一种艾塞那肽的制备方法及其产品与流程

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种通过片段法合成艾塞那肽的方法。

背景技术：

艾塞那肽是一种含有39个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为：H₂N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂，是GLP-1的类似物，能够刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通过减少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖浓度，从而改善血糖控制。

艾塞那肽的制备方法目前主要采用传统经典的固相多肽合成法，此法合成效率低、纯化成本高。

因此，开发一种高效率低成本合成艾塞那肽的方法成为本领域急需解决的技术问题。

张腾在《精细化工》，2014年10月公开艾塞那肽的合成，该合成方法将艾塞那肽分成六个片段进行固相合成法，该方法中使用了传统的多肽合成碳端酰胺化，所用氨基酸都为全保护氨基酸，价格较贵，并在片段合成时使用了价格昂贵的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基树脂的方案，成本较高。本方案尽可能降低成本较高的全保护氨基酸的使用，提高价格低廉的游离氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种合成艾塞那肽的方法，其提高了合成效率，减少了杂质累积，降低了纯化难度，为有效解决艾塞那肽合成规模化，降低纯化难度，提高产品纯度。

具体来说，本发明公开了一种固液联合法合成艾塞那肽的方法，以N-C延伸策略，将艾塞那肽的39个氨基酸分成13个小片段，先用液相法分别合成12个N端Fmoc保护小片段肽，用固相法合成第13个肽树脂片段，然后用固相法将12个小片段依次连接到第13个肽树脂片段上，得到艾塞那肽树脂，然后进行切割，得到艾塞那肽粗品，粗品经纯化后得到艾塞那肽产品。

更具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。

一种艾塞那肽的制备方法，所述方法通过如下的13个片段的保护片段进行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法通过如下的13个片段进行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法包括如下步骤：

(1)通过液相合成片段1-12，通过固相合成片段13；以及

(2)组装连接得到产品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是将片段的羧基端通过N-羟基丁二酰亚胺活化后连接氨基酸而延长氨基酸链。

其中，所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步骤：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

将Fmoc-His(Trt)-OH、有机溶剂和N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入溶解在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺进行反应，固液分离得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

将甘氨酸和碳酸氢钠混合水溶液加到步骤(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液中进行反应，之后对反应液进行浓缩，调节pH值至2～3，萃取分离得到有机相，经浓缩得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

所述片段2-12的合成方法如下：选择相应的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

中所述步骤(1)所述有机溶剂为1,4-二氧六环或者四氢呋喃；优选所述Fmoc-His(Trt)-OH与有机溶剂是按质量-体积比为1g：(5～10)mL混合。

其中步骤(1)所述在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺是二环己基碳二亚胺与有机溶剂按质量-体积比为1g：(2～3)mL的混合溶液.

其中步骤(1)Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2)；步骤(1)和步骤(2)所述反应条件为室温反应2～3小时。

其中步骤(2)所述萃取步骤的萃取剂是乙酸乙酯；优选萃取的步骤是用乙酸有机乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤得到有机相；甘氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔比为(1～1.5):(1～2.5):1；

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步骤:

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶胀后脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将步骤(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；以及

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步骤(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步骤(2)的方法依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

步骤(1)所述溶胀是用N,N-二甲基甲酰胺溶胀；优选所述各个步骤脱Fmoc是用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc；更优选所述反应的条件是在氮气保护下，常温搅拌1～2小时

其中所述组装连接得到产品包括如下步骤：

(1)将片段13脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)按照步骤(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)将步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin脱Fmoc两次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)按照步骤(3)的方法在步骤(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脱Fmoc两次得到艾塞那肽树脂，加入切割液中切割，经分离得到艾塞那肽粗品，经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽产品。

其中步骤(4)所述切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的切割液；所述连接的12个片段肽与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(1～3):1。

所述1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺各个物质与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(2～4):1。

一种所述制备方法制备得到艾塞那肽，其纯度大于98％。

再具体来说，本发明提供一种固液联合法合成艾塞那肽的方法，其由下述步骤组成：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

①合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

将Fmoc-His(Trt)-OH与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：5～10mL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：2～3mL的混合溶液，Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2)，室温反应2～3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液；

②合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

将甘氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液加到步骤①得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔比为(1～1.5):(1～2.5):1，室温搅拌反应18～20小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

①合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

将Fmoc-Glu(otBu)-OH与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：5～10mL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：2～3mL的混合溶液，Fmoc-Glu(otBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2)，室温反应2～3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液；

②合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

将甘氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液加到步骤①得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-Glu(otBu)-OH的摩尔比为(1～1.5):(1～2.5):1，室温搅拌反应18～20小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH；

③合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

将Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：5～10mL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为1g：2～3mL的混合溶液，Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2)，室温反应2～3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液；

