一种艾塞那肽的制备方法及其产品与流程

文档序号:12399357阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种艾塞那肽的制备方法,其特征在于,所述方法通过如下的13个片段的保护片段进行合成:His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

2.如权利要求1所述艾塞那肽的制备方法,其特征在于,所述方法通过如下的13个片段进行合成:片段1:Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2:Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3:Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4:Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5:Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6:Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7:Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8:Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9:Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10:Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11:Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12:Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13:Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

3.如权利要求2所述艾塞那肽的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)通过液相合成片段1-12,通过固相合成片段13;以及

(2)组装连接得到产品。

4.如权利要求2或3所述艾塞那肽的制备方法,其中所述片段1-12的液相合成方法是将片段的羧基端通过N-羟基丁二酰亚胺活化后连接氨基酸而延长氨基酸链。

5.如权利要求2-4任一项所述艾塞那肽的制备方法,所述片段1:Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步骤:

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

将Fmoc-His(Trt)-OH、有机溶剂和N-羟基丁二酰亚胺混合至溶解,之后加入溶解在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺进行反应,固液分离得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液;

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

将甘氨酸和碳酸氢钠混合水溶液加到步骤(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有机溶液中进行反应,之后对反应液进行浓缩,调节pH值至2~3,萃取分离得到有机相,经浓缩得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH;

所述片段2-12的合成方法如下:选择相应的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

6.如权利要求5所述艾塞那肽的制备方法,其中所述步骤(1)所述有机溶剂为1,4-二氧六环或者四氢呋喃;优选所述Fmoc-His(Trt)-OH与有机溶剂是按质量-体积比为1g:(5~10)mL混合。

7.如权利要求5或6所述艾塞那肽的制备方法,其中步骤(1)所述在有机溶剂中的二环己基碳二亚胺是二环己基碳二亚胺与有机溶剂按质量-体积比为1g:(2~3)mL的混合溶液。

8.如权利要求5-7任一项所述艾塞那肽的制备方法,其中步骤(1)Fmoc-His(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:(1~1.5):(1~2);步骤(1)和步骤(2)所述反应条件为室温反应2~3小时。

9.如权利要求5-8任一项所述艾塞那肽的制备方法,其中步骤(2)所述萃取步骤的萃取剂是乙酸乙酯;优选萃取的步骤是用乙酸有机乙酯萃取,有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤得到有机相;甘氨酸、碳酸氢钠与Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔比为(1~1.5):(1~2.5):1。

10.如权利要求2-9任一项所述艾塞那肽的制备方法,片段13:Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步骤:

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶胀后脱Fmoc,之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA R esin;

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

将步骤(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脱Fmoc,之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MB HA Resin;以及

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步骤(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步骤(2)的方法依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH,得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

11.如权利要求10所述艾塞那肽的制备方法,步骤(1)所述溶胀是用N,N-二甲基甲酰胺溶胀;优选所述各个步骤脱Fmoc是用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc;更优选所述反应的条件是在氮气保护下,常温搅拌1~2小时。

12.如权利要求3-11任一项所述制备方法,其中所述组装连接得到产品包括如下步骤:

(1)将片段13脱Fmoc,之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12,1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin;

(2)按照步骤(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段片段11、片段10、片段9和片段8,得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin;

(3)将步骤(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin脱Fmoc两次,之后加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为(0.5~1):(1~2):1的混合液、片段7、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺进行反应得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ri nk Amide MBHA Resin;

(4)按照步骤(3)的方法在步骤(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(t Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次组装连接片段6、片段5、片段4、片段3,片段2和片段1,之后脱Fmoc两次得到艾塞那肽树脂,加入切割液中切割,经分离得到艾塞那肽粗品,经反相色谱纯化、冷冻干燥,得到艾塞那肽产品。

13.如权利要求12所述制备方法,其中步骤(4)所述切割液是质量百分比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三异丙基硅烷5%的切割液;所述连接的12个片段肽与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(1~3):1。

14.如权利要求12或13所述制备方法,所述1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺各个物质与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比为(2~4):1。

15.如权利要求1-14任一项所述制备方法制备得到艾塞那肽,其纯度大于98%。

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