本发明属于分子体外诊断领域，具体涉及特别适用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒。
背景技术：
游离DNA(Cell Free nucleic acids，cfDNA)是指存在血浆或血清、脑脊液等细胞外游离状态的核酸片段，约160～180bp，是细胞DNA在生理或病理条件下的产物。
研究表明肿瘤病人外周血中存在cfDNA显著高于健康人群，并且这些cfDNA携带有肿瘤患者的基因的变异信息(包括肿瘤基因的变异突变等)，称之为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。其主要来源于坏死的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，凋亡的肿瘤细胞及来自肿瘤细胞的外分泌小体。肿瘤患者的ctDNA中，常见的变异类型有SNV(single nucleotide variant，单核苷酸变异)、CNV(Copy Number Variation，拷贝数变异)及FUSION(融合)等。
因ctDNA占cfDNA的含量极低，需要先通过DNA富集的方法将目标ctDNA富集起来，然后通过富集的ctDNA进行测序，得到其携带信息，并根据测序得到的携带信息来解读个体患病情况。常用的DNA的富集方法是基于PCR平台的多重PCR的方法，该方法适用于捕获一些很小的区域，或者一些已知位点及其周围较短距离(热点上下游150bp以内)区域，该方法具有快速有效、灵敏度高等特点。目前，很多公司推出了多重PCR富集ctDNA相关基因区域的试剂盒(如Life公司的Oncomine cfDNA Assays等)，但这些试剂盒只能检测SNV，对于CNV及FUSION，该类产品均不能准确检出，因此，多重PCR方法的适用性受到较大的限制。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒，使用该试剂盒进行基因检测，并通过高通量测序平台进行测序，能够同时稳定的检出基因SNV、CNV以及FUSION。
本发明的发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：在血浆ctDNA基因变异的检测方法中，通过使用基因捕获的探针，即针对SNV区域设计的探针、针对CNV区域设计的探针、针对FUSION区域设计的探针，公共引物如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物，以及标签引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列引物。可以同时稳定的检出基因SNV、CNV以及FUSION。
即本发明包括：
1.一种用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒，其包括用于基因捕获的探针，所述基因捕获的探针包括：针对SNV区域设计的探针、针对CNV区域设计的探针、针对FUSION区域设计的探针，公共引物如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物，以及标签引物如SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列引物。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述基因捕获的探针是生物素化的。
3.根据项1或2中所述的试剂盒，其中，所述基因捕获试剂盒还包括链霉亲和素标记的磁珠。
4.根据项1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液。
5.根据项1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液。
6.根据项1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于在肿瘤相关基因的基因捕获测序中进行基因捕获；优选地，所述基因捕获测序用于检测肿瘤相关基因的SNV、CNV、以及FUSION。
7.一种血浆ctDNA中基因变异的检测方法，其中，使用项1～6中任一项所述试剂盒进行基因检测。
8.一种用于检测血浆ctDNA中基因变异的二代测序DNA文库的构建方法，其中，包括对构建的文库进行基因捕获的步骤，其中所述基因捕获使用项1～7中任一项所述的试剂盒进行。
9.一种捕获探针，其中，所述基因捕获的探针包括针对SNV区域设计的探针、针对CNV区域设计的探针、和/或针对FUSION区域设计的探针。
有益效果：相对于现有方法，本发明的试剂盒能够同时检测更多的区域，同时检测出基因SNV、CNV及FUSION。
附图说明
图1为实施例1中样本1的CNV检测结果的示意图。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一方面，本发明提供一种用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒，其包括用于基因捕获的探针，所述基因捕获的探针包括：针对SNV区域设计的探针、针对CNV区域设计的探针、针对FUSION区域设计的探针，公共引物如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物(如下表)，以及标签引物如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO:5所示核苷酸序列引物(如下表)。
在这里所述肿瘤为胃癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌及卵巢癌等中一种或两种以上。
