一种新的人NOTCH1NICD蛋白抗原、抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体及其制备技术领域，具体涉及一种特异性针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

NOTCH信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，它是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一，调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化。从果蝇到人类，NOTCH信号途径的遗传特征高度保守，而在哺乳动物中其调控过程尤为复杂。

NOTCH受体、NOTCH配体和细胞内效应分子CSL共同组成NOTCH信号通路。NOTCH受体为单链跨膜蛋白，其分子由胞外区、跨膜区和胞内区(NICD)组成，具有高度保守性。目前人类中已发现4种NOTCH受体基因(NOTCH1，NOTCH 2，NOTCH 3，NOTCH 4)，各型的主要差异在EGF样重复的数目和胞内区的长度。NOTCH配体亦为细胞表面表达的单链跨膜蛋白，已发现人的NOTCH配体有Jagged 1，Jagged 2，Delta 1，Delta 3，Delta 4。

人NOTCH1信号是由蛋白受体与配体相互作用导致，NOTCH1蛋白受体经3次水解，释放出胞内段蛋白(NICD)，NOTCH1 NICD转入细胞核内，通过与CBF1/Su(H)/LAG1(CSL)相互作用形成复合物，使后者由转录抑制因子转化为转录激活因子，调节细胞的增殖、凋亡和分化并影响许多器官的发育和功能，其信号通路的异常改变与肿瘤、血液系统、心血管系统等多种疾病相关。研究表明：在大多数恶性肿瘤中，NOTCH1信号主要为促癌作用，活化的NOTCH1蛋白可使细胞增殖并恶性转化为肿瘤，如在宫颈癌、胃癌、肾癌及多种血液系统肿瘤中均发现NOTCH1的异常表达，但是最近发现NOTCH1在不同肿瘤和肿瘤的不同阶段中，其发挥的作用也不尽相同。例如在头颈部鳞状细胞癌中NOTCH1信号具有抑癌作用；在宫颈癌的早期，NOTCH1信号起促癌作用，晚期则起抑癌作用。此外，由于NOTCH1 NICD蛋白是Wnt、TGFβ/BMP和Hedgehog等多条通路的重要交汇点，其异常可能通过对其他信号通路的影响参与肿瘤的发生、发展、转归和预后。

磷酸化等翻译后修饰在NOTCH信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键调节作用。已有研究表明：NOTCH1 NICD蛋白的磷酸化修饰是NOTCH信号通路重要的调控机制，它不仅可以促进信号的活化，更为重要的是它可以通过启动泛素化降解NOTCH1 NICD从而终止信号，是NOTCH1信号通路精准调控的关键。磷酸化修饰的异常，造成NOTCH1 NICD半衰期的延长将导致白血病和其它实体癌症的发生。人NOTCH1氨基酸序列中Tyr2145位点位于NOTCH1 NICD中，是NOTCH1蛋白磷酸化修饰的一个关键位点，在NOTCH1信号的活化或降解失活的动态调控中发挥着重要的作用。

抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上生命科学发展的热点，在疾病的机制研究、诊断和治疗靶点的发现中发挥重要的作用。

技术实现要素：

本发明在于解决在调控NOTCH1信号通路中发挥重要作用的NICD蛋白的磷酸化修饰，为此，本发明的目的之一是提供一种特异性针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗原肽。

本发明的另一目的是提供一种特异性针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体。

本发明的另一目的是提供上述抗原肽和抗体的应用。

本发明的另一目的是提供上述抗体的制备方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽，其活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的Tyr氨基酸被磷酸化。

在其中一个实施例中，上述人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽的C末端连接有一个半胱氨酸。

一种人NOTCH1 NICD蛋白的抗体，其是通过上述人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽免疫动物制备得到的。

上述的人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽和/或抗体在制备用于肿瘤等疾病的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂中的应用。

一种用于肿瘤的诊断、治疗、预后判定的药物或试剂，其包括有上述的人NOTCH1 NICD蛋白的抗原肽和/或抗体。

所述肿瘤为与人NOTCH1信号通路相关的肿瘤，例如宫颈癌、胃癌、口腔癌、肾癌及多种血液系统肿瘤。

上述人NOTCH1 NICD蛋白的抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)得到活性氨基酸为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Tyr上添加有磷酸化基团且C末端连接有一个半胱氨酸；

(2)利用步骤(1)合成的抗原肽与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，免疫动物并收集抗血清；

