本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种经济实用型骨组织蛋白提取与分离方法。
背景技术：
目前许多问题如骨折愈合、骨肿瘤发生机制、组织工程骨修复骨缺损机制等都急需解决，过去对体内骨组织的病理生理学研究主要采用免疫组化的方法。随着研究的不断深入，对相关问题的解释应逐步深入到蛋白水平和基因水平，这就要求对骨组织中蛋白的表达情况进行检测，这样才能更深入的解释相关现象的发生机制，从而完善相关的理论来指导临床实践。但是在骨组织的研究中，由于受到骨组织自身特性的限制，即骨组织硬度大，无机矿化物含量丰富，所以不便于对骨组织中的蛋白质进行提取和分析，另外以往对于软组织蛋白的提取方法也不适用于骨组织，从而在一定程度上限制了对体内骨组织的相关问题进行研究。
现在对于骨组织蛋白水平的研究，特别是在组织工程骨的研究方面，主要是采取体外培养骨组织中的细胞，如成骨细胞，破骨细胞等，然后对细胞合成和分泌的蛋白进行分析和检测，但事实上，由于体内外环境的不同，常导致实验结果不完全一致。因此，有必要探讨一种快速有效的骨组织中蛋白提取法，以利于直接研究人体内骨组织的代谢情况。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种提取工艺简单、提取的蛋白质纯度高且经济实用的骨组织蛋白提取与分离方法。本发明通过运用离心管来得到粉末状股骨干的精确质量，并将裂解液加入盛有粉末状股骨干的离心管中震荡即可制备高纯度的蛋白质。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种经济实用型骨组织蛋白提取与分离方法，具体步骤如下：
(1)准备离心管并称重、记录其质量，将称重后的离心管放置于冰上预冷，备用；
(2)量取磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及苯甲基磺酰氟加入冷裂解缓冲液后，置于冰上并搅拌均匀，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解缓冲液中加入5μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂及5μl苯甲基磺酰氟；
(3)用注射针吸取生理盐水将股骨上的骨髓冲洗掉，并称取冲洗后的股骨干0.3～0.5g，备用；
(4)将步骤(3)中备用的股骨干放置于研钵内，并向研钵中加入液氮预冷研钵和股骨干，将预冷后的股骨干进行研磨5～10min直至股骨干成粉末状，并在研磨期间向研钵内不断加入液氮，即得粉末状股骨干，备用；
(5)将步骤(4)中备用的粉末状股骨干转移至步骤(1)中备用的离心管中，再次称重离心管，计算得出粉末状股骨干的质量，将该质量乘以1/3后，按照0.2～0.4g/mL向离心管中添加步骤(2)中备用的裂解液，即得混合液，备用；
(6)将步骤(5)中备用的混合液在3～6℃的条件下震荡15～20min，并将震荡后的混合液静置5～10min，即得悬浊液，备用；
(7)将步骤(6)中备用的悬浊液置于4℃、3000～5000rpm的条件下离心5～10min，即得上清液和沉淀，将上清液吸至新的离心管中并分装保存在-80℃的条件下，即得骨组织蛋白。
进一步地，所述步骤(2)中裂解缓冲液为将10mL的1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸钠溶液充分混合均匀后并用无菌水定容至100mL制得。
进一步地，所述步骤(5)中按照0.2g/mL向离心管中添加裂解液。
进一步地，所述步骤(6)中将混合液在4℃的条件下震荡20min。
进一步地，所述步骤(7)中将悬浊液置于4℃、3000rpm的条件下离心5min。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
(1)本发明中运用离心管，可以得到研磨后粉末状股骨干的精确质量，避免研磨以及转移过程中损失股骨干所造成的误差；本发明中将悬浊液置于4℃、3000rpm的条件下离心5min，在该条件下所制备的样品浓度最高，从而保证了蛋白质的纯度。
(2)本发明中的裂解缓冲液可以在非变性的条件下迅速裂解组织细胞，使其释放出细胞内的蛋白，便于后续研究；本发明中称取冲洗后的股骨干用于研磨，股骨干中含有大量的蛋白钙，便于蛋白的提取。
(3)在研磨期间向研钵内不断加入液氮，一方面是为了终止细胞内外一切生物反应，比如提取RNA时，防止RNA酶的降解反应等；另一方面就是股骨干细胞在液氮中被完全冻硬了，研磨可以达到很好的破胞效果，从而使里边的物质更完全的释放出来；
(4)本发明中的混合液在低温下震荡15～20min，低温下可以防止蛋白质被降解，而且低温下蛋白质不容易变性；本发明中的骨组织蛋白分装保存，可以避免骨组织蛋白被反复冻融的现象。
综上所述，本发明中的骨组织蛋白提取与分离技术操作简单、提取的蛋白浓度高，因此，该骨组织蛋白提取与分离方法适合在生物学领域推广和应用。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种经济实用型骨组织蛋白提取与分离方法，具体步骤如下：
(1)准备离心管并称重、记录其质量，将称重后的离心管放置于冰上预冷，备用；
(2)量取磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及苯甲基磺酰氟加入冷裂解缓冲液后，置于冰上并搅拌均匀，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解缓冲液中加入5μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂及5μl苯甲基磺酰氟；
(3)用注射针吸取生理盐水将股骨上的骨髓冲洗掉，并称取冲洗后的股骨干0.3g，备用；
(4)将步骤(3)中备用的股骨干放置于研钵内，并向研钵中加入液氮预冷研钵和股骨干，将预冷后的股骨干进行研磨5min直至股骨干成粉末状，并在研磨期间向研钵内不断加入液氮，即得粉末状股骨干，备用；
(5)将步骤(4)中备用的股骨干转移至步骤(1)中备用的离心管中，再次称重离心管，计算得出粉末状股骨干的质量，将该质量乘以1/3后，并按照0.2g/mL向离心管中添加步骤(2)中备用的裂解液，即得混合液，备用；
