一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种试剂盒及其应用，尤其涉及一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

牛支原体(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病。1961年，美国人Hale等首次从在患乳房炎奶牛的牛奶中分离出牛支原体。1976年牛支原体被描述为致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原体及其相关疾病迅速扩散至世界各个国家和地区的牛群，对世界养牛业的健康发展造成了极大的威胁和了严重的经济损失。2008年以来，我国多地相继发生并广泛流行的以发热、咳嗽和流鼻涕为主要症状，以坏死性肺炎为主要病变的牛呼吸道传染病亦被确定为牛支原体感染所致的牛支原体肺炎，由于该病常规药物疗效不佳，且无有效疫苗进行预防，因此给我国的养牛业造成了严重经济损失。

由于牛支原体肺炎临床症状无特殊性，临床上极易与其他呼吸道疾病相混淆，因此，目前牛支原体肺炎的实验室诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断等。其中，病原学诊断最为确实，但却需要耗费较长的时间。而血清学诊断方法中常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎灵敏度低，非特异性高。因此，快速、灵敏和特异的牛支原体检测方法的建立对牛支原体肺炎的及时、准确诊断和有效控制具有重要意义。

PCR方法敏感性和特异性较好，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。但是传统的PCR方法从样品的裂解、DNA提取、PCR扩增到电泳检测需要5小时以上。而细菌分离培养到纯化及DNA提取扩增至少需要3～4天才能做出初步鉴定。因此普通的PCR方法和分离鉴定方法不仅费时费力，结果也不准确，而且敏感性差，容易产生假阳性的结果，不利于养殖户和规模化企业快速准确诊断病原，立即采取相应的疫苗和药物来进行及时的治疗以减少损失的目的。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出的一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒及其应用，样品简单处理，直接扩增，快速反应，整个过程1小时内完成，检测迅速，灵敏性佳。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒，包含以下试剂：PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照。

上述所述PCR扩增试剂含有2×Direct PCR Mix 10μl、10pM正向引物1μl、10pM反向引物1μl、5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl、加灭菌ddH₂O至19μl。所述正向引物为PF：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，所述反向引物为PR：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’。

本发明提供的试剂盒能快速、准确的检测出牛肺炎支原体。可对牛肺炎支原体感染的单个样品检测，也可对临床病例中混合感染的检测，可用于牛支原体肺炎病原普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。

本发明进一步提供一种快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒的应用，包括以下步骤：

第一步、样品的采集，分为病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集为无菌条件下采集病料10mg～100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用，所述鼻咽拭子采集为采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；

第二步、样品处理，鼻咽拭子中加入200μl灭菌ddH₂O，挤压后弃掉拭子，病料研磨后的固体状样品2mg，加入20μl灭菌ddH₂O，震荡混匀；快速涡旋5秒，取1μl上清作为模板。

第三步、直接PCR反应，反应体系为20μl，取处理后的样品上清1μl，加入PCR扩增试剂19μl，充分混匀，阳性对照和阴性对照分别取1μl加入19μl PCR扩增试剂，PCR扩增程序为98℃30s；然后35个循环：98℃5s，55℃5s，72℃5s；最后72℃1min；

第四步、PCR产物的检测，取5μl扩增产物直接加到含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，同时加入DNA Marker(2000bp)对照,电压为100V，电泳20min，然后在凝胶成像仪中观察结果，如果样品能扩增出1390bp条带，说明样品为阳性，阳性对照也扩增出1390bp条带，阴性对照没有条带。

上述方法的所述第三步中的反应体系为20μl，含有处理后的样品上清1μl，2×Direct PCR Mix 10μl，10pM正向引物1μl，10pM反向引物1μl，5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl，加灭菌ddH₂O至20μl。充分混合均匀后短暂离心。扩增长度为1390bp。所述第四步中琼脂糖凝胶电泳时的凝胶浓度为1.0％，其中含有1％的凝胶染料。

本发明的方法是建立在分子生物学基础上的，检测中提供了阴性和阳性对照，大大提高了检测的准确度，降低假阳性的出现几率，特异性较强，省时省力，该试剂盒将检测时间缩短至1h，大大提高了工作效率。本发明特别适合于牛肺炎支原体感染的大量临床样本的快速诊断，可以为临床和科研上牛支原体肺炎的防治和治疗提供科学依据，而且对提高牛肺炎支原体的检测、监控、疫苗研制等具有重要意义。

附图说明

图1为PCR产物的检测结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，由图1可知，模板PCR扩增片段约为1390bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小，1为阳性对照，2为支原体扩增的片段，3为阴性对照。

图2为试剂盒特异性检测结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp。1为阳性对照，2为支原体扩增，3～9依次为猪链球菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌，均未扩增出。由图2可知，试剂盒特异性好。

图3为试剂盒敏感性检测结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，1为阳性对照，2～7依次为模板10⁰～10^-5稀释度。由图3可知，模板稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5时，均能扩增出清晰条带，证明试剂盒检测的敏感度为10^-4，试剂盒敏感性好。

