用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种用酵母菌制备具有三聚体结构的埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。

背景技术：

埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)是埃博拉病毒表面的唯一表面蛋白，以三聚体为一个结构单元的形式存在，埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP是病毒粒子唯一的表面蛋白，在病毒入侵的过程中发挥着重要的作用，同时也是中和抗体主要的作用靶标，因此是埃博拉出血热预防疫苗的主要成分。

疫苗接种作为一种最简单有效的防治手段，在病毒疫情的预防中有着重要的作用，在埃博拉病毒疫苗的开发上，现有的研究内容大致分为如下几大类：第一类包括灭活疫苗、反向遗传修饰的疫苗和DNA疫苗，这一类的疫苗在目前对于此类疫苗的免疫原性、安全性和有效性进行研究中，已经被证明不适合作为埃博拉疫苗的疫苗类型；第二类我们称为载体类疫苗，此类疫苗是利用腺病毒(Adenovirus)载体、水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)载体、牛痘病毒载体、人3型副流感病毒载体、新城疫病毒载体、狂犬病毒载体等插入埃博拉病毒部分抗原基因开发得到的疫苗形式，这类疫苗已经被证明拥有很好的保护力而且其安全性也很好，但是作为载体类疫苗其缺点在于预存免疫和疫苗的保存运输要求较高；第三类为蛋白类疫苗，蛋白类疫苗顾名思义就是以病毒蛋白组分作为主要组成部分的一类疫苗，现在研究的主要有病毒样颗粒疫苗(VLPs)和亚单位疫苗。有研究显示，在哺乳动物细胞或者杆状病毒表达系统中共表达GP蛋白和VP40蛋白，或者GP蛋白、VP40蛋白和NP蛋白时可以自组装形成病毒样的颗粒，利用VLPs免疫后攻毒可以使食蟹猴获得100％的保护，而且疫苗诱导动物产生了明显的体液和细胞免疫反应。而以GP融合人IgG1Fc段重组蛋白作为保护性抗原制备的亚单位疫苗也在被证实可以给与小鼠和豚鼠百分百的保护力。

在天然状态下GP蛋白以一个三聚体为一个结构单元镶嵌在病毒膜上，三聚体的保持对于EBOV-GP蛋白功能和免疫原性的保持有着重要的作用。GP蛋白是一个高度糖基化修饰的蛋白，在GP1上存在着聚糖帽(Glycan Cap)和黏蛋白样区(mucin like domain，MLD)两个高度糖基化修饰的区域。在病毒入侵的过程中会由组织蛋白酶B/L的切割切除Glycan Cap和mucin like domain两个高度糖基化修饰的糖帽使其RBS与宿主细胞上的NCP1受体结合，激发GP2上的融合loop发生变构，介导病毒的入侵。

研究表明EBOV-GP蛋白的糖基化修饰区域，还与病毒吸附、蛋白质折叠、空间构象的维持是紧密相关的，而且往往参与抗原表位的构成，以N563位的N-糖基化修饰为例，突变N563位的N-糖基化修饰位点后，可以完全解除与中和抗体KZ52的结合。埃博拉包膜蛋白GP的糖基化修饰同一般的糖基化修饰蛋白一样，其糖基化修饰主要有N-连接的糖基化修饰和O-连接的糖基化修饰两种类型，而且GP蛋白的这些糖基化修饰几乎全部集中于Glycan Cap和mucin like domain这两个高度糖基化修饰的区域，Glycan Cap的糖基化修饰全为N-连接的糖基化修饰，而mucin like domain除了含有几个N-糖基化位点以外还含有大量的O-连接糖基化修饰位点，完全糖基化修饰之后的mucin like domain区域其分子量和空间体积大小都与缺失mucin like domain区域的GP蛋白相当。Osvaldo Martinez等通过研究发现切除mucin like domain的GP蛋白与全长的GP蛋白相比，诱导小鼠产生的抗体滴度差异较为显著，但是其血清中中和抗体的效价却是相当的，说明小鼠产生的针对mucin like domain区域多为非中和抗体(Osvaldo M,Lee T,Nirupama M,et al.Impact of Ebola Mucin-Like Domain on Antiglycoprotein Antibody Responses Induced by Ebola Virus-Like Particles[J].The Journal of Infectious Diseases,2011,204:S825–S832)。

糖蛋白的典型特征就是其在表达的过程中会产生糖基化修饰，而蛋白质的糖基化修饰特别是较为复杂的糖基化修饰都是在真核细胞中进行的，所以在选择表达系统时应该选用真核表达系统来表达。现有的针对埃博拉出血热预防用疫苗的基于埃博拉病毒GP蛋白的蛋白类疫苗的研究全是在细胞表达系统或原核表达系统里进行的。而毕赤酵母作为最简单常用的真核表达系统之一，有着培养周期短、培养条件简单、成本低、适宜于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可以进行蛋白质翻译后修饰加工这些典型的优势，但其分泌效率特别是对于分子量较大的蛋白的分泌效率要低于细胞平台，而且酵母菌有着十分厚实坚固的细胞壁，在对胞内蛋白的纯化时难度要比细胞平台大。目前未见有用酵母制备具有糖基化修饰与三聚体结构的埃博拉病毒糖蛋白的报导。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备具有成熟肽结构和三聚体结构且拥有糖基化修饰的埃博拉病毒三聚体糖蛋白突变体的方法。本发明中所述的埃博拉病毒糖蛋白均为埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)。

