东方铃蟾生物活性肽、基因及其在制药中的应用的制作方法

本发明涉及一种东方铃蟾(Bombina orientalis)生物活性肽Bombinin-8及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。

背景技术：

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。传统的化学治疗虽然能抑制恶性肿瘤的发展，但在化疗过程中使用的抗肿瘤药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有较大的杀伤性毒副作用。在临床使用中，还可能产生肿瘤耐药性现象。因此，研究高效、低毒的新型抗肿瘤药物，已经成为当今肿瘤治疗中一个亟待解决的重要问题。肝癌是世界十大恶性肿瘤之一，我国肝癌人群发病率在恶性肿瘤中为第二位。肝癌复发率高，传统化疗药物对肝癌治疗及愈后效果差，寻求新型高效的抗肿瘤药物是肝癌综合治疗的重要环节。

抗肿瘤活性多肽是一类新型的抗癌药物，以相对分子量小、低毒性、高活性、易于穿透肿瘤细胞等特点，受到医药研究者的广泛关注。与传统化学药物相比，抗肿瘤多肽对肿瘤细胞具有更高的选择性，能够以多种方式给药、易于多途径吸收、且不易产生耐药性。

抗生素广泛用于治疗敏感菌所致的感染。但是，由于人们对抗生素的不合理使用，导致许多细菌产生了耐药性，甚至有产生超级细菌感染的风险，最终无药可治。所以人们一直在寻找可以代替传统抗生素的药物。多肽类抗生素具有分子量小，理化性质稳定，抗菌谱广等优点，在较低的浓度下可以快速杀死多种细菌，不易产生耐药性，非常有希望成为新一代抗生素。

两栖动物相对于其他物种具有特殊的生态地位。特殊的生存环境使得其皮肤及相应腺体进化为该物种特有的代谢系统和机体防御系统，这与其分泌物中所蕴含的许多结构新颖、功能独特的天然活性物质不无关系。在众多针对两栖动物的研究中，以蟾蜍作为生物原料资源，提取天然活性产物的研究最为活跃。蛋白和多肽是蟾蜍毒素中富含的一类天然活性产物，主要包括：抗菌肽、铃蟾肽、缓激肽、血管紧张素样肽等。除了以往关注的抗菌消炎的功能之外，近些年研究发现，蟾蜍毒素活性多肽物质，还具有抗肿瘤的特性，可以选择性杀伤肿瘤细胞。

东方铃蟾(Bombina orientalis)为盘舌蟾科铃蟾属的两栖动物，广泛分布于我国东北三省及河北、内蒙、山东等地，并于2000年被中国国家林业局列入国家保护有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录。由于东方铃蟾地域分布的局限性，国际上对东方铃蟾分泌物中的活性物质的及其功能性研究的报道尚未多见。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的同时具有抗菌抗肿瘤活性的东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8及其在制药中的应用。

为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8是东方铃蟾(Bombina orientalis)皮肤分泌多肽基因编码的一直链多肽，分子量2437.93道尔顿，等电点10.5，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且该氨基端序列末端氨基酸的羧基被酰胺化，即该氨基酸序列可具体体现为：

Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe-NH₂(GIGSAILSAGKSIIKGLAKGLAEHF-NH₂)

氨基酸序列酰胺化是部分抗菌肽的典型特征，对其抗菌活性具有重要作用。

编码东方铃蟾生物活性肽的基因由560个核苷酸组成，其5’端至3’端序列具体见SEQ ID NO:2，其中，编码东方铃蟾生物活性肽成熟肽的基因为第130-204位核苷酸。

本发明的东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8具有广谱抗菌活性和抑制三种肝癌细胞生长增殖的作用，可以用于制备抗肿瘤及抗病原微生物感染药物。

本发明同时运用基因克隆和氨基酸测序两种方法得到东方铃蟾生物活性肽的全序列，使结果更具有准确性和科学性；东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8为单链多肽，由25个氨基酸组成，结构简单，方便化学合成及基因工程制备；该多肽具有广谱抑菌活性，能够抑制革兰氏阴性菌Escherichia coli，革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus和真菌Candida albicans的生长；该多肽还具有显著的抗肿瘤活性，在微摩尔剂量下即可抑制三种人体肝癌细胞的生长增殖。

附图说明：

图1为利用半制备液相对东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8分离纯化的色谱图，箭头所示为分离的Bombinin-8；

图2为不同浓度东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8对人体肝癌细胞(Hep G2)的生长抑制作用图；

图3为不同浓度东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8对人体肝癌细胞(SK-HEP-1)的生长抑制作用图；

图4为不同浓度东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8对人体肝癌细胞(Huh7)的生长抑制作用图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明的具体实施方式作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

东方铃蟾皮肤分泌物的获取：

选取成年东方铃蟾(4-6cm长，雌雄各半，n＝10)，使用超纯水将其冲洗干净后轻轻按摩铃蟾背部皮肤表面。施加温和按摩持续数分钟，从背部皮肤腺体分泌出大量白色粘稠泡沫状渗出物，用超纯水将皮肤分泌物冲洗至干净容器中，将其在液氮中速冻，在冷冻干燥器中冻干后储存于-20℃。

实施例2

东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8的分子克隆

1.东方铃蟾分泌物中RNA的提取

两栖类动物在分泌防御性分泌物时，背部腺体处皮肤会发生轻微破损，皮肤细胞中的RNA会同时释放到分泌物中，多次实验证明在分泌物中可检测到两栖动物的RNA，因此我们采用在分泌物中分离RNA的方法提取东方铃蟾皮肤总RNA，具体步骤如下：(1)东方铃蟾分泌物中RNA的提取采用TaKaRa公司的MiniBEST Universal RNA