优选地，所述用于捕获探针是生物素化的。这样，可以使用链霉亲和素标记的固相载体将捕获了目标基因后的探针分离出来，所述固相载体优选为磁珠。优选地，本发明的基因捕获试剂盒还包括链霉亲和素标记的磁珠。
优选地，本发明的试剂盒还包括用于杂交捕获反应的离子环境的缓冲液。
优选地，本发明的试剂盒还包括用于洗脱屋里吸附或非特异性杂交的清洗液，它们用于提高基因捕获的特异性。
优选地，本发明的试剂盒还包括用于对于捕获到的目标基因进行扩增的引物。
优选地，本发明的试剂盒用于在血浆ctDNA中基因变异检测中进行基因捕获，更优选地，所述基因捕获测序用于检测血浆ctDNA中相关基因的SNV、CNV、以及FUSION。
本发明的试剂盒中的各个组分优选独立地包装于容器中，但在不影响使用的前提下，也可以将其中的一些组分合并包装。
在本说明书中，SNV(single nucleotide variant，单核苷酸变异)是一种体细胞单核苷酸突变；CNV(Copy Number Variation，拷贝数变异)是指由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少；FUSION(融合)是指两个或多个基因的编码区或非编码区断裂,重新首尾相连，置于同一套调控序列。
在本说明书中，肿瘤患者中的ctDNA的基因是指可辅助用作诊断肿瘤，指导肿瘤用药和/或预测肿瘤预后的基因。通常认为，罹患肿瘤的患者中，该基因具有特定的变异结果，例如，该基因的变异可以为SNV、CNV和FUSION中的一种或两种或三种。
在本说明书中，所述基因捕获的探针还可以包括针对目标疾病相关的其他基因的探针。与疾病相关的其他基因是指：在目标疾病中可能发生各种类型突变的基因，其可用作诊断目标疾病、指导目标疾病用药和/或预测预后的基因，但在罹患目标疾病患者的细胞的基因组中，该基因的特定的结构变异不常见或不具备临床意义。
本发明的基因变异的试剂盒可用于检测血浆ctDNA中基因变异的二代测序DNA文库的构建(本发明的建库方法)。因此，在另一方面，本发明提供一种血浆ctDNA中基因变异的检测方法，包括对构建的文库进行基因捕获的步骤，其中，基因捕获使用本发明的试剂盒进行。具体包括步骤如下：
步骤A：提取外周血中游离DNA，获得cfDNA；
步骤B：将cfDNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤C：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤D：将3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头的DNA片段；
步骤E：将加接头的DNA片段进行PCR，得到文库；
步骤F：利用捕获探针进行杂交，得到杂交产物；
步骤G：将杂交产物进行PCR扩增，得到杂交后的PCR产物；
步骤H：将杂交后的PCR产物进行测序。
文库的构建、基因捕获可以采用本领域技术人员已知的方法进行操作。
捕获的文库经质检后可以进行上机测序，从而得到测序数据。测序平台可以是例如Illumina HiSeq 2500、4000平台或者NextSeq 550AR平台(发明人确认)。
优选地，步骤B和步骤C，步骤C和步骤D，步骤D和步骤E，步骤E和步骤F，步骤F和步骤G，或步骤G和步骤H之间具有纯化步骤，其纯化步骤优选使用链霉亲和素标记的磁珠。
最后，本发明提供一种捕获探针，所述基因捕获的探针包括针对SNV区域设计的探针、针对CNV区域设计的探针、和/或针对FUSION区域设计的探针。优选地，所述基因捕获的探针是生物素化的。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1
1.1肿瘤基因检测液体芯片的设计及合成
根据文献报道及多个数据库(NCBI-PDB、PubMed、COSMIC、Clinvar、HGMD、GeneCards、zj-LOVD等)的信息，选择了用于血液病检测的目标基因，或特定目标区域进行探针设计。设计的探针与NCBI等数据库进行Blast比对，并且要确保探针的碱基个数在60～80nt之间、TM值适中、无回文序列等特殊结构、与序列同源性在50％～80％之间，通过这些数值以确保探针的特异性。
将设计出的探针序列合成为寡核苷酸探针，PCR验证后获得肿瘤相关基因捕获探针克隆库。
利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备含有利于靶标片段抓取的捕获探针文库，最终得到已知生物素标记数量和位置的捕获探针集即带有生物素标记的捕获探针库。
1.2DNA提取
取两种样本，分别命名样本1、样本2，使用MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit试剂盒(Life公司)提取血液cfDNA，得到提取的cfDNA，具体步骤参照Life公司提取试剂盒。
1.3末端修复(End Repair):
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰盒上化冻并震荡混匀。单个样本配制量参见表1，多样本可按比例配制Mix。
表1
(2)末端修复反应：向1.5mL的离心管中分装好25μL Mix，分装完成并确认加入无误后，加入DNA样本将1.5mL离心管置于Thermomixer中20℃温浴30分钟。反应结束后使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于32μL EB。
1.4末端加“A”
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰盒上化冻并震荡混匀。单个样本配制量参见表2，多样本可按比例配制Mix：
表2
