一株瘤胃菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株瘤胃菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

己酸是一种重要的化工原料，可用于食品香料、动物饲料、绿色抗菌剂、缓蚀剂和生物燃料等领域。特别地，己酸还是生成浓香型白酒的主体香成份—己酸乙酯的前体物，具有广泛的应用前景。微生物催化产己酸研究最多和最为深入的是克氏梭菌(Clostridium klyuveri)，该菌以乙醇为电子供体，乙酸为电子受体合成己酸。目前普遍以此工艺进行己酸的生物合成。

近年来，有研究表明乳酸同样可作为电子供体，用于合成己酸，效率甚至高于以乙醇为电子供体合成己酸的途径。乳酸是碳水化合物厌氧降解过程中常见的中间产物，例如，传统窖池酿酒过程中，除了产乙醇外，还会产生大量的乳酸，其浓度甚至高于乙醇浓度5-10倍。另外，城市废水和食品发酵废水在厌氧处理时，其中的碳水化合物(占废水COD的17-70％)会转化为乳酸、乙酸等中间产物。由于乳酸、乙酸等小分子中间产物可溶于水，回收成本高，因此基本未被有效回收利用，大量废物资源被白白浪费；此外，乳酸还可以从许多有机废弃物中较容易地获得，比如农业废弃物玉米秸秆和玉米芯发酵。由于己酸较乳酸溶解度低(仅1％)，附加值高(4-5倍)，易于提取，因此以乳酸为底物合成己酸的途径为废水、废弃物资源化提供了一条新思路。

目前的研究中，通过乳酸合成己酸的工艺多采用混合菌种，在菌种调控和稳定性方面存在一定的问题。分离获得具有利用乳酸合成己酸的纯菌种，制备成强化菌剂，用于乳酸—己酸的工业化高效转化，以及相关工艺(比如酿酒发酵)的调控非常具有实际应用价值。截止目前，已报道的能够利用乳酸产己酸的纯菌仅有Megasphaera elsdenii J1和本发明人前期分离的一株新菌瘤胃菌CPC-11(申请号：201511025819.4)。但Megasphaera elsdenii J1利用乳酸主要产丁酸，己酸仅为其副产物，产量非常低(约23.2mg/L)，不具备工业化应用潜力。本发明人前期分离的瘤胃菌CPC-11可以将乳酸转化为己酸，产己酸的速率为1.46g/L/d，但该菌产己酸的速率仍然较低，因此，还需要开发一种产己酸速率更高、产己酸浓度更高的新菌株。

技术实现要素：

针对现有产己酸菌生产己酸的速率较低、产量较低的问题，本发明提供了一株新的瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6，已于2016年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：60133。

本发明所提供的瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株来自于己酸生物合成的厌氧生物反应器，采用梯度稀释分离获得。通过序列比对分析，该菌株与数据库(NCBI，RDP)中已有的模式菌种16SrDNA的同源性均较低(<94％)，数据库中与其最接近的模式菌株为Clostridium leptum DSM753(92.6％)，其次是Clostridiumsporosphaeroides DSM1294(91.7％)。此外，瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6与本发明人前期分离的产己酸菌瘤胃菌(Clostridium sp.)CPC-11(Clostridium sp.KM454168)的16SrDNA序列相似度仅92.8％，表明二者并非同种。根据细菌新种判定的重要标准(16S rRNA序列相似性<97％)判断CPB6为瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的一个新分支(Clostridium cluster IV)的一个新种。CPB6在NCBI基因库序列登记号为KM454167。

瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6的16S rRNA序列(SEQ ID No.1)：

TTTAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAACTTTTTGCTTCGGTAGAAAGTTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGGAACCTGCCTTTCAGAGGGGGATAATGTCTGGAAACGGACACTAATACCGCATGACATTTTCTGTTCACATGGACAGAAAATCAAAGGAGCAATCTGCTGAAAGATGGACTCGCGTCCGATTAGCTAGATGGTGAGATAATAGCCCACCATGGCGACGATCGGTAGCCGGACTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAAGGAAGACGGTCTTCGGATTGTAAACTTTTGTACCTAGGGACGATAATGACGGTACCTAGGCAGCAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGAGCGAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCAAGCAAGTCAGCTGTGAAAACTATGGGCTTAACCCATAGCCTGCAATTGAAACTGTTTGGCTTGAGTGAAGTAGAGGTAGGTGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGAGATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCTACTGGGCTTTAACTGACGCTGAAGCACGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGATTACTAGGTGTGGGGGGTCTGACCCCTTCCGTGCCGGAGTTAACACAATAAGTAATCCACCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCTTCGGGGAAAGTTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTACTGTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGCAGGACTGCCGTTGACAAAACGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGTTAACAGAGAGAAGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAACCTCAAAAAGCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGTTGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCATAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCCGGTAATACCCGAAGTCAGTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGCTGCCGAAGGTAGGATTGGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCAGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