本发明所提供制备埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法，可包括如下步骤：

(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；

(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述博拉病毒糖蛋白突变体；

所述博拉病毒糖蛋白突变体为缺失了黏蛋白样区域(mucin like domain，MLD)和C-端穿膜区(TM)的博拉病毒糖蛋白。

获得编码所述博拉病毒糖蛋白突变体的基因的方法具体可为全基因合成法、PCR融合法或分片段缺失后片段融合法。

其中，所述酵母可为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母GS115。

其中，所述博拉病毒可为苏丹型埃博拉病毒(Sudan Ebolavirus)、扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire Ebolavirus)、科特迪瓦型埃博拉病毒(Coted’Ivoire Ebolavirus)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo Ebolavirus)或雷斯顿型埃博拉病毒(Reston Ebolavirus)。

当然，将本发明的方法用于与埃博拉病毒关系密切的马尔堡病毒(Marburg virus)也属于本发明的保护范围。

在步骤(2)中，进行所述培养的过程中，还包括向培养体系中加入体积百分比为0.5％的甲醇的步骤，目的是为了诱导所述博拉病毒糖蛋白突变体的表达。每12小时加入一次甲醇，持续到72小时止。

在步骤(2)中，进行所述破碎的方法可为物理方法、生物方法或化学方法。

其中，所述物理方法具体可为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体可为酶消化裂解法；所述化学方法具体可为碱裂解法。

在步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的粗提液的步骤。

其中，所述去污剂可为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂。所述离液剂具体可为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体可为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体可为脱氧胆酸盐；所述两性离子去污剂具体可为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-1-烷磺酸。

在本发明的一个实施例中，具体为向破碎后的体系中加入终浓度为如下的各物质：8M尿素、50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液、500mM NaCl、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油。

在步骤(2)中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤。

在本发明中，所述纯化具体为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析。

其中，所述亲和层析介质具体可为Chelating Fast Flow或Ni-NTA；所述凝胶排阻层析介质具体可为Sephadex G25、Superdex 200或Superose6凝胶预装柱；所述离子交换层析具体可为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述阳离子交换层析介质具体可为SOURCE 30S、Sepharose Fast Flow SP或CM Fast Flow；所述阴离子交换层析介质具体可为SOURCE 30Q Fast Flow。

在本发明的一个实施例中，进行所述亲和层析时，采用的介质具体为Chelating Fast Flow；采用的柱平衡液(A液)组成如下：6M尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(B液)组成如下：：6M尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、500mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)5％所述B液和95％所述A液，(2)50％所述B液和50％所述A液，(3)100％所述B液，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白突变体)所在的梯度洗脱液为50％B洗脱液(即50％所述B液和50％所述A液)。

在本发明的一个实施例中，进行所述凝胶排阻层析时，采用的介质具体为Sephadex G25；采用的流动相组成如下：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。

在本发明的一个实施例中，进行的所述离子交换层析具体为阳离子交换层析，所采用的介质具体为SOURCE 30S；采用的平衡液(A液)组成如下：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；采用的洗脱液(B液)组成如下：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，和1M NaCl，余量为水。所用洗脱梯度为：(1)5％所述B液和95％所述A液，(2)15％所述B液和85％所述A液，(3)30％所述B液和70％所述A液，(4)50％所述B液和50％所述A液，(5)100％所述B液，(6)100％0.5M NaOH，％表示体积百分含量。目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白突变体)主要所在的梯度洗脱液为15％B洗脱液(即15％所述B液和85％所述A液)。

在步骤(1)中，编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因具体可为如下(b1)-(b6)中任一所示DNA分子：

(b1)序列表中序列2的第29-1468位所示DNA分子；

(b2)序列表中序列2的第1-1468位所示DNA分子；

(b3)序列表中序列2的第29-1507位所示DNA分子；

(b4)序列表中序列2的第1-1507位所示DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的DNA分子杂交且编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的DNA分子；

(b6)与(b1)-(b5)任一限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的DNA分子。

序列2全长1507bp。其中，第29-1507位为CDS区，第29-1486位为所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的编码序列，第1469-1483位为人为加入的五个氨基酸G的编码序列，第1484-1489位为人为加入的限制性内切酶SalI的识别序列，第1490-1507位为人为加入的6His标签的编码序列。

本发明中，序列2所示基因是按照毕赤酵母偏好密码子进行密码子优化后的基因。

利用以上方法制备得到的埃博拉病毒糖蛋白突变体也属于本发明的保护范围。

采用该方法制备获得的埃博拉病毒糖蛋白突变体具有成熟肽结构和三聚体结构且拥有糖基化修饰。

所述埃博拉病毒糖蛋白突变体分子量大于150KD。

进一步，本发明中制备得到的所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的氨基酸序列具体为如下(a1)或(a2)中任一：

(a1)序列表中序列3的第33-480位；

(a2)序列表中序列3的第33-493位。

其中，序列3的第1-32位为信号肽；第33-480位为所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的成熟肽序列；第481-485位为人为加入的五个氨基酸G；第486-487位为人为加入的限制性内切酶SalI的识别序列编码的氨基酸；第488-493位为人为加入的6His标签。

如下(A)或(B)所述的应用也属于本发明的保护范围：

(A)所述“编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因”和酵母在制备所述埃博拉病毒糖蛋白突变体中的应用；