(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，获得人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化的抗体。

上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次采用抗原直接注射。

上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对上述抗原肽的效价，利用亲和纯化-亲和分离技术(先亲和纯化，然后再亲和分离)对抗血清进行纯化。可以以Dot blot实验确定纯化后的抗体是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1 NICD蛋白。

上述利用亲和纯化-亲和分离技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：首先采用磷酸化合成肽偶联蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和纯化，获取针对磷酸化抗原表位的所有抗体并通过改变pH和离子浓度除去低亲和力的低序列复杂性表位抗体；接着使用非磷酸化合成肽偶联载体蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和分离，除去磷酸化抗体中非特异性结合的非磷酸化表位抗体。

本发明筛选并制备获得的高特异性、高亲和力的人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体，可用于Western blot实验检测正常细胞、肿瘤细胞及治疗前后肿瘤细胞的表达差异，可以采用免疫共沉淀结合质谱技术(IP-MS)、GST-pull down等方法研究磷酸化修饰的NOTCH1 NICD的蛋白间相互作用；可以采用染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)研究磷酸化修饰的NOTCH1 NICD相互作用的DNA调控元件，从而为阐述NOTCH蛋白的磷酸化修饰在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用及其机制提供独特的工具；此外，还可以通过免疫组化(IHC)和ELISA等方法检测人NOTCH1 NICD蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

本发明的优点及有益效果：(1)通过本发明所述方法制备获得高特异性、高亲和力的人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体；(2)在长期的实验中，本发明的发明人无意中发现，在本发明所述的纯化该Tyr2145磷酸化抗体中采用的亲和纯化-亲和分离方法比现有技术中的抗体纯化采用的亲和分离-亲和纯化具有制备周期短、抗体的效价高、回收率好等优势；(3)本发明提供的磷酸化抗体在实际应用中可以研究人NOTCH1 NICD蛋白特定位点磷酸化修饰与特定生物学事件如细胞应激、基因组和表观遗传组改变、细胞周期异常等的相关性，研究NOTCH信号在细胞生理和病理情况下的作用机制；(4)本发明提供的磷酸化抗体有助于揭示NOTCH1 NICD蛋白的磷酸化修饰在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用机制，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1 本发明采用的制备人NOTCH1 NICD磷酸化抗体技术路线图。

图2 利用生物信息学筛选获得人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145磷酸化位点。

图3 NOTCH1 NICD抗原性分析结果。

图4 NOTCH1 NICD疏水性分析结果。

图5 pY2145合成肽的HPLC和质谱测定结果。

图6 Y2145合成肽的HPLC和质谱的测定结果。

图7 合成肽偶联蛋白的SDS-PAGE鉴定结果：其中，M1、M2：Protein Marker(Broad)；1：Y2145-BSA；2：pY2145-BSA；3：pT2145-KLH；4：pY2145-KLH。

图8 免疫用家兔的筛选(Western blot)：其中，1：pY2145-BSA(5μg)；2：Y2145-BSA(5μg)；3：BSA标准蛋白(5μg)；一抗：阴性血清1:5000稀释液。

图9 Dolt blot鉴定洗脱液中抗体活性的结果，其中，1：洗脱液1-5管；2：洗脱液6-10管；3：洗脱液11-15管。

图10 Dot blot检测纯化后抗体的磷酸肽特异性，其中，1：BSA蛋白的浓度梯度稀释；2：Y2145-BSA合成肽的浓度梯度稀释；3：pY2145-BSA合成肽的浓度梯度稀释；a图：一抗为阴性血清1:5000稀释液；b图：一抗为纯化前抗血清1:5000稀释液；c图：纯化后抗体1:1000稀释液。

图11 本发明制备的磷酸化抗体用于检测正常胃粘膜上皮细胞和胃癌细胞中人NOTCH NICD蛋白的Western blot结果，其中，1：AGS细胞RIPA裂解物；2：MKN-45细胞RIPA裂解物；3：BGC823细胞RIPA裂解物；一抗为本发明制备的抗体1:1000稀释液；b图：一抗为β-actin抗体1:2000稀释液。

图12 是本发明制备的磷酸化抗体用于检测口腔癌组织及其癌旁组织的免疫组化结果，其中，a和b图为病人A16361的口腔癌旁组织和口腔癌组织免疫组化染色结果；c和d图为病人CRY的口腔癌旁组织和癌组织的免疫组化染色结果；一抗为本发明制备的抗体1:100稀释液；放大倍数均为200倍。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

