一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用与流程

文档序号:12413046阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱,其特征在于:该指纹图谱由8对SSR标记组成,具体序列如下:

1140正向引物:CCCAAAAAGGATTTCAGCAA;

反向引物:AACCGGAGTGGTGTAAGTGC;

76正向引物:AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC;

反向引物:ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG;

43正向引物:CTCTTTGCACCCTCAACCTC;

反向引物:CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC;

16正向引物:ATAGGATGATTGAACGAGCAG;

反向引物:ACCGTAAGGTGGGAAGAAA;

19正向引物:ATGCCGTTCCAAAGATAC;

反向引物:TCTGTAACGCTTGTGGACTA;

148-1正向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;

反向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;

002正向引物:GGGCGAAACAATTTCAGGTA;

反向引物:ATGCCATCGTAAGGAACTCG;

192-1正向引物:ACGCGTATCCTCCCCTAAGT;

反向引物:AAGCGATATGGATTTGACGC;

所述菌种的带型编号组合为:(1)(1+2+4)(3+7)(1+4)(2+3+4)(1+4)(1)(2)。

2.一种如权利要求1所述的香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,包括:

(1)将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中,23-25℃下避光摇瓶培养,3-4d后收集菌丝;

(2)用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA,检测总基因组DNA浓度和纯度,调整样品DNA的浓度一致;

(3)对上述提取的DNA进行8对SSR标记的PCR扩增;

(4)将上述PCR扩增得到的产物与加样缓冲液混匀,变性,点样于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染,显色,拍照,分析结果。

3.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(2)中的CTAB法提取菌丝的基因组DNA具体工艺包括:

(1)将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末,加入65℃预热的2×CTAB抽提液,于65℃保温45-60min,轻摇混匀;

(2)12000rpm、4℃离心20min,取上清液;

(3)在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入离心管中;

(4)在上述离心管中加入体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液,混匀10min,12000rpm、4℃离心10min,取上清液移入另一离心管中;

(5)在上述离心管中加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇,摇动5min,8000rpm、4℃离心10min,去上清;

(6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次,每次8000rpm,室温离心5min;

(7)加入预冷的95vol%乙醇,上下颠倒,8000rpm室温离心10min,弃乙醇,真空抽干或自然晾干;

(8)加入100μL 1×TE缓冲液,使沉淀溶解;

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;

(10)将得到的DNA提取物于-20℃贮藏备用。

4.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(3)中的PCR扩增体系为:总体积20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl2 2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL,浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;

PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30个循环;72℃5min。

5.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的加样缓冲液用量为2μL;PCR扩增得到的产物点样量为3μL。

6.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的变性的具体工艺为于95℃变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min。

7.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的电泳的工艺参数为:变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%,电泳缓冲液为1×TBE,电压1000v,电流200mA,功率200W,电泳45min。

8.根据权利要求2所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述步骤(4)中的银染的具体工艺为:电泳完成后卸下并拆开玻璃板,胶板卸下后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分后,在银染液中避光银染8min,银染后,用去离子水水洗5-8s,沥干水分,放入显影液中,至显影后取出水洗后即可读数。

9.根据权利要求8所述的一种香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法,其特征在于:所述银染液的组成为1.5g AgNO3和1500ml H2O;显影液的组成为16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。

10.一种如权利要求1所述的香菇森源10号菌种的SSR标记指纹图谱的应用,其特征在于:应用于鉴定香菇森源10号菌种相对于其他香菇栽培品种的特异性。

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