其中，所述酵母可为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母GS115。

(B)所述埃博拉病毒糖蛋白突变体在制备埃博拉出血热预防用疫苗中的应用。

本发明还提供了一种埃博拉出血热预防用疫苗。

本发明所提供的埃博拉出血热预防用疫苗，其活性成分为所述埃博拉病毒糖蛋白突变体。

所述疫苗可以包含佐剂或不含佐剂。

所述佐剂可为弗氏佐剂或铝佐剂，如Al(OH)₃。所述弗氏佐剂在所述疫苗中的占比可为50％；所述铝佐剂(如Al(OH)₃)在所述疫苗中的占比可为10％。其中，％表示体积百分含量。

本发明还保护下述任一生物材料：

A)蛋白质，其氨基酸序列为如下(a1)-(a5)中任一：

(a1)序列表中序列3的第33-480位；

(a2)序列表中序列3的第33-493位；

(a3)序列表中序列3的第1-480位；

(a4)序列表中序列3的第1-493位；

(a5)将(a1)-(a4)任一限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。

B)编码A)中所述蛋白质的基因；

C)含有II)中所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述基因为如下(b1)-(b6)中任一所示DNA分子：

(b1)序列表中序列2的第29-1468位所示DNA分子；

(b2)序列表中序列2的第1-1468位所示DNA分子；

(b3)序列表中序列2的第29-1507位所示DNA分子；

(b4)序列表中序列2的第1-1507位所示DNA分子；

(b5)在严格条件下与(b1)-(b4)任一限定的DNA分子杂交且编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的DNA分子；

(b6)与(b1)-(b5)任一限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的DNA分子；

所述生物材料在制备埃博拉出血热预防用疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，用本发明制备的埃博拉病毒糖蛋白突变体所制备的埃博拉出血热预防用疫苗，可以诱导小鼠产生显著的针对埃博拉病毒GP糖蛋白的抗体滴度。用本发明方法制备的埃博拉出血热预防用疫苗，具有工程菌株构建周期短、培养周期短、培养条件简单、成本低、适宜于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可以进行蛋白质翻译后修饰加工这些典型的特点，使其非常适合在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。

附图说明

图1为EBOV-GPΔMLDΔTM基因片段1、2的获取。

图2为Chelating FF Ni亲和层析粗纯化EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白色谱图

图3为Chelating FF Ni亲和层析粗纯化EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白鉴定图。左图为SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，右图为Western blot结果图。箭头处为目的蛋白。

图4为Chelating FF Ni亲和层析50％B洗脱液用Sephadex G25脱盐色谱图。

图5为SOURCE 30S阳离子交换层析精细纯化EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白色谱图。

图6为SOURCE 30S阳离子交换层析精细纯化EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图。

图7为EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白PNGaseF酶切分析。左图为SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，右图为Western blot结果图。

图8为EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白N-端测序分析。A、EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白N-端测序结果图；B、EBOV-GPΔMLDΔTM基因编码的1-50aa。

图9为EBOV-GP GPΔMLDΔTM蛋白Superdex200凝胶柱分离。A、Western blot Anti GP；B、SDS-PAGE考马斯亮蓝染色。

图10为Superose6凝胶分离效果图。A、669KD蛋白标准品；B、440KD蛋白标准品；C、人IgG(150KD)；D、BSA(67KD)；E、EBOV-GPΔMLDΔTM。

图11为lg Mr标准曲线。

图12为Superose6凝胶分离样品蛋白电泳及印迹分析。A、Superose6凝胶分离色谱图；B、SDS-PAGE考马斯亮蓝染色；C、Western blot Anti GP；D、Western blot Anti Human IgG。1、12-13mL；2、13-14mL；3、14-15mL；4、15-16mL；5、16-17mL；6、17-18mL；7、18-20mL。

图13为EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白一免抗体滴度。*表示P＜0.05，**表示P＜0.001。弗氏佐剂：弗氏佐剂组；Al(OH)₃：氢氧化铝组；BLANK：阴性对照组。

图14为EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白二免抗体滴度。*表示P＜0.05，**表示P＜0.001。弗氏佐剂：弗氏佐剂组；Al(OH)₃：氢氧化铝组；BLANK：阴性对照组。

图15为EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白三免抗体滴度。*表示P＜0.05，**表示P＜0.001。弗氏佐剂：弗氏佐剂组；Al(OH)₃：氢氧化铝组；BLANK：阴性对照组。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pPICZ-αA质粒为Invitrogen公司产品；毕赤酵母GS115为Invitrogen公司产品；EBOV-GP Antibody，Rabbit PAb为北京义翘神州生物科技有限公司产品；Human cells表达的扎伊尔型EBOV-GP蛋白为北京义翘神州生物科技有限公司产品；Goat Anti Rabbit IgG(H+L)X-Adsorbed-HRP为Sigma公司产品；Goat Anti Mouse IgG(H+L)X-Adsorbed-HRP为Sigma公司产品；Goat pAb to Human IgG(H+L)HRP为abcam公司产品；BstBI、BglII、BamHI、SalI、NotI等限制性内切酶为NEB公司产品；Q5热启动高保真DNA聚合酶为NEB公司产品；T4-DNA连接酶为NEB公司产品；碱性磷酸酶CIAP为NEB公司产品；Ifusion连接试剂盒为Clone tech公司产品；PNGaseF肽N-糖苷内切酶F为NEB公司产品。