参见图1，本发明实施例提供的针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体的制备方法与应用，总体上包括以下步骤：

步骤一：抗原表位设计和筛选：经过长期的实验筛选，选择了人NOTCH1蛋白中胞内段蛋白(NICD)具有能诱导动物产生高抗原性、高亲水性抗体的能力的SEQ ID NO：1多肽，并对其中的的2145位点酪氨酸(Tyr)进行磷酸化修饰。

步骤二：合成肽和偶联蛋白制备：采用多肽合成技术合成如SEQ ID NO：1所示的抗原肽，在氨基酸Tyr2145上添加磷酸化基团，且C末端连接有一个半胱氨酸(得到所述抗原肽)，经HPLC的纯化和质谱(MS)鉴定后分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联，前者作为免疫原制备磷酸化抗体，后者用作亲和纯化的填料进行亲和纯化；与之相对应，采用多肽合成技术合成如SEQ ID NO：1所示的合成肽，氨基酸Tyr2145上不添加磷酸化基团合成非磷酸化修饰肽，C末端连接有一个半胱氨酸，经HPLC的纯化和质谱鉴定后与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离的填料。

步骤三：免疫动物及制备抗血清。将步骤二中Tyr2145位点磷酸化合成肽-KLH偶联形成的全抗原与佐剂联合免疫SPF级新西兰大白兔，采用皮下(s.c)注射、肌肉(i.m)注射、皮内(i.d)注射及家兔爪垫部位注射等多部位多点注射抗原乳状液。免疫次数包括1次引发注射、3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；

步骤四：纯化并鉴定人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145特异性磷酸化抗体。首先用磷酸化抗原肽-牛血清白蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和纯化，获取针对磷酸化抗原表位的所有抗体并通过改变离子浓度和pH值除去低亲和力的低序列复杂性表位抗体；接着使用非磷酸化合成肽-牛血清白蛋白与琼脂糖进行偶联作为层析填料进行亲和分离，除去磷酸化抗体中非特异性结合的非磷酸化表位抗体。获得人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化的抗体。

以Dot blot实验确定抗血清特异性识别磷酸化合成肽，ELISA检测纯化后抗体效价，最终获得纯化的抗pY2145磷酸化抗体。纯化后的抗体经离心浓缩后以0.1％(wt/vol)BSA/PBST和40％(vol/vol)甘油的混合液保存。

以下结合具体实施例参照附图，对本发明提供的针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体的制备技术路线，进一步进行阐述和说明。

实施例1抗原表位设计和筛选

本发明的发明人筛选到具有能诱导动物产生针对人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化的高特异性、高亲水性抗体的抗原肽，该段抗原表位包含9个氨基酸(aa)，序列如SEQ ID NO：1所示：N-Ser Pro Asn Gly p(Tyr)Leu Gly Ser Leu–C；最后利用NCBI网站的blastp对该合成肽进行同源性分析，结果表明该抗原表位肽序列与家兔无同源性，并计算该人NOTCH1氨基酸序列的抗原性、亲水性(图3、图4)。

实施例2合成肽和偶联蛋白制备

根据实施例1抗原表位肽的设计，在Tyr2145位点上添加一个磷酸化基团并在序列的C端添加一个半胱氨酸获得磷酸化合成肽(SEQ ID NO：2)，经HPLC的纯化后获得纯度达96％的合成肽，该合成肽经质谱鉴定表明于设计相符(图5)，然后通过C端的半胱氨酸与血蓝蛋白(KLH)偶联获得全抗原(pY2145-KLH,Tyr简称Y)将用于动物免疫；同时，该合成肽通过C端的半胱氨酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联后用于磷酸化抗体分离(pY2145-BSA)。同样，采用多肽合成技术合成如SEQ ID NO：1所示的合成肽，氨基酸Tyr2145上不添加磷酸化基团合成非磷酸化修饰肽，在SEQ ID NO：1的C端连接有半胱氨酸，经HPLC的纯化后获得纯度达96％的合成肽，该合成肽经质谱鉴定表明于设计相符(图6)，然后通过C端的半胱氨酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联用于磷酸化抗体亲和分离(Y2145-BSA)。