本发明的另一目的是提供一种利用上述瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6将乳酸转化为己酸的应用。

进一步地，上述瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株可用于含乳酸的废水、有机废弃物生产高附加值的己酸，实现废物资源化和循环利用。

1、分离培养基成分如下：

1g酪蛋白胨,0.25g酵母汁,0.4g NaHCO₃,0.1g半胱氨酸,0.045g K₂HPO4,0.045g KH₂PO₄,0.09g NaCl,0.009g MgSO₄·7H₂O,0.009g CaCl₂,0.1mg刃天青,1mg氯化血红素,0.5mL乳酸，微量元素溶液0.1ml，维生素溶液1ml。蒸馏水100ml。其中：

微量元素溶液(L)：FeCl₂·4H₂O 1.5g；CoCl₂·6H₂O 0.19g；MnCl₂·4H₂O 0.1g；ZnCl₂0.07g；NaMO₄·2H₂O 0.036g；NiCl₂·6H₂O 0.024g；H₃BO₃ 0.006g；CuCl₂·2H₂O 0.002g；HCl(25％solution)10ml。

维生素溶液(L)：p-氨基苯甲酸0.04g；生物素0.01g；烟酸0.1g；B₅ 0.05g；B₆0.15g；B₁ 0.1g；B₁₂ 0.05g；D.L-硫辛酸0.03g；B₂ 0.03g；叶酸0.01g。

2、发酵培养基成分如下：

蛋白胨5g,葡萄糖1g,酵母浸粉5g，乙酸钾10g,磷酸氢二钾0.31g，磷酸二氢钾0.23g，氯化铵0.25g，硫酸镁0.2g,碳酸氢钠2.5g,L-半胱氨酸0.25g,硫化钠0.25g，乳酸钠18.8ml,蒸馏水1000mL，pH值5.5。

本发明所述瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株的菌落形态为圆形，白色凸起，质地粘稠。扫描电镜显示该菌体呈短杆状，菌体大小为2μm×0.5μm，该菌株革兰氏染色阳性，菌体的适宜生长温度30-40℃，pH5.0-6.5，厌氧生长，发酵葡萄糖产酸产气。

Biolog AN MicroPlates TM厌氧鉴定系统分析得出菌株CPB6具有广泛的糖利用范围，不仅能利用α-D-葡萄糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-β-D-甘露糖胺、杏苷、D-纤维二糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龙胆二糖、D-葡萄糖酸，还能利用葡萄糖-6-磷酸盐、α-D-乳糖、麦芽糖、麦芽三糖等。但不能利用N-乙酰基-D半乳糖胺、甘露糖胺、D-阿拉伯糖醇、熊果苷、α-环式糊精、β-环式糊精、糊精、己六醇、i-赤藻糖醇等，详见表1。

API实验结果显示，瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株对葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、木糖、纤维二糖、甘露糖、松三糖和棉子糖、鼠李糖、海藻糖表现为显性反应。而对色氨酸、脲素、乳糖、柳醇、阿拉伯糖及明胶、七叶灵柠檬酸铁、甘油、山梨醇则为阴性反应，如表2所示。

本发明涉及的生物材料相关保藏信息为：

保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所59号楼5楼；保藏日期：2016年12月20日；保藏编号：GDMCCNo：60133；命名为：瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6。

本发明的优点在于：

(1)提供了一株新的瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株；

(2)瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株可利用乳酸产己酸，产己酸浓度可达16.6g/L，最高产率可以达到5.29g/L/d；