实施例1、埃博拉病毒糖蛋白突变体表达载体的构建

一、埃博拉病毒糖蛋白基因的获取

通过人工合成的方式，合成了EBOV-GP蛋白全长基因(>KM034549|Zaire ebolavirus isolate Hsapiens-wt/SLE/2014/ManoRiver-EM095B|Homo sapiens|01-Jun-2014)，并按照毕赤酵母偏好密码子进行密码子优化，同时在合成EBOV-GP基因时为了合成得到能够表达全长的GP蛋白的基因，人为的在其发生RNA编辑的位置加入了一个“A”，合成工作委托给南京金瑞斯生物科技有限公司进行合成，所述序列详见序列表中序列1。

二、埃博拉病毒GP糖蛋白突变体表达载体的构建

1、设计并合成引物：

2、EBOV-GPΔMLDΔTM基因片段1、片段2的获取

以南京金斯瑞公司合成返回的质粒作为模板(当然也可以以序列1为模板)，以GP-infu 5和GPΔMLD-infu mediate R为上下游引物，用Q5热启动超保真DNA聚合酶PCR扩增EBOV-GPΔMLDΔTM基因片段1。以金斯瑞公司合成返回的质粒作为模板(当然也可以以序列1为模板)，以GPΔMLD-infu mediate F和GPΔΔTM-infu3为上下游引物，用Q5热启动超保真DNA聚合酶PCR扩增EBOV-GPΔMLDΔTM基因片段2。

PCR扩增获得的产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离(图1)，利用离心柱型的DNA片段回收试剂盒进行片段回收。

3、用限制性内切酶BstBI、SalI酶切pPICZ-αA质粒，得到线性化pPICZ-αA质粒。

4、infusion试剂盒连接步骤2获得的EBOV-GPΔMLDΔTM基因片段1、2和步骤3获得的线性化pPICZ-αA质粒，得到重组质粒，将其命名为pPICZ-GPΔMLDΔTM。

将pPICZ-GPΔMLDΔTM测序，该重组质粒为将序列表中序列2所示的含有埃博拉病毒GP糖蛋白突变体的DNA分子(EBOV-GPΔMLDΔTM)插入pPICZ-αA载体AOX1启动子之后得到的重组载体。

实施例2、埃博拉病毒GP糖蛋白突变体的表达、纯化及鉴定

一、重组酵母的构建和筛选

将实施例1构建好的表达质粒pPICZ-GPΔMLDΔTM约10μg用限制性内切酶BglII进行单点线性化，酶切体系(50μL)如下：表达质粒pPICZ-GPΔMLDΔTM 43μL；BglII 2μL；10×NEB3.1buffer 5μL。

37℃酶切1h后取样，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，分析质粒是否线性化完全。分离结果显示线性化完全的酶切产物用离心柱型的DNA片段回收试剂盒进行片段回收，最后洗脱线性化的质粒时用30μL纯水洗脱。

以下步骤中制备酵母电转化感受态细胞的方法参照Invitrogen公司的相关操作手册和“Molecular Cloning，A laboratory Manual(Fourth Edition)”，2012Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York。

将毕赤酵母GS115划线于YPD平板上复苏，分离单克隆。挑取复苏的单克隆，接种到YPD液体培养基中，试管培养至其对数期后取1ml转接到100ml YPD摇瓶中25℃200rpm摇床培养至OD_600nm≈1.3-1.5。以上摇瓶培养的培养液1500g 4℃离心5min弃上清，用等体积的预冷的蒸馏水重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。再用等体积的预冷的1M山梨醇重悬后1500g 4℃离心5min，弃上清，重复此步骤3次。以上经3次蒸馏水和3次山梨醇洗涤的菌体沉淀，添加适量的1M山梨醇至刚好能吸起来后，100μl每只分装到无菌离心管中，-80℃保存。

线性化的重组质粒电转酵母。取一只制备好的酵母感受态细胞，置冰上放置5min左右，待溶解后取80μL的感受态细胞与20μL上一步线性化得到的质粒进行预混后转入预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min。按照酵母电转手册要求，2kV电压电击后迅速加入900μL预冷的1M山梨醇，转入一只洁净试管中，置25℃培养箱中静置2小时。之后再加入1ml无抗生素添加的YPD液体培养基，置25℃，200rpm摇床培养3-4小时。将以上摇床培养得到的菌液，取300μL涂布于筛选抗性为Zeocin的YPD平板，25℃温箱倒置培养60-72h。

待所涂平板长出单克隆后，随机挑取8个单克隆穿刺接种至新的YPD/Zeocin的平板上，25℃温箱倒置培养。待穿刺菌落长出来后，接种至3ml的YPD液体培养基中，25℃，200rpm摇床培养，待YPD菌液长浓后，按照5％(体积百分含量)的接种量转接到3ml BMGY(配方：酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，100mM pH6.0的磷酸盐缓冲液，13.4g/L的YNB，4×10^-4g生物素/L，1％甘油)，培养基中25℃200rpm摇床培养，48小时后每12小时补加一次甲醇(补加量为0.5％，体积百分含量)。诱导72h后，12000rpm，3min收集菌体。

以上经72小时甲醇诱导后所收集的菌体，加1/5体积的水和适量的玻璃珠，漩涡震荡破碎，破菌液4000rpm，2min离心取上清利用抗EBOV-GP蛋白的特异性抗体western blot筛选出能够表达目的蛋白的阳性克隆。