实施例3免疫动物和抗血清的制备

3.1合成肽偶联蛋白的溶解和鉴定：

通过BCA蛋白浓度检测试剂盒测定用灭菌1×PBS溶解的合成肽偶联蛋白的浓度，Y2145-BSA、pY2145-BSA的浓度分别为1.1mg/ml、0.845mg/ml(标准曲线的相关系数R2＝0.991)，pY2145-KLH的浓度为0.571mg/ml(R2＝0.997)，经SDS-PAGE鉴定结果如图7：pY2145-BSA分子量略高于Y2145-BSA，pY2145-KLH在200KD以上有明显的目的条带。

3.2免疫用动物的筛选：在免疫前1周从用于免疫的新西兰大白兔(2～3kg，雌性，健壮，南方医院实验动物中心提供)的耳静脉采取3mL血液，分离血清，标记为阴性对照血清，分装并贮存于-80℃待测。将溶解的合成肽偶联蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后200mA恒流90min转至PVDF膜，用含5％的脱脂奶粉的TBST(pH7.5，0.08％Tween-20)室温封闭1h，加入采集的阴性对照血清做为一抗(1:5000)室温孵育30min后4℃过夜，用TBST洗去未结合的一抗，再加入羊抗兔IgG－HRP二抗，室温孵育1h；TBST洗去残余二抗后用EZ-ECL发光试剂检测结果。

结果表明(见图8)：pY2145-BSA、Y2145-BSA和BSA泳道均未出现目的条带，表明本发明免疫用新西兰大白兔体内未出现针对这三种抗原的抗体，为理想的免疫用动物。

3.3动物免疫：

3.3.1首次免疫原制备：将已溶解的pY2145-KLH溶液与等量弗氏完全佐剂(CFA)混合完全乳化后制备获得首次免疫原。

3.3.2首次免疫：采用皮下(s.c)注射、肌肉(i.m)注射、皮内(i.d)注射和家兔爪垫部位注射等多部位多点注射首次免疫原。首次免疫的抗原总量约为0.62mg。

3.3.3后续免疫：首次免疫20天后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，抗原总量均约为0.9mg；12天后进行加第二次强免疫，抗原总量均约为0.9mg；12天后进行加第三次强免疫，抗原总量均约为0.9mg；10天后，从耳静脉采血5mL，分离血清分装并贮存于-20℃待测。

3.3.4免疫效果评价：将待测的抗血清按比例1:1000、1:5000和1:10000稀释，通过ELISA检测抗体效价。结果表明：待测样品的OD值均在0.3以上，各稀释度的待测抗血清的P/N值分别4.0、3.8、3.9，其血清抗体效价>1:10000,达到预期要求。

3.3.5末次加强免疫：以pY2145-KLH抗原溶液直接肌肉注射家兔进行最后一次加强免疫，抗原量约0.9mg。3天后，家兔进行腹主动脉大采血，大量收集全血。将收集的全血室温静置过夜，4000g离心10min，取上清，分装1ml/管，标记为免疫后抗血清，贮存于-80℃。

3.3.6抗血清效价测定：以抗原包被液(pH9.0)稀释的1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL pY2145-BSA，以1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:16000稀释的抗血清为一抗，1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG稀释液为二抗进行ELISA。结果表明：各稀释度的免疫后抗血清的OD值均在0.5以上(见1表1)，免疫后抗血清与阴性血清之比(P/N值)大于2.1，免疫后抗血清抗体效价为1:160000以上。

表1免疫后抗血清的OD值

实施例4人NOTCH1蛋白Tyr2145特异性磷酸化抗体的纯化和鉴定

4.1磷酸化合成肽层析柱与非磷酸化合成肽层析柱的制备。

4.1.1用无菌1×PBS分别溶解Y2145-BSA和pY2145-BSA，BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度分别为1.13mg/ml、0.867mg/ml(R2＝0.9922)。分别取Y2145-BSA和pY2145-BSA合成肽溶解液，用偶联缓冲液调pH值至9.0，4℃保存溶液备用。

4.1.2称0.3g CNBr-琼脂糖加入到15mL离心管中，用于1mL柱床容量的层析柱，具体用量比例见下表2。向CNBr-琼脂糖粉末加入7mL 10mM HCl，室温下使用反转摇匀仪混合60min。

