本发明属于有机高分子化合物领域，具体涉及一种鼠李糖脂的制备方法。
背景技术：
木薯是广泛栽种于热带地区和部分亚热带地区的农作物之一，原料来源广，资源丰富。木薯块根肉质富含淀粉，工业生产中主要以其为原料加工淀粉或酒精。木薯渣是以木薯为原料加工产品后所剩下的固体废料，其淀粉含量较高，同时也含有一定量的木质纤维素和少量的蛋白质，存在相当大的再利用价值。目前虽已有利用木薯渣作饲料应用的研究，但仍未实现大规模产业化利用，大部分企业仍选择将其作为废弃物直接丢弃，这不仅是对资源的巨大浪费，也是对环境的巨大污染。近年来木薯渣因所含粗纤维经有效降解之后可以变废为宝、节省资源又保护环境而受到国内外学者的广泛关注，木薯渣再利用方面的研究已成为一大热点。如果能通过筛选微生物和酶制剂将木薯渣中的淀粉和纤维素转化成葡萄糖，再经微生物发酵生产出日化原料、食品添加剂和新型药物等，就能以低廉的原料成本换来可观的经济效益，从而实现木薯渣的有效降解及再利用。
鼠李糖脂是由微生物在一定条件下产生的次级代谢产物，由1～2个鼠李糖和不同碳链长度的β-羟基脂肪酸两部分连接组成。鼠李糖脂是一种新型的阴离子生物表面活性剂，具有乳化、增溶、分散、凝聚和降低界面张力等功能，而且低毒、易生物降解，因而在石油化工、生物医药、食品及环境保护等领域具有广阔的应用前景。鼠李糖脂的制备主要通过微生物发酵，再从发酵液中提取得到。生产鼠李糖脂的菌种以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)最为常见。许多种类的碳源都可以发酵生产鼠李糖脂，从石油化学衍生物到天然原料，其中最常用的是植物油、糖和甘油。目前，经微生物发酵得到鼠李糖脂的主要瓶颈是碳源的成本过高和鼠李糖脂的产量较低，这限制了鼠李糖脂的规模化生产及应用。降低发酵基质的成本成为鼠李糖脂开发的主要方向。木薯渣作为一种廉价易得的碳源，以其为原料生物合成鼠李糖脂，不仅减少了生产鼠李糖脂的成本，而且降低了木薯渣的治理成本，实现了木薯渣的资源化利用。
技术实现要素：
针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种鼠李糖脂的生产方法，用木薯渣在不经任何预处理的前提下，通过同步糖化发酵制取鼠李糖脂，本工艺可以大幅度提高木薯渣资源组分的利用率。
为实现上述目的的具体技术方案为：
一种鼠李糖脂的生产方法，是向木薯渣中加入纤维素酶及铜绿假单胞菌，同步糖化发酵生产鼠李糖脂。
通过对木薯渣的糖化和发酵试验比较，同步糖化发酵比较经双酶法糖化后接入铜绿假单胞菌发酵、或木薯渣经酶解后接入铜绿假单胞菌进行发酵，有更好的技术效果。
进一步地，所述木薯渣为工业木薯渣，含水量为8～15％，木薯渣的粒度为通过40目筛。
其中，所述铜绿假单胞菌首先经过液体培养基培养和发酵培养基培养，然后加入木薯渣，木薯渣占发酵培养基的比例为2～6w/v％。
其中，所述液体培养基含有的成分为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl 5.0g/L；
发酵培养基含有的成分为：MgSO4·7H2O 0.125g/L，NaNO3 1.5g/L，KH2PO4 0.125g/L，酵母提取物0.5g/L。
其中，所述添加纤维素酶、纤维二糖酶和铜绿假单胞菌种子悬液。反应体系中纤维素酶的加入量为3.75FPU/g-木薯渣，纤维二糖酶的加入量为5.65CBU/g-木薯渣(纤维素酶中纤维二糖酶含量较低，需要额外加入纤维二糖酶)。其中，所述铜绿假单胞菌种子悬液接入发酵培养基的接入量为1～1.5％(v/v)，培养的条件为温度35～38℃、时间144～168h。
其中，发酵结束后，将发酵液固液分离，收集清液，调节清液pH为1.6～2.2后静置，待絮状沉淀出现，用等体积乙酸乙酯萃取清液，收集萃取的上层溶液。
优选地，将发酵液在12000×g离心条件下离心15min后收集上清液，用HCl溶液调节上清液pH为1.6～2.2，在4℃下静置过夜，用等体积乙酸乙酯萃取，收集萃取的上层溶液，用旋转蒸发器减压蒸馏。
本发明的有益效果在于：
木薯渣是提取淀粉后的工业固体废弃物，资源量大、价格低廉；木薯渣中含有的淀粉和纤维素经有效降解可转化为葡萄糖，可用以生产鼠李糖脂。本发明的生产方法中，木薯渣不经双酶法糖化，只加入低用量的纤维素酶即可将大部分的淀粉和纤维素转化为葡萄糖，有利于简化工艺过程。
本发明提出的生产方法，反应过程中同时加入纤维素酶和铜绿假单胞菌，实现了直接同步糖化发酵生产鼠李糖脂，缩短了反应时间，有利于降低生产成本；整个反应过程中不经化学预处理，既降低了化学品使用成本，又使得整个工艺过程绿色环保；相较于以葡萄糖为原料生产鼠李糖脂，以木薯渣为原料经过直接同步糖化发酵生产鼠李糖脂可使产物得率显著提高。木薯渣在不经双酶法淀粉酶糖化的前提下，仅加入纤维素酶和铜绿假单胞菌，鼠李糖脂产量可达11.49g/L。
附图说明
图1是本发明鼠李糖脂生产方法的工艺流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中，木薯渣是提取淀粉后的工业固体废弃物，含水率8～12％。
实施例中，如无特殊说明，所使用的手段均为本领域常规的技术手段。
实施例1
流程见图1。
1)木薯渣经粉碎机粉碎，工业振动筛筛分过40目筛。
2)配制液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 5.0。培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(保藏号CGMCC1.1785)种子悬液。
3)配制发酵培养基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.125，NaNO3 1.5，KH2PO4 0.125，酵母提取物0.5。
向发酵培养基中加入5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将发酵液倒入250mL好氧发酵培养瓶(带竖挡板的三角瓶)中，装瓶量为50mL，瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中加入用量为3.75FPU/g-木薯渣的纤维素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纤维二糖酶和接种量为1％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应168h。