Western Blot步骤大致如下：(1)10％的SDS-PAGE胶分离样品；(2)将SDS-PAGE胶上的样品转印到PVDF膜上；(3)5％的牛奶封闭液封闭转印有目的蛋白的PVDF膜，室温封闭1小时；(4)转到用5％的牛奶以1:4000的稀释度稀释一抗(EBOV-GP Antibody，Rabbit PAb)孵育2小时；(5)PBST洗涤5min，清洗5次；(6)转到用5％的牛奶以1:10000的稀释度稀释二抗(Goat Anti Rabbit IgG(H+L)X-Adsorbed-HRP)孵育1小时；(7)PBST洗涤5min，清洗5次；(8)添加Pro-light HRP Chemiluminescent Kit，显色。检测到分子量大小约为67KD的特异性条带即为阳性克隆。

二、重组埃博拉病毒糖蛋白GP突变体的表达和纯化

1、重组酵母菌培养表达

挑取步骤一鉴定得到的阳性克隆接种到YPD液体培养基中，25℃，200rpm培养约48小时。再转接至YPD液体摇瓶培养基100mL中，接种量为1％(体积百分含量)，25℃，200rpm培养至菌密度OD600_nm＞10。以上培养得到的OD600_nm＞10的菌液，以5％(体积百分含量)的接种量转接到BMGY培养基(配方同上)中，25℃，200rpm培养24小时后加入体积百分比为0.5％的甲醇诱导目的蛋白的表达，每12小时诱导一次，诱导72小时候离心收集菌体。

2、埃博拉病毒GP突变体糖蛋白的纯化

(1)取经甲醇诱导72小时，摇瓶培养的菌液1L，8000rpm离心20min收集菌体。用300ml纯水重悬菌体，高压均质仪以600bar的压力匀浆3次，取得的匀浆液中补加8M尿素、50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液、500mM NaCl、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油(其中各物质的浓度为在匀浆体系中的终浓度)，室温搅拌溶解3小时，12000rpm离心20min后取上清。

(2)对以上溶解上清调pH7.5后用Chelating Fast Flow层析介质鳌合Ni亲和层析进行粗纯化。纯化所用柱平衡液(A液)：6M尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、10mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；洗脱液(B液)：6M尿素、500mM NaCl、50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液、500mM咪唑和5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。所用洗脱液由A液和B液组成，洗脱梯度为5％B、50％B和100％B，％表示体积百分含量。

结果如图2、图3(图2为色谱图，图3左为还原型SDS-PAGE蛋白电泳结果，右为利用抗EBOV-GP蛋白的特异性抗体Western blot检测埃博拉病毒突变体糖蛋白的结果)所示，可见目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白GP突变体)所在的梯度洗脱液为50％B洗脱液。

(3)步骤(2)中检测到富集有目的条带的50％B梯度洗脱样品利用Sephadex G25脱盐处理，所用流动相为20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水。收集洗脱峰。色谱图如图4。

(4)经Sephadex G25脱盐处理得到的样品，再经一步Source 30S阳离子交换层析进行进一步的纯化。纯化所用柱平衡液(A液)：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油，余量为水；洗脱液(B液)：20mM pH6.2的磷酸盐缓冲液、6M尿素、5％(体积百分含量)的甘油和1M NaCl，余量为水。按照以下梯度进行梯度洗脱，所用洗脱梯度为：(1)5％所述B液和95％所述A液，(2)15％所述B液和85％所述A液，(3)30％所述B液和70％所述A液，(4)50％所述B液和50％所述A液，(5)100％所述B液，(6)100％0.5M NaOH，％表示体积百分含量。结果如图5、图6(图5为色谱图，图6为还原型SDS-PAGE蛋白电泳图)，根据电泳条带分子量大小，确定目的蛋白(埃博拉病毒糖蛋白GP突变体)主要所在的梯度洗脱液为15％B洗脱液。

3、埃博拉病毒GP突变体糖蛋白的鉴定

(1)糖基化修饰鉴定

用PNGaseF酶切处理分析糖基切除前后蛋白的分子量变化，以分析步骤2(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白，具体步骤如下：取步骤2(4)中纯化得到的糖蛋白样品90μL，加入10μL的10×糖蛋白变性缓冲液，沸水浴10min使糖蛋白充分变性。然后，在含有1％(体积百分含量)NP40的1×NEB GlycoBuffer 2反应缓冲液中，37℃水浴酶切2小时，同时设置不加酶的对照组。

具体酶切体系如下：

将酶切处理后的样品进行还原SDS-PAGE检测，结果如图7所示(左为考马斯亮蓝染色，右为Western blot检测)。

图7中，PNGaseF代表肽N-糖苷酶F；EBOV-GPΔMLDΔTM+PNGaseF代表步骤2(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白用PNGaseF酶切处理；EBOV-GPΔMLDΔTM代表步骤2(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白未做酶切处理的阴性对照；M代表蛋白分子量标志物。图7表明制备得到的EBOV-GP突变体蛋白未用PNGaseF酶切时分子量约为67KD，PNGaseF酶切处理后分子量下降为约52KD，与为被糖基化的EBOV-GP突变体成熟蛋白理论分子量(51130Da)一致。说明制备得到的EBOV-GP突变体蛋白是被糖基化修饰的糖蛋白。

(2)成熟肽序列鉴定

步骤2(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白，经蛋白质N-端测序分析。鉴定目的蛋白是否确为EBOV-GP突变体蛋白，同时也分析其信号肽在翻译过程中是否被加工切除。结果如图8所示(A为蛋白质N-端测序结果图谱，B为EBOV-GP突变体基因编码的1-50aa)，步骤(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白N-端5个氨基酸残基依次为IPLGV与理论上EBOV-GP突变体蛋白加工切除信号肽后的成熟肽N-端序列一致。说明步骤2(4)制备的蛋白，是具有成熟肽序列的EBOV-GP突变体蛋白。