(3)瘤胃菌(Clostridium sp.)CPB6菌株可用于含乳酸废水、有机废弃物生产高附加值的己酸，实现废物资源化和循环利用。

附图说明

图1是菌株CPB6的扫描电镜照片；

图2是基于16SrRNA系统发育进化树；

图3是pH对菌株CPB6产己酸的影响，其中，A为乳酸消耗情况，B为己酸生成情况；

图4是温度对菌株CPB6产己酸的影响，其中，A为乳酸消耗情况，B为己酸生成情况；

图5是混合废水发酵实验。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1菌种的分离、纯化与培养

1、分离培养基

培养基组成(100mL)：1g酪蛋白胨,0.25g酵母汁,0.4g NaHCO₃,0.1g半胱氨酸,0.045g K₂HPO4,0.045g KH₂PO₄,0.09g NaCl,0.009g MgSO₄·7H₂O,0.009g CaCl₂,0.1mg刃天青,1mg氯化血红素,0.5mL乳酸，微量元素溶液0.1ml，维生素溶液1ml。蒸馏水100ml。其中：

微量元素溶液(L)：FeCl₂·4H₂O 1.5g；CoCl₂·6H₂O 0.19g；MnCl₂·4H₂O 0.1g；ZnCl₂0.07g；NaMO₄·2H₂O 0.036g；NiCl₂·6H₂O 0.024g；H₃BO₃ 0.006g；CuCl₂·2H₂O 0.002g；HCl(25％solution)10ml。

维生素溶液(L)：p-氨基苯甲酸0.04g；生物素0.01g；烟酸0.1g；B₅ 0.05g；B₆0.15g；B₁ 0.1g；B₁₂ 0.05g；D.L-硫辛酸0.03g；B₂ 0.03g；叶酸0.01g。

2、分离过程

(1)菌种的富集

己酸菌属于梭状芽孢杆菌，根据芽孢杆菌比非芽孢杆菌有耐热性的特点，通过加热方法淘汰非芽孢菌。取1g申请人用于己酸生物合成的厌氧生物反应器中的底泥样品加入到装有5mL蒸馏水的试管中，高速振荡15min，放在95℃的恒温水浴锅中处理30min。处理结束后，在厌氧培养箱中，取1mL样品接种到装有100mL已除氧灭菌的上述培养基的厌氧瓶中，置于30℃恒温培养箱中培养7天。

(2)菌种分离和纯化

在无氧、无菌的超净厌氧培养箱中，采用梯度稀释平板法制成10^-1，10^-2至10^-5。选取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度用平板涂布法将菌液接种到固体分离培养基上，倒置平板，于30℃厌氧培养箱中培养直至长出菌落。挑取平板上形态不同的单菌落，在新的固体平板分离培养基上划线，培养，再挑取单菌落重复划线，直至得到纯菌株。然后挑选单菌落斜面保存，或接入液体培养基中进行培养，培养液用甘油保存在-80℃冰箱。

(3)菌种复筛

将获得的纯菌株，再次接入以乳酸为碳源的发酵液体培养基中，在30-35℃厌氧培养5-7天，观察并验证是否能够转化乳酸并产生己酸，复选出转化速率快、己酸产量高的菌株保存备用。

(4)纯菌检测与验证

首先通过菌落形态、颜色和显微镜检观察细菌，初步判定是否是纯菌株；然后通过PCR扩增菌液的16SrRNA基因序列，直接测序确定是否为纯菌株。

3、菌种培养

(1)培养基

发酵培养基成分：蛋白胨5g,葡萄糖1g,酵母浸粉5g，乙酸钾10g，磷酸氢二钾0.31g，磷酸二氢钾0.23g，氯化铵0.25g，硫酸镁0.2g,碳酸氢钠2.5g，L-半胱氨酸0.25g，硫化钠0.25g，乳酸钠18.8ml，蒸馏水1000mL，pH值5.5。

(2)挑取一环斜面菌种接入含上述培养基的厌氧管中，150rpm，37℃培养3天，可获得浓度约10⁸CFU/mL的种子培养液。

实施例2菌种的特征与鉴定

1、形态特征

(1)菌落形态

菌落为圆形，白色凸起，质地粘稠。

(2)菌体形态

革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，菌体大小为2μm×0.5μm，如图1所示。

2、生理生化特征

用Biolog AN MicroPlates ^TM和API 20A厌氧鉴定系统分析得出该菌的特征如表1、表2所示。

表1菌株CPB6的Biolog特征

表2菌株CPB6的API特征

3、分子生物学特征

通过细菌Pacbio平台对CPB6进行全基因组测序，获得CPB6的全基因组图谱，其16S rRNA基因长度为1511bp，在NCBI基因库序列登记号为KM454167，序列见图2。

