc)-OSu(1010.3g,1.8mol)的四氢呋喃溶液3000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应完全后，减压旋蒸除去四氢呋喃，剩余水溶液抽滤后冰水浴下加入10％的柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有机相，以3000ml饱和食盐水分三次洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，新加入2000ml四氢呋喃复溶，加入4000ml石油醚析晶，得Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH 871.2g，收率83.2％。
实施例29:Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin的合成
称取30.0g(Sub＝0.47mmol/g)Wang Resin置于固相反应器，以DMF洗涤树脂两次，200ml/次，重新加入DCM 200ml溶胀树脂30min。树脂溶胀的同时，称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 17.38g(42.3mmol,3eq),HOBt 6.28g(46.5mmol,3.3eq)，以150ml体积比为1:1的DMF和DCM的混合溶液溶解，冰浴10min，加入DIC 7.25ml(46.5mmol,3eq)活化5min。树脂溶胀及氨基酸活化完成后，投料反应，氮气搅拌，10min后加入DMAP 0.51g(4.23mmol,0.3eq)，继续反应5h。5h后，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，200ml/每次；DCM洗涤树脂2次，200ml/次。加入封端试剂180mL(50ml乙酸酐和42.5ml吡啶溶解于87.5mL DMF中)将剩余未反应羟基乙酰化2h。反应完成后抽滤反应液，分别以DMF，DCM，甲醇洗涤树脂3次，200ml/次，真空干燥后得Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 36.7g，改造后替代度为0.31mmol/g。
实施例30:Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的合成
称取CTC树脂30.0g(sub＝0.40mmol/g)置于合成柱中，用200mL DMF洗涤两次,加入200mL DCM溶胀30min；抽去DCM后，加入溶有9.86g(24mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液100ml，N2搅拌5min后加入DIPEA 4.0ml(24mmol)，继续鼓N2搅拌反应60min。反应完成后抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA(体积比17：2：1)混合溶液封端3次，每次200ml，反应10min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤3次，真空干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 37.1g，测改造后替代度为0.30mmol/g。
实施例31：替度鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例29中制备的替代度为0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 32.25g(合成规模10mmol)置于固相反应器中，DMF洗涤树脂2次，150ml/次，加入150ml DCM溶胀30min；树脂溶胀完毕后以20％的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol，3eq)，HOBt 4.05g(30mmol，3eq)，以120ml体积比为1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10min，加入DIC 4.68ml(30mmol，3eq)活化5min。活化完成后投料反应，氮气搅拌2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，检测反应完成后，抽滤除去反应液，以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，200ml/次。以20％的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色，32位Thr偶联完成。
按照32位Thr的偶联方法，依照替度鲁肽肽序，依次连接氨基酸及短肽片段：
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽树脂合成结束后，依次以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤3次，200ml/次，树脂25度真空干燥8h，称重得96.33g。
实施例32：替度鲁肽肽树脂的制备
准确称取实施例30中制备的替代度为0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 33.33g(合成规模10mmol)置于合成柱中，DMF洗涤树脂2次，150ml/次，加入150ml DCM溶胀30min；树脂溶胀完毕后以20％的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol，3eq)，HOBt 4.05g(30mmol，3eq)，以120ml体积比为1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10min，加入DIC 4.68ml(30mmol，3eq)活化5min。活化完成后投料反应，氮气搅拌2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，检测反应完成后，抽滤除去反应液，以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，200ml/次。以20％的哌啶/DMF脱Fmoc 2次，150ml/次，分别反应5min和10min；脱保护完成后以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，150ml/次。取小样以Kaiser试剂检测，树脂呈深蓝色，32位Thr偶联完成。
按照32位Thr的偶联方法，依照替度鲁肽肽序，依次连接氨基酸及短肽片段：
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽树脂合成结束后，依次以DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤3次，200ml/次，树脂25度真空干燥8h，称重得92.12g。
实施例33：替度鲁肽粗肽的制备
将实施例31所制备的替度鲁肽肽树脂90g置于2000ml圆底烧瓶中，冰浴预冷。配置裂解试剂900ml，其体积比为TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O＝82.5:5:5:2.5:5，置于-20冰箱中预冷30min。按照1g树脂10ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中，冰水浴搅拌2h，25度搅拌2h，停止反应后抽滤，树脂以TFA洗涤两次，100ml/次，合并滤液，缓慢倾倒至9L预冷的乙醚中，搅拌，置于-20冰箱中静置1h。将乙醚沉降液离心，并以乙醚洗涤六次，离心所得固体干燥，得39.88g，收率106.3％。取粗肽样品分析，纯度为73.1％。
实施例34：替度鲁肽粗肽的制备
将实施例32所制备的替度鲁肽肽树脂90g置于1000ml圆底烧瓶中，冰浴预冷。配置裂解试剂900ml，其体积比为TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O＝82.5:5:5:2.5:5，置于-20冰箱中预冷30min。按照1g树脂10ml的比例将裂解试剂加入到肽树脂中，冰水浴搅拌2h，25度搅拌2h，停止反应后抽滤，树脂以TFA洗涤两次，100ml/次，合并滤液，缓慢倾倒至9L预冷的乙醚中，搅拌，置于-20冰箱中静置1h。将乙醚沉降液离心，并以乙醚洗涤六次，离心所得固体干燥，得34.33g，收率91.5％。取粗肽样品分析，纯度为71.3％。
实施例35：替度鲁肽粗肽的纯化
称取实施例33所得粗肽10.0g，以500ml 5％的乙腈/水溶解，超声助溶，0.45um滤膜过滤。内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得替度鲁肽精肽4.23g，纯度99.5％以上，总收率45.08％。
实施例36：替度鲁肽粗肽的纯化
称取实施例34所得粗肽10.0g，以500ml 5％的乙腈/水溶解，超声助溶，0.45um滤膜过滤。内径为100mm的C18制备柱，流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈，上样量为10g/针，流速300ml/min，检测波长210nm。梯度洗脱，峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度为98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水体系转盐后冻干得替度鲁肽精肽4.19g，纯度99.5％以上，总收率38.36％。