(3)分子大小测定

步骤2(4)制备的EBOV-GP突变体蛋白样品，利用透析脱盐脱尿素进行蛋白复性，这里采用的是梯度透析的方式来进行所用梯度分别为：含4M尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水；含3M尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水；含2M尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水；含1M尿素，5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水；最终透析至不含尿素，含5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水中。

天然状态下GP蛋白是以三聚体的形式存在的，为了验证以上得到的目的蛋白是否也形成了三聚体结构，所以选用Superdex200型凝胶柱(φ1.0×30cm)对纯化得到的样品进行分离分析鉴定。所用流动相为含有5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水。在对EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白进行分离时加入人IgG标准品和BSA标准品作为内参。从第6mL开始收集洗脱液，以1mL为一段，分段收集。收集得到的样品利用SDS-PAGE和蛋白印迹进行分析，结果如图9所示，结果显示目的蛋白的洗脱在第8-13mL且主要集中于第9-11mL中(图9中A和B)。而人IgG标准品主要于11-13mL洗脱液中(图9中B)，BSA标准品主要在13-15mL被洗脱(图9中B)。说明非变性状态下EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白的分子量要比分子量为150KD的IgG还要大。

基于以上结果，初步认为制备得到的EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白以聚体的形式存在。为了达到更好的分离效果，选用了更适合大蛋白和蛋白复合体纯化的更高分辨率的Superose6Increase凝胶过滤预装柱进行分析，所用流动相为含有5％(体积百分含量)甘油，0.05％(体积百分含量)Tween 20的生理盐水。在利用Superose6凝胶对纯化得到的EBOV-GPΔMLDΔTM蛋白进行分析时，并分别以669KD蛋白标准品、440KD蛋白标准品、人IgG(150KD)和BSA(67KD)为外标测定其洗脱体积(Ve)。结果如图10，结果显示EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白的Ve为15.57mL(图10中E)，介于440KD标准品(Ve 14.65mL，图10中B)与人IgG(Ve 16.11mL图10中C)之间。以Ve为横坐标lgMr为纵坐标绘制得到R²＝0.9184的lgMr关于Ve的标准曲线y＝-0.234x+8.9058(图11)。推算出EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白的分子量为185KD左右，约为单体67KD的三倍。为了进一步验证结果的可靠性，选用与推算得到的分子量接近的人IgG标准品作为内参与EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白混合后用Superose6凝胶柱分离，分段收集洗脱液，经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果显示人IgG标准品变性还原后轻重链大小分别约为26KD和55KD，其洗脱集中于16-18mL(图12，泳道5，泳道6)，而EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白还原变性后分子量约为67KD，其洗脱集中在14-16mL(图12，泳道3，泳道4)，略早于人IgG标准品被洗脱，说明在非变性状态下EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白的分子量略大于人IgG。利用抗GP蛋白的特异性抗体和抗人IgG的特异性抗体进行Western blot分析(图12中C和D)，进一步证实了该结果。

以上结果表明我们所纯化得到的EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白，主要以三聚体的形式存在。

实施例3、EBOV-GPΔMLDΔTM重组蛋白的免疫原性

制备得到的重组EBOV-GP突变体蛋白，分别利用弗氏佐剂(第一次免疫时用完全弗氏佐剂，第二次和第三次免疫则用不完全的弗氏佐剂，每次给药前与目的蛋白配伍且均需经超声乳化)和Al(OH)₃佐剂(每次给药前12小时与重组蛋白配伍，使其充分吸附)按照5μg重组蛋白/只的剂量皮下注射免疫7周龄的BalB/C小鼠，缓冲体系为生理盐水，每只小鼠的给药剂量控制在100μL体积(其中佐剂占比为：弗氏佐剂组佐剂占比50％，Al(OH)₃佐剂组佐剂占比为10％，％表示体积百分含量)，每个佐剂组10只，同时设置相同数量小鼠的只注射等剂量佐剂的阴性对照组。分别于第0天、第14天和第28天进行三次免疫给药，并分别在第10天(初次免疫后10天)、第24天(二免后10天)和第38天(三免后10天)进行眼眶采血，以上所采集的小鼠血样，于37℃温箱放置两小时后，室温条件下12000rpm离心5min分离出血清，小心吸取分离出来的小鼠血清后用ELISA法检测免疫后诱发的抗体滴度。

ELISA法测抗体滴度步骤如下：

1、包被抗原：包被所用的抗原为利用人源细胞表达的Zaire型埃博拉病毒的GP蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)。包被抗原用包被液配制成1μg/mL浓度的抗原包被液后，在酶联板的每孔100μL上述抗原包被液，置于37℃温箱孵育2小时；

2、将酶联板中的抗原包被液倒去，扣干净之后用300μL/孔的PBST洗涤酶联板5遍，每次5分钟；

3、将酶联板中的PBST洗液倒去，扣干净之后每孔加入300μL的封闭液(5％牛奶)，37℃温箱孵育封闭1小时；

4、将酶联板中的封闭液倒去，扣干净之后用300μL/孔的PBST洗涤酶联板5遍，每次5分钟；

5、用5％牛奶梯度稀释免疫后的小鼠血清作为一抗；

6、将步骤4酶联板中的PBST洗液倒去，扣干净之后加入100μL步骤5中配制的一抗，37℃温箱孵育1小时；

7、将酶联板中的一抗溶液倒去，扣干净之后用300μL/孔的PBST洗涤酶联板5遍，每次5分钟；

8、将步骤7酶联板中的PBST洗液倒去，扣干净之后加入100μL用5％牛奶按照1:5000的稀释比例配制的山羊抗鼠IgG H+L HRP(二抗)溶液，37℃温箱孵育1小时；