(2)末端加“A”反应：向1.5mL的离心管中分装18μL Mix，确认无误后，加入32μL上一步纯化回收的DNA。加完后震荡混匀并离心，将1.5mL离心管置于Thermomixer中37℃温浴30分钟。使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于18μL EB中。
1.5接头的连接
(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，将其置于冰盒上化冻并震荡混匀。单个样本配制量参见表3，多样本可按比例配制Mix：
表3
(2)接头的连接反应：向1.5mL的离心管中分装27μL Mix，确认无误后，加入18μL上一步纯化回收的DNA。加完后震荡混匀并离心，将样本管置于Thermomixer中20℃温浴15分钟。使用1.8×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于30μL的EB中。
1.6PCR反应
(1)从-20℃保存的试剂盒中取出所需试剂，其中样本1使用的标签引物为标签引物In1所示的核苷酸序列引物，样本2使用的标签序列引物为标签引物In2所示的核苷酸序列引物。将其置于冰盒上化冻并震荡混匀。0.2mL的PCR管中配制PCR反应体系，多样本可按比例配制Mix：
表4
(2)设定PCR程序，PCR反应的程序设定如下：
反应结束及时将样品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出或关闭仪器。
(3)用0.9×核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，纯化后的文库溶于20μL的ddH2O中。贴好标签，小片段文库建库完成。对文库进行Qubit检测，记录各个文库浓度大小。将文库送检安捷伦2100，保存峰图结果。
公共引物序列(SEQ ID NO:1)：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
标签引物In1引物序列(SEQ ID NO:2)：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCATTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
标签引物In2引物序列(SEQ ID NO:3)：
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCAGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
1.7准备杂交文库
(1)本实验中，用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液、以及用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液、漂洗液均可从商业途径获得。
(2)准备杂交文库：将待杂交的DNA文库在冰上融化，取总质量1μg(在后续操作步骤中将此DNA文库称为样本文库)。
(3)制备Ann引物Pool：将样本文库Index对应的标签引物In1/In2(100μM)及公共引物(100μM)置于冰上融化，各取1000pmol混合(在后续操作步骤中将此混合物称为Ann引物pool)。
(4)杂交样本的制备：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Life technologies，1mg/mL)以及1μg样本文库。向混合物中加入Ann引物pool。用封口膜密封制备好的杂交样本EP管，调节真空干燥仪的温度至50～60℃，将盛有样本文库/COT DNA/Ann引物pool的EP管置于真空装置中直到完全干燥。
(5)杂交样本的溶液：向样本文库/COT DNA/Ann引物pool的干粉中加入：
7.5μL 2×杂交缓冲液
3μL杂交组分A
至此，EP管中含有以下组分：
表5
1.8准备杂交文库
(1)将加入杂交缓冲液的上述混合物涡旋震荡10秒，充分混匀后最大转速离心10秒。
(2)将上述混合物置于预先准备好的95℃加热模块上变性10分钟。取下变性后的混合物，室温下最大转数离心10秒。
(3)将上述混合物转移至含有4.5μL捕获芯片的0.2mL平盖PCR管中。涡旋震荡3秒，充分混匀后最大转数离心10秒。至此，杂交样品混合物中含有如下组分：
表6
(4)将杂交样品混合物置于47℃加热模块上16小时。加热模块的热盖温度需设定为57℃，杂交后产物需进行后续洗脱回收操作。
(5)将10×清洗液(Ⅰ，Ⅱ与Ⅲ)、10×漂洗液和2.5×磁珠清洗液配置成1×工作液。
表7
(6)将下列试剂在47℃下加热模块中预热：
400μL 1×漂洗液
100μL 1×清洗液I
1.9制备亲和吸附磁珠
(1)实验开始前，将链霉亲和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，以下简称磁珠)在室温下平衡30分钟后，将磁珠充分涡旋混匀15秒。
(2)向1.5mL离心管中分装100μL磁珠，1个1.5mL离心管最多可用来制备6个杂交捕获所需的磁珠。
(3)将盛有磁珠的离心管置于磁力架上，约5分钟后小心吸弃上清，将磁珠留在离心管中，加两倍于磁珠初始体积的1×磁珠清洗液。将离心管从磁力架上取下，涡旋混匀10秒。将盛有磁珠的离心管放回磁力架，吸附磁珠。待溶液澄清，吸弃上清。重复次步骤，共洗涤两次。
(4)洗涤完毕后吸弃磁珠清洗液，用磁珠初始体积的1×磁珠清洗液涡旋重悬磁珠。将重悬的100μL磁珠转入0.2mL的PCR管中。将PCR管置于磁力架上吸附磁珠，溶液澄清后吸弃上清。至此，捕获DNA所需的亲和吸附磁珠制备完毕，应立即进行下步结合反应。