图4为试剂盒的临床应用检测结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，1为阳性对照，2～22为临床病料，23为阴性对照。由图4可知，试剂盒可以用于临床病料的检测。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，文中的百分含量，如没有特别说明均指重量百分比。

实施例1

本实施例的直接PCR检测牛肺炎支原体的方法的建立：

(1)PCR扩增试剂，含有2×Direct PCR Mix 10μl、10pM正向引物1μl、10pM反向引物1μl、5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl、加灭菌ddH₂O至19μl。其中2×Direct PCR Mix含dNTPs、MgCl₂、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂、蓝色示踪染料。

(2)阳性对照和阴性对照。阳性对照为牛支原体疫苗株，阴性对照为灭菌ddH₂O。

反应体系为20μl，处理后的样品上清1μl，PCR扩增试剂19μl。

包括以下步骤：

(1)样品的采集：

①病料：无菌采集病料10mg～100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用。

②鼻咽拭子：用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用。

(2)样品处理：

①鼻咽拭子中加入200μl灭菌ddH₂O，挤压后弃掉拭子。

②固体状的动物组织先进行研磨，取研磨后的固体状样品2mg，加入20μl灭菌ddH₂O。

③震荡混匀，快速涡旋5秒，取1μl上清作为模板。

(3)直接PCR反应：

①PCR反应体系为20μl，取处理后的样品上清1μl，加入PCR扩增试剂19μl，充分混匀，同时设阴、阳性对照。

②PCR扩增程序为98℃30s；然后35个循环：98℃5s，55℃5s，72℃5s；最后72℃1min；

(4)PCR产物的检测：取5μl扩增产物直接加到含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，同时加入DNA Marker(2000bp)对照,电压为100V，电泳20min，然后在凝胶成像仪中观察结果，如果样品能扩增出1390bp条带，说明样品为阳性，否则为阴性。阳性对照也扩增出1390bp条带，阴性对照没有条带。将阳性样品PCR扩增产物测序，序列见序列表，通过比对，与牛支原体HB0801-P180株(Genbank no.CP007591)同源性100％。

快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒的特异性

将已分离鉴定的猪链球菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌、沙门氏菌培养，取单菌落溶于20μl ddH₂O，取1μl加入直接PCR反应体系扩增，结果如图2均未有扩增条带，只有含牛支原体的阳性病料扩增出特异性条带，证实本实施例有较好的特异性。

直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒的灵敏性

采集的样品处理后取1μl上清作为模板，依次10倍稀释至10^-5，各取1μl作为直接PCR扩增，确定其敏感性。如图3，模板稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4时，均能扩增出清晰条带，证明试剂盒检测的敏感度为10^-4。

快速直接PCR检测牛肺炎支原体的试剂盒的临床应用

从临床发生典型症状的病牛采集鼻拭子57份，按照本试剂盒的方法处理，进行直接PCR，电泳检测，结果阳性32份，同时，提取样品DNA，进行常规PCR，阳性32份，与直接PCR结果一，如图4，证实本试剂盒与常规PCR符合率100％，适合临床样品的快速检测。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

样品扩增序列：CCTTAGGCAGTTTCTTTATAAACCGACTTCGGGCATTACCAGCTCCCATGGTTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACGTATTCACCGTAGCGTAGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGAAGTCGAGTTGCAGACTTCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTTTGAGGTTTGCTCCATGTCACCACTTCGCTTCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCCACTCGTAAGAGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCCGATTACTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGTAACTAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCAGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCATCTGTCATTCTGTTAACCTCCACTATGTCTCCATAGCTTTGCAGAAGATGTCAAGAGTGGGTAAGGTTCTACGCGTAACATCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGATCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTATTCTTGCGAACGTACTACTCAGGCGGATCATTTAATGCGTTAGCTGCGTCGATGAGTTCCCCATCAACTAATGATCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTCTCTCAGTGTCAGTGTATGCCCAGTTAGCTGCCTTCGCCATATTGATGTTCTTCCTTATATCTACGCATTTCACCGCTTCACAAGGAATTCCGCTAACCTCTACATAACTCTAGTCTGCCAGTATCCAACGCGTTTTGGGGTTGAGCCCCAAAATTTAACGCCAGACTTAACAAACAACCTACAGACGCTTTACGCCCAATAATTTCGGATAACGCTTGCAACCTATGTATTACCGCGGCTGCTGGCACATAGTTAGCCGTTGCTTTCTAATCAGGTACCGTCAAGGTAGCATCATTTCCTATGCTACTTTTTCTTCCCTAACCACAGCAGTTTACAACCCATAGGGCCTTCATCCTGCACGCTGTGTCGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCAATCTCTCAACCCCGCTAAACATCATCGCCTTGGTGGGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGTTGCGCACTCCGATCTTTTAGCGAAGCAAACGCTTCCTTTTATATTACTTTCATGCAAAAATAATAAGTATTCGGTATTATCGGATGTTTCCATCCGCTATCCCAATCTAAAAGGTACGTTGAGTACGTGTTACTCACCCATTCGCCGCTATGATATTGCTATCATCGCTCGACATGCATG

引物序列：PF:5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’

PR: 5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’