④合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

将苏氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液加到步骤③得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六环或者四氢呋喃溶液中，苏氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH的摩尔比为(1～1.5):(1～2.5):1，室温搅拌反应18～20小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

(3)合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmoc-Phe--Thr-S er-COOH；

(4)合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-S er-COOH；

(5)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步骤(1)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步骤(1)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH；

(6)合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-Gl u-COOH；

(7)合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH；

(8)合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmo c-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pb f)-Leu-Phe-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH；

(9)合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH；

(10)合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmo c-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH；

(11)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH；

(12)合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步骤(2)中①的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步骤(2)中②的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步骤(2)中③的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步骤(2)中④的合成方法合成Fmo c-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH；

(13)合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

①合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～2小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

②合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～2小时，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；

③合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步骤②的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBH A Resin；

(14)合成艾塞那肽

①组装连接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin

将步骤(13)得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Re sin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、步骤(12)得到的Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～2小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr o-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

②组装连接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步骤①的组装连接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、F moc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(p bf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-L ys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Am ide MBHA Resin；

③组装连接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin

将Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为0.5～1:1～2:1的混合液、Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin；

④组装连接艾塞那肽

按照步骤③的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Gl u(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Met-Glu-Glu-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂，用质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的切割液，室温搅拌1～3小时，过滤，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽；

上述12个片段肽与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(1～3):1，1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(2～4):1。

本发明有益效果如下：

1.本发明提高了合成效率，减少了杂质累积，降低了纯化难度，为有效解决艾塞那肽合成规模化，降低纯化难度，提高产品纯度，提供了一种新方法。

2.本发明尽可能降低成本较高的全保护氨基酸原料的使用，提高价格低廉的游离氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

3.本发明最大限度的减少了价格昂贵的Rink Amide-AM Resin或Rink A mide-MBHA Resin等氨基树脂的使用，降低了合成成本。

4.本发明片段合成时，采用液相法合成，缩合时采用固相法进行片段对接，兼顾了液相规模化、成本低等优点及固相法步骤简单、效率高的优点，大幅的降低了生产成本，提高了生产效率。

附图说明

图1是实施例1合成的艾塞那肽的质谱图。

图2是实施例1合成的艾塞那肽的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

下面对说明书中的简写进行说明：

Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其名称是4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂

Fmoc：芴甲氧羰基

pbf、tbu、Otbu、Trt、Boc都是保护基，名称分别是2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基、叔丁基、叔丁氧基、三苯甲基、叔丁氧羰基。

本发明所述“全保护片段”是指对氨基酸中影响合成的基团进行保护后得到具有保护基的片段。

一种艾塞那肽的制备方法，所述方法通过如下的13个片段的保护片段进行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

在一种具体实施方式中，所述方法通过如下的13个片段进行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

这是发明人对该序列分析并结合各个氨基酸的性质，同时考虑到合成的成本，在各个因素之间进行选择和实验获得的结果，及对39个氨基酸的位置进行拆分为如上所述的13个片段。上述选择是发明人创造性劳动的结果，其控制了不利因素，有效降低成本。

上述序列中各个氨基酸选择的保护基可以是任意保护基，只要能够达到所希望的可以保护的技术效果即可，但发明人经过优选上述取代基效果最好。选择所述氮端和碳端是兼顾氨基酸作为碳端和氮端的反应活性以利于片段的组装反应，同时兼顾断点的选择以平衡全保护片段的长度、溶解性、数量，这样可以有效减少合成步骤、提高效率、降低成本，减少组装完成后的处理步骤。

在一种具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)通过液相合成片段1-12，通过固相合成片段13；以及

(2)组装连接得到产品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是将片段的羧基端通过N-羟基丁二酰亚胺活化后连接氨基酸而延长氨基酸链。

所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步骤：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

将Fmoc-His(Trt)-OH、有机溶剂和N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解，之后加入溶解在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺进行反应，固液分离得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

将甘氨酸和碳酸氢钠混合水溶液加到步骤(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液中进行反应，之后对反应液进行浓缩，调节pH值至2～3，萃取分离得到有机相，经浓缩得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

该方法在合成片段结构时，使用了N-羟基丁二酰亚胺进行羧基的活化，可有效防止氨基酸缩合过程中旋光性改变，而使用二环己基碳二亚胺进行缩合，反应生成二环己基脲，该物质在一般有机溶剂中的溶解度都比较小，仅需经过简单的过滤就可除去，另，Fmoc-His(Trt)-COOSu合成反应后，过量的二环己基碳二亚胺在水中即反应生成二环己基脲，不会影响与甘氨酸的缩合反应。