表2合成肽-BSA、CNBr活化的琼脂糖用量比例表

4.1.3向Bio-Rad Econo-Pac柱加满10mM HCl，让其自然流出，重复3次。保持活塞关闭，将步骤4.1.2溶胀的CNBr-琼脂糖树脂加入到柱中，用10mM HCl冲洗离心管并将冲洗液加入到柱中并让其自然流出。加满10mM HCl并让其自然流出，重复3次。向层析柱加入10mL偶联缓冲液并让其自然流出(激活树脂)。在最后一滴缓冲液流出前，用1.5mL EP管收集约500μl流出液，标记为保留液①，通过SDS-PAGE电泳检测合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率。

4.1.4向层析柱加入步骤4.1.1中pH为9.0的合成肽-BSA混合液。向层析柱中加满偶联缓冲液，密封后室温下轻轻反转摇匀层析柱的内容物1h，4℃过夜继续混匀柱内容物。

4.1.5打开底部活塞释放合成肽-BSA混合液，用1.5mL EP管标收集流出液500μl，标记为保留液②，通过SDS-PAGE电泳检测合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率。

4.1.6合成肽-BSA与琼脂糖的偶联效率检测完毕后，向层析柱中加满碱性洗脱缓冲液，让其自然流出并弃去。向层析柱中加满酸性冲洗缓冲液，让其自然流出并弃去，按上述操作重复5次。

4.1.7向层析柱中加满封闭缓冲液，让其自然流出并弃去，重复5次。用10mL封闭缓冲液加入层析柱用于保存，4℃下可保存3个月。

4.1.8通过上述步骤制备获得pY2145-BSA磷酸化层析柱和Y2145-BSA非磷酸化层析柱，前者用于磷酸化抗体的亲和纯化；后者用于磷酸化抗体的亲和分离。

4.2磷酸化抗体的纯化

4.2.1.样品制备：冰上解冻1mL免疫后分离的抗血清，10000g、4℃离心5min，去除沉淀；使用冷藏的100mM NaCl以1：10稀释血清，冰上操作。

4.2.2亲和纯化

4.2.2.1取出通过4.1已制备磷酸肽层析柱，打开层析柱的盖子和活塞，让储存溶液流出。向层析柱中加满100mM NaCl，让其自然流出。关闭活塞，加入步骤4.2.1制备的样品，加入100mM NaCl确保层析柱顶部无多余的空位，密封整个层析柱，4℃过夜温和反转摇匀层析柱。次日，层析柱在室温下再摇匀1h后收集流出液，标记为保留液③，4℃下保存。

4.2.2.2将层析柱加入10mM Tris(pH7.5)和0.5M NaCl的混合液，自然流出，重复3次。向层析柱中加入碱性冲洗缓冲液(pH9.5)，让其自然流出。向层析柱中加入酸性冲洗缓冲液(pH4.0)，让其自然流出。按碱性冲洗缓冲液-酸性冲洗缓冲液顺序重复洗涤层析柱3次。

4.2.2.3取15个1.5mL的EP管，分别加入100μl 1M Tris碱，标上序号。向层析柱中加入1mL的甘氨酸缓冲液洗脱(pH2.2)，使用EP管收集洗脱液，翻转摇匀中和样本并置于冰上。重复14次，共收集15管洗脱液。

4.2.2.4从每个EP管中取1μl用于pH试纸检测是否中和，若不显中性则用1M Tris碱中和洗脱液至中性，分别标记为1～15号洗脱液。通过免疫斑点印迹(Dolt blot)鉴定洗脱液中抗体的活性，将有活性的抗体合并后通过Sepharose G25脱盐。

4.3免疫斑点印迹(Dolt blot)鉴定洗脱液中抗体的活性：从15管洗脱液中各取1μl按顺序点在一条硝酸纤维膜纸上，以1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，结果如图9所示：3-5号洗脱液有特异性抗体阳性斑点，收集3-6管洗脱液并标记为磷酸化抗体阳性混合液。

4.4亲和分离：取出通过4.1已制备的非磷酸肽层析柱，向层析柱中加入100mM NaCl，让其自然流出。关闭阀门，加入4.2.2.4制备的样品后加入100mM NaCl，确保层析柱顶部无多余的空位，密封整个层析柱，4℃下过夜温和反转摇匀。次日收集层析柱的流出液标记为纯化后抗体，4℃保存。