9、将二抗倒去，扣干净之后用300μL/孔的PBST洗涤酶联板5遍，每次5分钟；

10、将步骤9酶联板中的PBST洗液倒去，扣干净之后每孔中加入100μL的显色液进行显色，标准显色时间15分钟；

11、待显色完成后，每孔中加入50μL的终止液(2M H₂SO₄)终止显色；

12、终止显色后用酶标仪，采用490nm和630nm双波长进行读数，测定其OD值。

读数得到的结果，在进行分析时，以只注射相同剂量佐剂的阴性对照最初稀释梯度的OD_490nm/630nm值作为基数，以大于等于2.1倍阴性对照最初稀释梯度的OD_490nm/630nm值为判定阳性标准，各受试小鼠大于等于2.1倍阴性对照最初稀释梯度OD_490nm/630nm值的最大稀释倍数即为对应受试个体所产生的抗体滴度。在实验过程中，我们得到的阴性对照OD值接近为0，为了保证实验数据的可靠性，在本研究中我们引入了OD_490nm≥0.1作为一条附加的阳性判断标准，以此时的最大稀释倍数作为对应受试个体所产生的抗体滴度。

第一次免疫给药，记做第0天，于第10天眼眶采血检测抗体滴度。ELISA结果显示一免后氢氧化铝佐剂组未能检测到抗体的产生，弗氏佐剂组产生了较好的抗体滴度，其抗体滴度为1:100(p<0.05，CV 0.88)，不过阳性率仅为60％(图13)。

第14天进行第二次免疫给药，给药剂量与第一次相同，在第24天时眼眶采血检测抗体滴度。ELISA结果显示两次免后氢氧化铝佐剂组和弗氏佐剂组均能检测到抗体的产生，其阳性率均为100％，弗氏佐剂组产生的抗体滴度为1:16800(p<0.001，CV0.096)明显高于氢氧化铝佐剂组的抗体滴度1:260(p<0.001，CV 0.236)(图14)。

第28天进行第三次免疫给药，给药剂量与前两次相同，在第38天时眼眶采血检测抗体滴度。ELISA结果显示三次免后氢氧化铝佐剂组和弗氏佐剂组均能检测到抗体的产生，其阳性率均为100％，且所产生的抗体滴度明显升高。弗氏佐剂组产生的抗体滴度为1:58800(p<0.001，CV 0.088)，氢氧化铝佐剂组的抗体滴度1:800(p<0.001，CV 0.109)(图15)。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法

<130> GNCLN170584

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2050

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ttcgaaacga tgggtgttac tggtattttg cagcttccta gagacagatt caagagaact 60