所述片段2-12的合成方法如下：选择相应的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

其中，所述步骤(1)所述有机溶剂为1,4-二氧六环或者四氢呋喃；优选所述Fmoc-His(Trt)-OH与有机溶剂是按质量-体积比为1g：(5～10)mL混合。

其中，步骤(1)所述在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺是二环己基碳二亚胺与有机溶剂按质量-体积比为1g：(2～3)mL的混合溶液。

其中，步骤(1)Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2)；步骤(1)和步骤(2)所述反应条件为室温反应2～3小时。

其中，步骤(2)所述萃取步骤的萃取剂是乙酸乙酯；优选萃取的步骤是用乙酸有机乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤得到有机相；甘氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔比为(1～1.5):(1～2.5):1。

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步骤：

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶胀后脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA R esin；该步骤中使用的原料是Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其是由MB HA Resin连接Fmoc保护修饰的Rink Amide Linker构成。本发明使用的是取代度为0.34mmol/g，但其他取代度的也可以达到相同或类似的技术效果，也在本发明的保护范围内。本发明使用的取代度0.34mmol/g是从合成片段的产率、纯度、树脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将步骤(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MB HA Resin；

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步骤(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步骤(2)的方法依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

步骤(1)所述溶胀是用N,N-二甲基甲酰胺溶胀；优选所述各个步骤脱Fmoc是用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc；更优选所述反应的条件是在氮气保护下，常温搅拌1～2小时

其中所述组装连接得到产品包括如下步骤：

(1)将片段13脱Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin；

(2)按照步骤(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)将步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin脱Fmoc两次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ri nk Amide MBHA Resin；

(4)按照步骤(3)的方法在步骤(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(t Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脱Fmoc两次得到艾塞那肽树脂，加入切割液中切割，经分离得到艾塞那肽粗品，经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽产品。

其中步骤(4)所述切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的切割液；所述连接的12个片段肽与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(1～3):1。

所述1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺各个物质与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(2～4):1。

该步骤中各个物质的投料量均是以Fmoc-Rink Amide MBHA Resin作为参比，通过这种控制有助于对投料量的有效控制，保证原料的完全反应，从而达成保持产品品质，同时控制成本的目的。该比例保证了合成的成本最低化，同时纯度和工艺达到要求。在制备过程中各个物质之间的比例可以进行适当调节，获得的产品仍旧能够满足要求，因此，对制备过程中的各个物质之间的比例进行适当调整也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了所述制备方法制备得到艾塞那肽，其纯度大于98％

实施例

下面对实施例中使用的各个物质的来源进行说明，如果没有特别说明，所使用的原料和仪器均是商购获得，是本领域常规使用仪器和原料，只要其能满足实验需要即可。

本发明的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的取代度为0.34mmol/g，2-c hlorotrityl chloride resin的取代度为1.74mmol/g，均由天津南开和成科技有限公司生产。

固相多肽合成反应器为通用的多肽合成反应器，可以购自成都斯诺进出口贸易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色谱仪为日立全自动L2000。

制备型高效液相色谱仪为创新恒通LC3000，C18分析色谱柱为大连物理化学研究所4.6mm×250mm，C18制备色谱柱为成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺购自上海吉尔生化有限公司。

LTQ-XL电喷雾电离质谱仪为美国Thermo Finnigan公司。

哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷等其它试剂均为国产AR或CP。

实施例1

1、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

将30.99gFmoc-His(Trt)-OH与300ml 1,4-二氧六环混合，室温搅拌，加入6.33gN-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环按质量-体积比为11.35g：23mL的混合溶液，室温反应,3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

将4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，室温搅拌反应20小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到27.07gFmoc-His(Trt)-Gly-COOH。

反应中Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:1.1:1.1:1.1。

2、合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

(1)合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

将21.28gFmoc-Glu(otBu)-OH与200ml 1,4-二氧六环混合，室温搅拌，加入6.33gN-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环或者四氢呋喃按质量-体积比为11.35g：23mL的混合溶液，室温反应3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

将4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤(1)得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，室温搅拌反应18小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到22.20gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH。

反应中Fmoc-Glu(otBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:1.1:1.1:1.1。

(3)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

将19.30gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH与190ml 1,4-二氧六环混合，室温搅拌，加入5.06gN-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1,4-二氧六环按质量-体积比为9.08g：20mL的混合溶液，室温反应3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六环溶液。

(4)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

将5.24g苏氨酸和3.70g碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液加到步骤(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，室温搅拌反应20小时，减压浓缩，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到21.01gFmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

反应中Fmoc-Glu(otBu)-Gly-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苏氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1:1.1:1.1:1.1

3、合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成21.87gFmoc-Phe-Thr-Ser-COOH。

4、合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成22.51gFmoc-As p-Leu-Ser-COOH。

5、合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步骤1中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步骤1中(2)的合成方法合成21.48gFmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH。

6、合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成23.68gFmoc-Met-Glu-Glu-COOH。

7、合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成21.92gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH。