4.5采用Dolt blot检测纯化后抗体的磷酸化特异性：将Y2145-BSA(1.13mg/ml)配置成56ng/μl，然后进行梯度稀释即28.3ng/μl、14.13ng/μl、7.06ng/μl、3.5306ng/μl和1.77ng/μl，同样将pY2145-BSA(0.867mg/ml)配置成43.35ng/μl，然后进行梯度稀释即：21.68ng/μl、10.84ng/μl、5.42ng/μl、2.71ng/μl、1.35ng/μl；配制以下梯度的BSA蛋白：1mg/ml、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl和0.1ng/μl。按顺序各取1μl上述3种蛋白的5个浓度点样在同一条硝酸纤维膜上，共点样三条。三条硝酸纤维膜依次分别以1:5000稀释的阴性血清、1:5000稀释的免疫后抗血清、1:500稀释的磷酸化抗体混合液为一抗，二抗均为按1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG的稀释液进行Dot blot实验，结果如图10：a图一抗为免疫前阴性家兔的血清稀释液，图中BSA、Y2145-BSA和pY2145-BSA均无出现阳性斑点；b图一抗为pY2145-KLH免疫家兔后采集的抗血清，图中BSA各浓度梯度均无出现特异性阳性斑点，Y2145-BSA和pY2145-BSA合成肽分别在7.06ng和5.42ng以上出现特异性阳性斑点；c图一抗为pY2145-KLH免疫家兔后采集的抗血清经过亲和纯化-亲和分离制备的抗体，图中BSA和Y2145-BSA各浓度梯度点均没有出现特异性阳性斑点，而pY2145-BSA合成肽在5.42ng水平以上出现特异性阳性斑点，表明本发明已获得高特异性的人NOTCH1蛋白Tyr2145特异性磷酸化抗体。

4.6纯化后磷酸化抗体的效价测定：以1ug/孔分别包被Y2145-BSA和pY2145-BSA两种抗原，不同比例稀释的阴性血清、纯化前血清以及经亲和纯化-亲和分离后抗体作为一抗孵育，HRP标记羊抗兔IgG稀释液(1:5000)作为二抗进行ELISA实验，结果如表3，稀释度为1:8000时，针对磷酸化抗原的OD450值大于0.4且纯化后抗体与阴性血清之比的P/N值大于2.1，针对非磷酸化抗原的OD450值均低于0.3，则纯化后抗体效价>1:8000。而采用现有技术中亲和分离-亲和纯化方法(与本发明的方法步骤相同，顺序不同)制备的抗体的效价为1:2000(见表4)。

表3纯化后抗体的OD值

表4采用现有技术中亲和分离-亲和纯化方法制备的纯化后抗体的OD值

4.7抗体的超滤浓缩及缓冲液的更换：将所有纯化抗体利用Amicon Ultra-410K离心过滤器进行超滤浓缩，并将纯化抗体的溶剂替换为PBS，用BCA蛋白定量测定法测得浓缩后本发明制备的纯化抗体的浓度为0.3776mg/ml，体积为1.05毫升；而采用现有技术中亲和分离-亲和纯化方法制备的纯化抗体浓度为0.17096mg/ml，体积为0.85毫升。

4.8两种方法制备的磷酸化抗体效价和回收率比较

通过比较4.6和4.7结果，本发明提供的磷酸化抗体制备的方法(命名为方法1)在制备周期、抗体效价和回收率等方面优于现有技术中亲和分离-亲和纯化方法(命名为方法2)

表5：两种方法制备的磷酸化抗体效价和回收率比较

4.9抗体的保存：向浓缩后纯化抗体加入终浓度为1％(wt/vol)BSA/PBST和40％(vol/vol)甘油的混合液，分装为100μl/管,-80℃长期保存。

实施例5人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体在肿瘤检测中的应用

5.1本发明制备获得高特异性、高亲和力的人NOTCH1 NICD蛋白Tyr2145位点磷酸化抗体，可以用于细胞和组织中人磷酸化NOTCH1 NICD的表达检测。本实施例采用本发明制备的磷酸化抗体检测正常胃粘膜上皮细胞和胃癌细胞中磷酸化人NOTCH1 NICD蛋白的表达。

5.1.1细胞培养和总蛋白提取：正常人胃粘膜细胞GES1和人胃癌细胞MKN45、BGC823在1640完全培养基(10％FBS)进行常规培养，每2～3天传代1次。细胞状态良好时以2.5×10⁶个/ml的细胞浓度接种到六孔板，待细胞生长到80～90％丰度时在1640培养基上培养24h后，消化各组细胞并用PBS清洗3遍去除上清收集细胞，按50～100万个细胞/100～200μL加入RIPA蛋白裂解液。冰上裂解细胞20min后离心(12000rpm,20min)取上清测定蛋白浓度后，按5:1比例加入蛋白上样缓冲液5×loading buffer，沸水浴7min后，-20℃长期保存。