4)对发酵液中的鼠李糖脂进行提取，将发酵液在12000×g离心条件下离心15min后收集上清液。用6mol/L HCl调节上清液pH至2.0，在4℃下静置过夜，待絮状沉淀出现，用等体积乙酸乙酯萃取清液3次，收集3次萃取的上层溶液，用旋转蒸发器减压蒸馏，得到鼠李糖脂粗提品。
获得的鼠李糖脂粗品产量为11.49g/L。
实施例2
木薯渣经粉碎机粉碎，筛分过40目筛。培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)种子悬液。配制发酵培养基，向发酵培养基中加入5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将发酵液倒入250mL好氧发酵培养瓶(带挡板)中，装瓶量为50mL，瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中加入用量为3.75FPU/g-木薯渣的纤维素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纤维二糖酶和接种量为3％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应144h。随后对发酵液中的鼠李糖脂进行提取。
其他操作同实施例1。获得的鼠李糖脂粗品产量为11.08g/L。
实施例3：
木薯渣经粉碎机粉碎，工业振动筛筛分过40目筛。培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)种子悬液。配制发酵培养基，向发酵培养基中加入2.5％(w/v)的木薯渣，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将发酵液倒入250mL好氧发酵培养瓶(带挡板)中，装瓶量为50mL，瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中加入用量为3.75FPU/g-木薯渣的纤维素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纤维二糖酶和接种量为1％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应96h。随后对发酵液中的鼠李糖脂进行提取。
其他操作同实施例1。获得的鼠李糖脂粗品产量为5.98g/L。
对比例1：
培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)种子悬液。配制发酵培养基，向发酵培养基中加入30g/L的葡萄糖，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将发酵液倒入250mL好氧发酵培养瓶(带挡板)中，装瓶量为50mL，瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中接入1％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应144h。随后对发酵液中的鼠李糖脂进行提取，获得的鼠李糖脂粗品产量为1.98g/L。
讨论：经前期试验得知，木薯渣经纤维素酶转化可得到约30g/L的葡萄糖，但直接用30g/L的葡萄糖为底物生产鼠李糖脂，产量较低。对比例2：
木薯渣经粉碎机粉碎，工业振动筛筛分过40目筛。木薯渣经双酶法糖化：20％木薯渣在85℃下使用淀粉酶液化1h(加酶前要加入CaCl2)，淀粉酶用量20U/g木薯渣，调节糊化液pH至4.0(10％H2SO4)，按照150U/g木薯渣加入糖化酶，于60℃糖化2-3h，得到木薯渣淀粉糖化液。
培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)种子悬液。配制2倍浓度发酵培养基：MgSO4·7H2O 0.25，NaNO3 3.0，KH2PO4 0.25，酵母提取物1.0。向250mL好氧发酵培养瓶(带挡板)中加入25mL的2倍浓度发酵培养基，再加入12.5g木薯渣糖化液和15g水，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将好氧发酵培养瓶的瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中加入用量为3.75FPU/g-木薯渣的纤维素酶、5.65CBU/g-木薯渣的纤维二糖酶和接种量为1％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应168h。随后对发酵液中的鼠李糖脂进行提取，获得的鼠李糖脂粗品产量为5.65g/L。
讨论：木薯渣经双酶法糖化之后再接入铜绿假单胞菌进行发酵，会使得反应初期溶液中的葡萄糖浓度过高，不利于菌种的生长。
对比例3：
木薯渣经粉碎机粉碎，工业振动筛筛分过40目筛。木薯渣酶解：10％木薯渣在48℃、180rpm下酶解96h，纤维素酶加入量为3.55FPU/g-木薯渣、纤维二糖酶加入量为5.65CBU/g-木薯渣。培养得到用于接入发酵体系的铜绿假单胞菌(CGMCC 1.1785)种子悬液。配制2倍浓度发酵培养基：MgSO4·7H2O 0.25，NaNO3 3.0，KH2PO40.25，酵母提取物1.0。向250mL好氧发酵培养瓶(带挡板)中加入25mL的2倍浓度发酵培养基，再加入25mL木薯渣酶解液，并用2mol/L NaOH溶液调节体系pH至6.0，制得发酵液。将好氧发酵培养瓶的瓶口用封口膜封住后灭菌。随后向无菌的发酵液中接入1％(v/v)的铜绿假单胞菌种子悬液。将好氧发酵培养瓶置于37℃、180rpm的恒温摇床中反应168h。随后对发酵液中的鼠李糖脂进行提取，获得的鼠李糖脂粗品产量为1.30g/L。
讨论：木薯渣经酶解后接入铜绿假单胞菌进行发酵，会使得反应初期溶液中的葡萄糖浓度过高，抑制铜绿假单胞菌的生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。