本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MED隐种漆酶LAC1及其基因和应用。
背景技术：
在植物与昆虫的协同进化过程中，植物进化出了多种防御机制使自己免受昆虫的危害，同时植食性昆虫也发展出精妙的行为和生理机制以适应现有的寄主植物或幵发新的寄主植物。为应对植物的防御，植食性昆虫也进化出了多种行为和生理机制以应对植物的防御，以使它们能够顺利地在一些特定的植物上存活，或适应多种不同的寄主植物。
漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)广泛分布于真菌分泌物、高等植物、昆虫和少量细菌中，是具有p-对苯二酚双氧氧化还原活性的多酚氧化酶，属于蓝多铜氧化酶(blue multi-copper oxidases，BMCOs)家族。该酶利用铜离子特有的氧化还原能力氧化酚类和芳香类化合物，同时将分子氧还原成水。漆酶的作用底物广泛，可降解木质素，可氧化啤酒、果汁等饮料中的多酚氧化酶。昆虫中的漆酶1(laccase 1,LAC1)属于多酚氧化酶家族。基于漆酶1在生物体代谢中的作用，推测其是烟粉虱应对植物防御反应并帮助昆虫顺利取食的关键酶。
粉虱属于半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，是一类体型微小的植食性刺吸类害虫，烟粉虱是一个包含30个以上隐种的物种复合体，其中，烟粉虱MED隐种是入侵我国的重要农业害虫。烟粉虱MED隐种能在新的环境下迅速适应寄主植物，顺利取食并生存繁殖，其体内参与反防御反应的酶类起着关键作用，因此研究漆酶1基因在烟粉虱体内的时空表达情况和在取食过程中对植物防御的调控作用，能为深入了解烟粉虱与植物互作的分子机制提供基础，并为研究烟粉虱防治新策略提供理论依据。
因烟粉虱有许多隐种，不同隐种间基因序列存在差异，从而导致了蛋白质序列的差异，因而其基因功能可能也存在差异。
近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。
然而并非所有基因都能通过RNAi技术达到影响生物体功能的效果，例如豌豆蚜中的血管紧张素转移酶有三个亚型ACE1、ACE2、ACE3，分别干扰三个基因均不能影响豌豆蚜在植物上的生存、取食和生殖。本研究中的基因通过RNAi后可使烟粉虱在植物上的存活率降低。对了解烟粉虱如何适应寄主植物有重要理论意义，对选育抗虫植物新品种和发展新型烟粉虱控制策略有重要实践意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供从烟粉虱MED隐种中克隆到MED BtQLAC1酶。
本发明的再一目的是提供上述MED BtQLAC1酶的编码基因。
本发明的再一目的是提供上述MED BtQLAC1酶的应用。
本发明的再一目的是提供上述MED BtQLAC1酶的编码基因的应用。
根据本发明的具体实施方式，所述烟粉虱MED隐种漆酶LAC1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
根据本发明的具体实施方式，上述烟粉虱MED隐种漆酶LAC1编码基因的cDNA全长核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：2：
本发明从烟粉虱MED隐种中克隆到MED BtQLAC1基因的cDNA，并通过饲喂MED BtQLAC1基因dsRNA，进而导致烟粉虱MED隐种成虫在番茄植株上取食死亡率明显增加。本发明的试验结果明确了MED BtQLAC1基因在烟粉虱MED在取食中的作用，期望为进一步研究烟粉虱MED的取食过程中的反防御机理和日后通过植物适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
附图说明
图1 MED BtQLAC1基因的dsRNA处理对烟粉虱MED存活率的影响：比较饲喂MED BtQLAC1基因dsRNA、饲喂20％蔗糖溶液48h后烟粉虱MED隐种在番茄植株上成虫存活率。所有数据均用SAS 8.1统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P<0.05。
具体实施方式
实施例1：烟粉虱MED BtQLAC1基因全长cDNA序列克隆
取烟粉虱MED隐种的成虫200头，提取RNA并在超低温冰箱保存以备用。采用Transgen公司的反转录试剂盒(Super Script First-Strand Synthesis System)进行cDNA合成。设计引物MED BtQLAC1-F和MEDBtQLAC1-R：
BtQLAC-F:5’-CGCCTCTAGCGATTTTCAAC-3’