5.1.2Western blot：使用10％浓度SDS-PAGE分离胶电泳，蛋白上样量约为每孔16μg，电泳结束后200mA恒流90min转至PVDF膜，用含5％的脱脂奶粉的TBST(pH7.5，0.08％Tween-20)室温封闭1h，加入本发明制备的抗体做为一抗(1:1000)室温孵育30min后4℃过夜，用TBST洗去未结合的一抗，再加入羊抗兔IgG－HRP二抗，室温孵育1h；TBST洗去残余二抗后用EZ-ECL发光试剂检测结果。

5.1.3磷酸化人NOTCH1 NICD在三种细胞上的表达结果：采用本发明制备的特异性抗体作为一抗完成的Western blot结果显示：人胃癌细胞MKN45(泳道2)、BGC823(泳道3)大约在110kD左右均出现特异性条带，而正常人胃粘膜细胞GES1(泳道1)未见任何阳性条带(见图11)。由此可见，本发明制备的抗体可以检测正常胃粘膜细胞和胃癌细胞中磷酸化人NOTCH1 NICD蛋白表达差异。

5.2本发明制备获得的磷酸化抗体，可以用于检测组织中人磷酸化NOTCH1 NICD蛋白的定位和表达差异检测。本实施例采用本发明制备的磷酸化抗体通过免疫组化试验(IHC)检测口腔癌组织及其配对的癌旁组织中的磷酸化人NOTCH1 NICD蛋白定位和表达差异。

5.2.1石蜡切片脱蜡至水：依次将2组口腔癌病人(样本编号A16361和样本编号CRY)癌组织和相应的癌旁组织的石蜡切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

5.2.2抗原修复和封闭：将上述石蜡组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1:9)，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用3％BSA的封闭液。

5.2.3抗体加入和显色：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按1:100比例加入本发明制备的抗体做为一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加山羊抗兔的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

5.2.4复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

5.2.5脱水封片和镜检：将切片依次放入75％酒精6min-85％酒精6min--无水乙醇Ⅰ6min-无水乙醇Ⅱ6min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

5.2.6免疫组化结果：结果如图12所示，样本编号为A16361口腔癌病人的癌旁组织(图12-a)和癌组织(图12-b)均未发现磷酸化人NOTCH1 NICD蛋白的表达；但是样本编号为CRY口腔癌病人的癌旁组织(图12-c)和癌组织(图12-d)中磷酸化人NOTCH1 N1ICD蛋白的表达存在显著差异，癌组织呈明显的核染色阳性，表明肿瘤细胞均处于有丝分裂期，而配对的癌旁组织却没有检测到任何阳性染色。由此可见，本发明制备的抗体可以检测不同病人的肿瘤组织中人NOTCH1 N1ICD蛋白的表达差异和细胞定位变化，同时提示这两类病人愈后也可能存在差异。

5.3本发明提供磷酸化抗体在实际应用中能够应用于ELISA、GST-pull down等方法检测人NOTCH1 NICD蛋白磷酸化修饰状况，从而探讨人NOTCH1 NICD蛋白磷酸化修饰在肿瘤等相关疾病中作用和机制。

5.4人NOTCH1 NICD蛋白的磷酸化修饰是进行泛素化降解并对NOTCH1信号通路精准调控的关键。磷酸化修饰的异常，造成NOTCH1 NICD半衰期的延长将导致可使细胞持续增殖停止分化，因此磷酸化抗体在实际应用中便于研究人NOTCH1 NICD蛋白Tyr21451位点磷酸化修饰对于特定生物学事件如细胞增殖、细胞分化的影响，从而探讨其在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用。

5.5本发明是针对人NOTCH1 NICD蛋白特定Tyr2145位点制备的磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化的激酶作用，探讨人NOTCH1 NICD蛋白多种生物学功能在NOTCH1细胞信号通路及蛋白/核酸相互作用网络和其磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，从而发现临床肿瘤疾病的诊断和治疗的潜在作用靶点。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方医科大学

珠海南医大生物医药公共服务平台有限公司

<120> 一种新的人NOTCH1 NICD蛋白抗原、抗体及其制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> Protein

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser Leu

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> Protein

<213> 人工序列

<400> 2

Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Cys

1 5 10