1.10DNA与亲和吸附磁珠的结合及漂洗
(1)将杂交的样本文库转入盛有亲和吸附磁珠的0.2mL PCR管中，吸打10次，将二者混匀。
(2)将0.2mL PCR管置于47℃加热模块45分钟，每隔15分钟涡旋混匀一次，使DNA与磁珠结合。
(3)45分钟孵育后，向15μL捕获的DNA样本中加入47℃预热的1×清洗液I 100μL。涡旋混匀10秒。将0.2mL PCR管中的全部组分转入1.5mL离心管中。将1.5mL离心管置于磁力架上吸附磁珠，弃上清。
(4)将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入200μL预热47℃的1×漂洗液。吸打混匀10次(需迅速操作，防止试剂、样品温度低于47℃)。混匀后样本置于47℃加热模块上5分钟。重复此步骤，用47℃的1×漂洗液共洗涤两次。将1.5mL的离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。
(5)向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液I，涡旋混匀2分钟。将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液Ⅱ，涡旋混匀1分钟。将离心管置于磁力架 上，吸附磁珠，弃上清。向上述1.5mL离心管中加入200μL室温的1×清洗液Ⅲ，涡旋混匀30秒。将离心管置于磁力架上，吸附磁珠，弃上清。
(6)1.5mL离心管从磁力架上取下，加入45μL PCR水，溶解洗脱磁珠捕获样本。将磁珠—样本混合物放在-20℃保存。
1.11捕获DNA的PCR扩增
(1)按下表制备捕获后PCR mix，制备好后涡旋震荡混匀。余下的磁珠吸附DNA放在-20℃保存。富集引物F和富集引物R均购自英潍捷基公司。
(2)磁珠吸附DNA PCR的扩增程序设定如下：
(3)杂交捕获DNA PCR产物的回收纯化：用核酸纯化磁珠回收纯化反应体系中的DNA，磁珠使用量为0.9×磁珠，纯化后的文库溶于30μL的ddH2O中。贴好标签，杂交捕获文库建库完成。
1.12文库定量
对文库进行2100Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR检测，记录文库浓度。
1.13文库上机测序
构建的文库用NextSeq 550AR进行测序。
1.14数据处理及分析
实施例1通过对测序结果的分析，具体结果如下：
样本1中EGFR基因存在SNV：样本1的EGFR基因以NM_005228为参考序列时。编码区2573位碱基由T突变为G，导致EGFR所编码蛋白的第858位氨基酸由亮氨酸(L)突变为精氨酸(R)，突变频率发到1.01％。
样本1中ERBB2存在CNV：由图1可知，横轴为人参考基因组(hg19)坐标，中坐标为经过均一化处理的深度信号值，一般认为该信号值在0附近波动为正常。图1中标记ERBB2的区域为待检测区域：可以看到待检测区域的深度信号值已明显偏离了0附近的区域，故该结果被认为ERBB2阳性，该样本存在CNV。
样本2中存在EML4-ALK基因融合：EML4基因位于2号染色体第29446500位碱基发生断裂，ALK基因同样位于2号染色体上第42545894位碱基发生断裂，EML4与ALK基因重新连接，形成EML4-ALK融合基因。
对比例
使用样本1和样本2按照Life公司的Oncomine cfDNA Assays试剂盒进行杂交，具体参照试剂盒的说明书进行。
在对比例中，经数据分析发现，样本1中存在EGFR基因SNV，而且发生的位置及突变情况与实施例中结果一致，但通过对比例的方法未发现样本1中ERBB2存在CNV。在样本2中未发现中EML4基因和ALK基因存在融合。
为了进一步证明本发明结果的准确性，发明人使用一代测序方法对样本的SNV情况进行验证，并使用RT-PCR和qPCR联合的方法验证CNV，同时使用FISH的方法验证了FUSION，结果表明该样本存在SNV、CNV及FUSION情况，结果与本发明检测的结果一致，说明本发明的方法及试剂盒能够检测出样本的SNV、CNV以及FUSION。
工业实用性
根据本发明，能够提供一种用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒
<130> 1624-3TCCN
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 公共引物
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 58
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 标签引物In1
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCATTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 标签引物In2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCAGCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 标签引物In3
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTATCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 标签引物In4
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACACTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 66