(6)将步骤(5)中备用的混合液在4℃的条件下震荡15min，并将震荡后的混合液静置5min，即得悬浊液，备用；
(7)将步骤(6)中备用的悬浊液置于4℃、3000rpm的条件下离心5min，即得上清液和沉淀，将上清液吸至新的离心管中并分装保存在-80℃的条件下，即得骨组织蛋白。
在本实施例中，所述步骤(2)中裂解缓冲液为将10mL的1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸钠溶液充分混合均匀后并用无菌水定容至100mL制得。
实施例2
一种经济实用型骨组织蛋白提取与分离方法，具体步骤如下：
(1)准备离心管并称重、记录其质量，将称重后的离心管放置于冰上预冷，备用；
(2)量取磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及苯甲基磺酰氟加入冷裂解缓冲液后，置于冰上并搅拌均匀，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解缓冲液中加入5μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂及5μl苯甲基磺酰氟；
(3)用注射针吸取生理盐水将股骨上的骨髓冲洗掉，并称取冲洗后的股骨干0.4g，备用；
(4)将步骤(3)中备用的股骨干放置于研钵内，并向研钵中加入液氮预冷研钵和股骨干，将预冷后的股骨干进行研磨8min直至股骨干成粉末状，并在研磨期间向研钵内不断加入液氮，即得粉末状股骨干，备用；
(5)将步骤(4)中备用的股骨干转移至步骤(1)中备用的离心管中，再次称重离心管，计算得出粉末状股骨干的质量，将该质量乘以1/3后，并按照0.3g/mL向离心管中添加步骤(2)中备用的裂解液，即得混合液，备用；
(6)将步骤(5)中备用的混合液在3℃的条件下震荡18min，并将震荡后的混合液静置8min，即得悬浊液，备用；
(7)将步骤(6)中备用的悬浊液置于4℃、4000rpm的条件下离心8min，即得上清液和沉淀，将上清液吸至新的离心管中并分装保存在-80℃的条件下，即得骨组织蛋白。
在本实施例中，所述步骤(2)中裂解缓冲液为将10mL的1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸钠溶液充分混合均匀后并用无菌水定容至100mL制得。
实施例3
一种经济实用型骨组织蛋白提取与分离方法，具体步骤如下：
(1)准备离心管并称重、记录其质量，将称重后的离心管放置于冰上预冷，备用；
(2)量取磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及苯甲基磺酰氟加入冷裂解缓冲液后，置于冰上并搅拌均匀，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解缓冲液中加入5μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂及5μl苯甲基磺酰氟；
(3)用注射针吸取生理盐水将股骨上的骨髓冲洗掉，并称取冲洗后的股骨干0.5g，备用；
(4)将步骤(3)中备用的股骨干放置于研钵内，并向研钵中加入液氮预冷研钵和股骨干，将预冷后的股骨干进行研磨10min直至股骨干成粉末状，并在研磨期间向研钵内不断加入液氮，即得粉末状股骨干，备用；
(5)将步骤(4)中备用的股骨干转移至步骤(1)中备用的离心管中，再次称重离心管，计算得出粉末状股骨干的质量，将该质量乘以1/3后，并按照0.4g/mL向离心管中添加步骤(2)中备用的裂解液，即得混合液，备用；
(6)将步骤(5)中备用的混合液在6℃的条件下震荡20min，并将震荡后的混合液静置10min，即得悬浊液，备用；
(7)将步骤(6)中备用的悬浊液置于4℃、5000rpm的条件下离心10min，即得上清液和沉淀，将上清液吸至新的离心管中并分装保存在-80℃的条件下，即得骨组织蛋白。
在本实施例中，所述步骤(2)中裂解缓冲液为将10mL的1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸钠溶液充分混合均匀后并用无菌水定容至100mL制得。
对照例
(1)将离心管放置冰上预冷，备用；
(2)量取磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及苯甲基磺酰氟加入冷裂解缓冲液后，置于冰上并搅拌均匀，即得裂解液，其中，每1ml冷裂解缓冲液中加入5μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂及5μl苯甲基磺酰氟；
(3)称取100g股骨干置于培养皿中，用手术剪将股骨干剪成3mm×3mm的小块，在4℃的条件下，向培养皿中加入1mL步骤(2)中制备的裂解液，并用玻璃匀浆器上下匀浆15次，即得组织匀浆液，备用；
(4)将步骤(3)中备用的组织匀浆液转移至步骤(1)中预冷的离心管中，将盛有组织匀浆液的离心管置于4℃、12000rpm的条件下离心5min，即得上清液和沉淀，将上清液吸至新的预冷的离心管中并分装保存在-70℃的条件下，即得骨组织蛋白。
在本实施例中，所述步骤(2)中裂解缓冲液为将10mL的1mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200μL的0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液和10mL的10％的十二烷基硫酸钠溶液充分混合均匀后并用无菌水定容至100mL制得。
实验结果
分别测定上述实施例1制备的骨组织蛋白和对照例制备的骨组织蛋白的成分，并将测得的实验结果列于下表。
表1蛋白质的浓度对比表
本发明通过对实施例1制备的骨组织蛋白和对照例制备的骨组织蛋白的成分测定，并分析实验数据发现本实施例1制备的蛋白质浓度大约是对照例中蛋白质浓度的4倍，由此发现，本发明中的提取和分离蛋白质的工艺明显优于现有技术中提取蛋白质的工艺，因此，本发明中提取和分离蛋白质的工艺适合在生物学领域推广和应用。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。