BtQLAC-R:5’-CGATGACTGGGTTGTTGTTG-3’
以cDNA为模板，PCR扩增烟粉虱MED隐种MED BtQLAC1基因的中间片段。根据所获得的烟粉虱MED BtQLAC1基因的中间片段序列，设计5’RACE和3’RACE特异性引物，PCR扩增MED BtQLAC1基因的5’和3’端序列：
GSP1:5’-GCTGCTGTTGAGGGTTGACTTGTGG-3’
GSP2:5’-TCGAACCGGAAGAAGCAACCTCACT-3’
NGSP1:5’-F AGTTGCAGGAGGCAAAGCGTAATCC-3’
NGSP2:5’-R CGAACGTTGCTGACAGCTGGGAAA-3’
采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clonetch)试剂盒，并严格按照试剂盒说明书操作，扩增得到目的条带，将克隆测序，得到MED BtQLAC1基因2733bp序列，所得的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2 MED BtQLAC1基因功能验证
选择用番茄饲养的两种粉虱较活跃成虫个体作为供试虫源，随机取200头，放入两端通透的玻璃管(直径3cm，高8cm)中，玻璃管上端用双层Parafilm膜覆盖，进行人工饲养，两层Parafilm膜间加入200μL饲养液，饲养液为10％蔗糖加10mM MES用蒸馏水溶解的混合液。另将无粉虱取食的饲养液作为对照。
待粉虱取食24h后，使用一次性注射器回收含有粉虱唾液的饲养液和未经烟粉虱取食的饲养液，吸取过程需谨防底膜破裂。反应在28℃下进行，取回收液50μL，加到96孔微孔板中，然后加入150μLABTS底物与回收液混匀，在240nm下测定吸光值，采用动力学方法，每5分钟读数1次，总共读2次。各处理重复3次，每次重复制备酶液。
酶活性以单位时间内每升溶液的吸光度变化值来表示(△OD240nm·min-1·L-1)。每个样品重复测定3次。ABTS在pH5时仅与漆酶反应，因此唾液中加ABTS测得的
表1唾液中漆酶1酶活测定
本实验结果为：加入ABTS底物后，含有烟粉虱唾液的蔗糖溶液吸光值与不含唾液的蔗糖溶液吸光值差异显著，说明漆酶1能通过唾液分泌到体外，且具有漆酶活性。
实施例3：MED BtQLAC1基因的dsRNA处理对烟粉虱MED在番茄上存活率的影响
1、dsRNA模板的制备：
加上T7启动子(下划线所示序列)后的引物序列：
T7+MED BtQLAC1-F：
TAATACGACTCACTATAGGGACTCATTTCTGGCACTCGCA；
T7+MED BtQLAC1-F：
TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCCGGTTCGATGTCACC。
总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。
以T7引物进行PCR扩增，然后纯化产物，纯化所得的PCR产物即为合成dsRNA的模板。
2、dsRNA的合成与纯化
使用RNAi Kit试剂盒合成和纯化dsRNA。
3、dsRNA饲喂
取初羽化的烟粉虱MED隐种成虫约200头放人两端通透的玻璃管中，玻璃管上端覆以两层Parafilm膜并在两膜间的空隙内加入含有dsRNA的20％的蔗糖液1000μL，玻璃管下端覆以纱布以保持通气，玻璃管周围和下端用黑色塑料纸包裹有利于烟粉虱向顶端Paraflim膜聚集，从而更好的取食dsRNA混合液。将处理好的玻璃管放入人工气候箱中(温度25±0.2℃，24h光照，相对湿度为60-70％)，饲喂48小时MED BtQLAC1基因的dsRNA后，将烟粉虱收集于1.5ml离心管中，放至长有6片叶的番茄植株上。以饲喂含有GFP dsRNA且灭菌处理过的20％蔗糖溶液的烟粉虱MED隐种作为对照，每组10个重复。利用SAS 8.1统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱MED隐种死亡率，结果如图1所示，饲喂MED BtQLAC1基因dsRNA的烟粉虱MED隐种的存活率显著低于对照组死亡率(P<0.001)，干扰效果为目的基因MED BtQLAC1所产生，因此，本发明的MED BtQLAC1基因在烟粉虱MED隐种取食过程中起着关键作用。
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 烟粉虱MED隐种漆酶LAC1及其基因和应用
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