通过序列比对分析，该菌株与数据库中的梭菌模式种(Clostridiumsporosphaeroides DSM1294)91.7％相似，(Clostridium leptum DSM753)92.6％相似。此外，该菌株与CPC-11(Clostridium sp.KM454168)的相似度92.8％。根据细菌新种判定的重要标准(16S rRNA序列相似性<97％)判断CPB6为瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的一个新分支(Clostridium cluster IV)的一个新种CPB6在NCBI基因库序列登记号为KM454167，保藏编号GDMCC No：60133。与CPB6最相似的模式菌株如表3所示，基于16SrRNA系统发育进化树如图2所示。

4、菌株的保藏

将获得的CPB6(Clostridium sp.CPB6)纯菌株，寄到广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所59号楼5楼)进行保藏，保藏编号GDMCC No：60133。

表3与CPB6最相似的模式菌株

实施例3初始pH值对CPB6产己酸的影响

从图3中可以看出，当pH为5-6.5时，该菌株己酸含量大幅上升；而当pH大于7.5时几乎没有己酸产生。当pH为5.5-6时产酸能力最强，pH为5.5-6最佳。

实施例4温度对CPB6产己酸的影响

如图4所示，发酵温度为20℃或50℃，经过24h乳酸没有消耗，也几乎没有己酸产生。温度30-40℃时菌的活性明显增加，24h后明显有己酸产生，48h就可以达到最高产量。因此，该菌的最佳产己酸温度在30-40℃。

实施例5利用酿酒废水和城市废水混合发酵产己酸

将酿酒废水/城市废水按3：1配制混合废水(乳酸终浓度约31g/L)，作为发酵培养液，调节pH为5.5-6.0，通氮气除氧后，然后接种5％的CPB6种子液(浓度约10⁸CFU/mL)，反应器中厌氧培养(图5)，控制温度30±2℃。当乳酸降解完或即将降解完时，排出25％的发酵液，再加入等量的混合废水，保证总反应体积不变，继续发酵。通过液相色谱法(HPLC)测定发酵产物。结果表明，从第1天开始乳酸含量明显下降，有3g/L己酸产生，到第3乳酸消耗完毕，己酸产量达到12g/L，重新添加含乳酸废水，第5天，乳酸含量达到16.6g/L，己酸的平均产率为3.32g/L/d，最高产率达5.29g/L/d。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株瘤胃菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>1511

<212>RNA

<213>瘤胃菌（Clostridium sp.）

<400>1

tttagagagt ttgatcctgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaac acatgcaagt 60

cgaacgaaac tttttgcttc ggtagaaagt ttagtggcgg acgggtgagt aacgcgtgag 120

gaacctgcct ttcagagggg gataatgtct ggaaacggac actaataccg catgacattt 180

tctgttcaca tggacagaaa atcaaaggag caatctgctg aaagatggac tcgcgtccga 240

ttagctagat ggtgagataa tagcccacca tggcgacgat cggtagccgg actgagaggt 300

tgaacggcca cattgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtggggg 360

atattgcaca atggaggaaa ctctgatgca gcaacgccgc gtgaaggaag acggtcttcg 420

gattgtaaac ttttgtacct agggacgata atgacggtac ctaggcagca agctccggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggagcgag cgttgtccgg atttactggg 540

tgtaaagggt gcgtaggcgg ccaagcaagt cagctgtgaa aactatgggc ttaacccata 600

gcctgcaatt gaaactgttt ggcttgagtg aagtagaggt aggtggaatt cccggtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatc gggaggaaca ccagtggcga aggcgaccta ctgggcttta 720

actgacgctg aagcacgaaa gcatgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccat 780

gctgtaaacg atgattacta ggtgtggggg gtctgacccc ttccgtgccg gagttaacac 840

aataagtaat ccacctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcagtggagt atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc caactaacga agcagagatg cattaggtgc ccttcgggga aagttgagac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tactgttagt tgctacgcaa gagcactcta gcaggactgc cgttgacaaa 1140

acggaggaag gtggggacga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tactacaatg gccgttaaca gagagaagcg ataccgcgag gtggagcgaa cctcaaaaag 1260

cggtctcagt tcggattgca ggctgaaacc cgcctgcatg aagttggaat tgctagtaat 1320

cgcggatcat aatgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

catgggagcc ggtaataccc gaagtcagta gtctaaccgc aaggaggacg ctgccgaagg 1440

taggattggc gactggggtg aagtcgtaac aaggtagccg tatcagaagg tgcggctgga 1500

tcacctcctt t 1511