tcctttttcc tttgggttat tatccttttt cagagaactt tttctattcc attgggtgtt 120

atccataatt ctacacttca agtttccgat gtcgacaagc ttgtctgtag agataaattg 180

tcttccacta accagcttag atccgttgga ttgaatcttg aaggaaacgg agtcgctact 240

gacgttccat cagtcacaaa gagatggggt ttcagaagtg gagttccacc taaagttgtc 300

aattacgaag ctggagagtg ggccgaaaac tgttacaact tggagattaa gaaacctgat 360

ggatcagaat gcttgccagc tgcccctgac ggtattagag gatttccaag atgtagatac 420

gttcataaag tcagtggtac tggaccttgc gcaggagatt ttgctttcca caaagagggt 480

gctttctttt tgtacgacag attggcctct actgttatct acagaggaac tacattcgcc 540

gaaggtgttg tcgcattctt gatccttcca caagcaaaga aagatttctt ttcttctcac 600

ccattgagag agcctgttaa cgctacagaa gacccttctt ccggttacta ttcaaccact 660

attagatacc aagctactgg ttttggaacc aatgaaactg agtacttgtt cgaggttgat 720

aaccttacat atgtccagtt ggaatctaga tttaccccac aattcttgct tcagttgaat 780

gagactattt atgcttctgg aaagagatcc aatacaaccg gaaagttgat ctggaaagtt 840

aaccctgaaa ttgacactac aatcggagag tgggctttct gggaaactaa gaaaaacttg 900

acaagaaaga ttagatcaga agagttgagt tttactgcag tttccaatgg accaaaaaac 960

atttctggtc aatccccagc tagaacctca agtgatcctg agactaatac cactaacgaa 1020

gaccataaga ttatggcttc agaaaattct tccgccatgg ttcaagtcca ttctcagggt 1080

agaaaagcag ctgtttccca ccttacaacc ttggctacaa tttctacctc ccctcaacca 1140

cctactacaa agactggtcc agataattct actcacaaca cacctgttta caaattggac 1200

atttccgaag ctactcaagt cggacagcat cacagaagag cagataatga ctcaaccgct 1260

agtgatactc cacctgccac cactgccgca ggtccattga aggctgagaa tacaaacacc 1320

tcaaaaagtg cagattcttt ggaccttgct acaaccactt cacctcaaaa ctatagtgaa 1380

actgctggta acaataacac ccatcaccag gatactggag aagagtccgc ctcaagtgga 1440

aagttgggac ttattactaa tacaatcgcc ggtgttgcag gattgattac aggtggaaga 1500

agaaccagaa gagaggttat cgtcaacgcc caaccaaagt gtaaccctaa cttgcattac 1560

tggacaaccc aggatgaagg tgctgccatt ggattggctt ggattccata cttcggtcct 1620

gcagctgagg gaatttatac tgaaggtttg atgcacaatc aagacggtct tatctgcgga 1680

cttagacagt tggccaacga gactacacaa gcattgcagt tgtttttgag agccaccact 1740

gaattgagaa ctttctctat ccttaacaga aaggcaatcg atttcttgct tcaaagatgg 1800

ggtggaactt gtcatatttt gggtccagat tgttgcatcg aacctcacga ctggacaaag 1860

aacattaccg ataagatcga ccaaatcatc catgatttcg ttgacaagac cttgccagat 1920

caaggagata atgacaactg gtggactggt tggagacagt ggattcctgc tggaatcgga 1980

gtcactggag tcattattgc cgttatcgcc ttgttctgta tctgtaagtt cgtcttttaa 2040

tagcggccgc 2050

<210> 2

<211> 1507

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atcaaaaaac aactaattat tcgaaacgat gggtgttact ggtattttgc agcttcctag 60

agacagattc aagagaactt cctttttcct ttgggttatt atcctttttc agagaacttt 120

ttctattcca ttgggtgtta tccataattc tacacttcaa gtttccgatg tcgacaagct 180

tgtctgtaga gataaattgt cttccactaa ccagcttaga tccgttggat tgaatcttga 240

aggaaacgga gtcgctactg acgttccatc agtcacaaag agatggggtt tcagaagtgg 300

agttccacct aaagttgtca attacgaagc tggagagtgg gccgaaaact gttacaactt 360

ggagattaag aaacctgatg gatcagaatg cttgccagct gcccctgacg gtattagagg 420

atttccaaga tgtagatacg ttcataaagt cagtggtact ggaccttgcg caggagattt 480

tgctttccac aaagagggtg ctttcttttt gtacgacaga ttggcctcta ctgttatcta 540

cagaggaact acattcgccg aaggtgttgt cgcattcttg atccttccac aagcaaagaa 600

agatttcttt tcttctcacc cattgagaga gcctgttaac gctacagaag acccttcttc 660

cggttactat tcaaccacta ttagatacca agctactggt tttggaacca atgaaactga 720

gtacttgttc gaggttgata accttacata tgtccagttg gaatctagat ttaccccaca 780

attcttgctt cagttgaatg agactattta tgcttctgga aagagatcca atacaaccgg 840

aaagttgatc tggaaagtta accctgaaat tgacactaca atcggagagt gggctttctg 900

ggaaactaag aaaaacttga caagaaagat tagatcagaa gagttgagtt ttactgcagt 960

ttcccatcac caggatactg gagaagagtc cgcctcaagt ggaaagttgg gacttattac 1020

taatacaatc gccggtgttg caggattgat tacaggtgga agaagaacca gaagagaggt 1080

tatcgtcaac gcccaaccaa agtgtaaccc taacttgcat tactggacaa cccaggatga 1140

aggtgctgcc attggattgg cttggattcc atacttcggt cctgcagctg agggaattta 1200

tactgaaggt ttgatgcaca atcaagacgg tcttatctgc ggacttagac agttggccaa 1260

cgagactaca caagcattgc agttgttttt gagagccacc actgaattga gaactttctc 1320

tatccttaac agaaaggcaa tcgatttctt gcttcaaaga tggggtggaa cttgtcatat 1380

tttgggtcca gattgttgca tcgaacctca cgactggaca aagaacatta ccgataagat 1440

cgaccaaatc atccatgatt tcgttgacgg tggtggtggt ggtgtcgacc atcatcatca 1500

tcatcat 1507

<210> 3

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg

1 5 10 15

Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser

20 25 30

Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val

35 40 45

Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg

50 55 60

Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro

65 70 75 80

Ser Val Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val

85 90 95

Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu

100 105 110

Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly

115 120 125

Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr

130 135 140

Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe

145 150 155 160

Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe

165 170 175

Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp

180 185 190

Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp

195 200 205

Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly

210 215 220

Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr

225 230 235 240

Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu

245 250 255

Asn Glu Thr Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys

260 265 270

Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp

275 280 285

Ala Phe Trp Glu Thr Lys Lys Asn Leu Thr Arg Lys Ile Arg Ser Glu

290 295 300

Glu Leu Ser Phe Thr Ala Val Ser His His Gln Asp Thr Gly Glu Glu

305 310 315 320

Ser Ala Ser Ser Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly

325 330 335

Val Ala Gly Leu Ile Thr Gly Gly Arg Arg Thr Arg Arg Glu Val Ile

340 345 350

Val Asn Ala Gln Pro Lys Cys Asn Pro Asn Leu His Tyr Trp Thr Thr

355 360 365

Gln Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly

370 375 380

Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Thr Glu Gly Leu Met His Asn Gln Asp

385 390 395 400

Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gln Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala

405 410 415

Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr Thr Glu Leu Arg Thr Phe Ser Ile

420 425 430

Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe Leu Leu Gln Arg Trp Gly Gly Thr

435 440 445

Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr

450 455 460

Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp Gln Ile Ile His Asp Phe Val Asp

465 470 475 480

Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp His His His His His His

485 490