8、合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-A rg(pbf)-Leu-Phe-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成34.75gFmoc-Ar g(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH。

9、合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成26.38gFmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH。

10、合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成23.81gFmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH。

11、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成F moc-Gly-Pro-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成18.29gFmoc-Gly-Pro-Ser-COOH。

12、合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步骤2中(1)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步骤2中(2)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步骤2中(3)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步骤2中(4)的合成方法合成19.23gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH。

13、合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将30gFmoc-Rink Amide MBHA Resin(取代度0.34mmol/g)用300ml N,N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液300ml反应20min脱Fmoc-，分别用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗涤两次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、7.82gFmoc-Ser(tBu)-OH、2.76g1-羟基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将步骤(1)Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液300ml反应20min脱Fmoc-，分别用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗涤两次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、6.88gFmoc-Pro-OH、2.76g 1-羟基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2小时，得到F moc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步骤(2)的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接F moc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与所加保护氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为：1:2:2:2:2。

14、合成艾塞那肽

(1)组装连接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

将步骤13得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液300ml反应20min脱Fmoc-，分别用异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗涤两次，加入300ml N,N-二甲基甲酰胺、10.43gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、2.76g 1-羟基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

(2)组装连接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MB HA Resin

按照步骤(1)的组装连接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

(3)组装连接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

将Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液400ml脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:1:1的混合液400ml、12.15gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、2.76g 1-羟基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3小时，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Le u-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)组装连接艾塞那肽

按照步骤(3)的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-C OOH，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂，用质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的切割液，室温搅拌2小时，过滤，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽14.13g，收率33.1％；

所加各片段、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为：2:2:2:2:1。

采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1，由图可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与艾塞那肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为艾塞那肽。采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，液相色谱图见图2，由图2可见，艾塞那肽的纯度大于98％。

实施例2

本实施例步骤1中，Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

本实施例步骤2中Fmoc-Glu(otBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Glu(otBu)-Gly-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苏氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤3中，Fmoc-Phe-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苏氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Phe-Thr-CO OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤4中，Fmoc-Asp(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Asp(otBu)-Leu-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤5中，Fmoc-Lys(Boc)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酰胺、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤6中，Fmoc-Met-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Met-Glu-C OOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤7中，Fmoc-Glu(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、缬氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤8中，Fmoc-Arg(pbf)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Arg(pb f)-Leu-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苯丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、异亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤9中，Fmoc-Glu(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、色氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤10中，Fmoc-Lys(Boc)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、天冬酰胺、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-L ys(Boc)-Asn-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它与实施例1相同。

该实施例步骤11中，Fmoc-Gly-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、脯氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Gly-Pro-CO OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤12中，Fmoc-Ser(tBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，Fmoc-Ser(tB u)-Gly-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.3:1.3:1.3:1.3，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤13中，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与所加保护氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为：1:2:3:3:3，该步骤的其它与实施例1相同。

该实施例步骤14中，所加各片段、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为：3:3:3:3:1，该步骤的其它步骤与实施例1相同。得到14.01g艾塞那肽，收率32.8％。采用实施例1相同的条件对产品采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，所合成的产物的分子量及分子离子峰与艾塞那肽的分子量及分子离子峰一致。采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，纯度大于98％。

实施例3

本实施例步骤1中，Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

本实施例步骤2中Fmoc-Glu(otBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Glu(otBu)-Gly-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苏氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤3中，Fmoc-Phe-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苏氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Phe-Thr-CO OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤4中，Fmoc-Asp(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Asp(otBu)-Leu-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤5中，Fmoc-Lys(Boc)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酰胺、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤6中，Fmoc-Met-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Met-Glu-C OOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤7中，Fmoc-Glu(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、缬氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤8中，Fmoc-Arg(pbf)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Arg(pb f)-Leu-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、苯丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、异亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤9中，Fmoc-Glu(otBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、色氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、亮氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤10中，Fmoc-Lys(Boc)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、天冬酰胺、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-L ys(Boc)-Asn-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它与实施例1相同。

该实施例步骤11中，Fmoc-Gly-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、脯氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Gly-Pro-CO OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丝氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤12中，Fmoc-Ser(tBu)-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、甘氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，Fmoc-Ser(tB u)-Gly-COOH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、丙氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.5:1.5:1.5:1.5，该步骤的其它步骤与实施例1相同。

该实施例步骤13中，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与所加保护氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为：1:3:4:4:4，该步骤的其它与实施例1相同。

该实施例步骤14中，所加各片段、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为：4:4:4:4:1，该步骤的其它步骤与实施例1相同。得到13.20g艾塞那肽，收率30.9％。采用实施例1相同的条件对产品采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，所合成的产物的分子量及分子离子峰与艾塞那肽的分子量及分子离子峰一致。采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，纯度大于98％。