Extraction试剂盒。

(2)首先称取5mg冻干东方铃蟾皮肤分泌物，加至含有500μL裂解液Buffer RL的1.5mL灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。将裂解液在12000rpm，4℃离心5分钟，小心吸取上清液到新的1.5mL RNase Free Tube中。

(3)将上清液转移入到gDNA Eraser Spin Column中。12000rpm，离心1分钟。保留滤液，加入与液体等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。

(4)将混合液全部转入RNA Spin Column中，12000rpm，离心1分钟，弃滤液。分别使用500μL的Buffer RWA和600μL的Buffer RWB洗涤RNA Spin Column。

(5)将RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50-200μL的RNase Free H₂O，室温静置5分钟，12000rpm离心2分钟洗脱RNA。

2.东方铃蟾皮肤cDNA文库第一链的合成

(1)采用CLONTECH公司的 RACE 5’/3’Kit合成东方铃蟾皮肤cDNA文库的第一链。

(2)在PCR管中加入3μL步骤1中提取的RNA和1μL 3’CDS引物，将试剂混匀并短暂离心，在70℃加热3分钟，42℃加热2分钟，12000rpm离心10秒。

(3)向上述PCR管加入以下试剂：4μL 5×First-Strand Buffer、0.5μL 100mM DTT、1μL dNTPs(20mM),0.5μL 40U/μL RNase Inhibitor、2μL 100U SMART Reverse Transcriptase,将试剂混匀并短暂离心，在42℃加热90分钟，70℃加热10分钟。合成的单链cDNA用一定体积的Tricine-EDTA Buffer稀释后，保存于-20℃。

3.通过RACE技术克隆东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8

(1)引物设计：根据已报道编码铃蟾类多肽cDNA的5’端非翻译区保守序列设计正向引物，其序列为5’-GATGAWKTTTAAGTACATARTTGCRGT-3’(W＝A/T；K＝T/G；R＝A/G)，另一扩增引物为CLONTECH公司的Advantage^TM 2PCR Kit提供的通用引物(UMP)。

(2)PCR扩增：向PCR管中加入下列试剂：2.6μL PCR-Grade Water、1μL 10X Advantage 2PCR Buffer、0.2μL 10mM 50×dNTP Mix、0.5μL NUP、0.5μL 20μM 3’/5’Primer Mix、0.2μL 50×Advantage 2Polymerase Mix以及5μL单链cDNA模板。在PCR仪中按以下程序进行扩增：94℃1分钟；30个循环，每个循环包括：94℃30秒，56℃30秒，72℃3分钟；72℃10分钟，反应完成后PCR产物保存于4℃。

(3)PCR产物纯化：取2μL PCR产物于琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，扩增成功的PCR产物使用CLONTECH公司Gel Extraction with the NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up试剂盒进行纯化。

4.PCR产物的连接和转化

(1)采用Promega公司的-T Easy Vector System将PCR产物连接到质粒载体中。

(2)将下列试剂加入到PCR管中：2.5μL 2×Rapid Ligation Buffer、0.5μL-T Easy Vector(50ng)、1.5μL PCR products、0.5μL T4DNA Ligase。用移液枪将反应试剂混匀，在室温放置1小时，然后4℃过夜孵育，连接产物保存在4℃。

(3)50μL JM109高效感受肽细胞转移至含有2μL ligation产物的EP管中，混匀后冰浴2分钟。在42℃加热47秒，然后立即在冰上放置2分钟。

(4)加入SOC培基(950μL)，在37℃恒温摇床中振摇培养2.5小时。

(5)取130μL细菌培基涂布于含有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB培基上，在37℃过夜培养。挑选出培养基上生长的白色菌落继续涂布在新的LB/ampicillin/IPTG/X-Gal培养基上，在37℃过夜培养。

(6)用灭菌枪头将白色单菌落挑出，溶解在20μL超纯水中，100℃加热5分钟，再冰浴5分钟。离心去除细胞碎片后的上清液即为含有目的片段的质粒DNA。

5.扩增质粒DNA

以质粒DNA为模板，采用Promega公司的Taq DNA聚合酶对质粒中插入的DNA片段进行扩增。步骤如下：

(1)将以下试剂加入到PCR管中：12.5μL Green Master Mix、2.5μL M13F引物(20μM)、2.5μL M13R引物(20μM)、2.5μL质粒DNA模板，5μL无核酶水。

(2)按照如下参数进行PCR扩增：94℃1分钟；30个循环，每个循环包括：94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟；72℃10分钟。PCR产物储存于4℃。

6.经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，挑取含有目的片段的PCR产物送到基因测序公司测序，将测序结构与GeneBank数据库中序列进行比对。利用软件Chromas和Vector-NTI，将获得的DNA序列转换成氨基酸序列，根据开放阅读框(ORF)序列保守区的特点推断成熟肽区。

基因测序结果表明编码东方铃蟾生物活性肽的基因由560个核苷酸组成，从5’端至3’端序列具体见SEQ ID NO:2。

编码东方铃蟾生物活性肽成熟肽的基因为第130-204位核苷酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

综上可得，东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8编码的基因序列表为：序列长度560个核苷酸碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：链状结构，序列种类：cDNA，来源：东方铃蟾(Bombina orientalis)皮肤组织。

实施例3

东方铃蟾生物活性肽的分离纯化和氨基酸序列测定：

1.东方铃蟾生物活性肽的分离纯化

将实施例1中东方铃蟾冻干皮肤分泌物溶解于一定体积的Buffer A(TFA/water(0.05/99.95,V/V))中，3000g离心10分钟去除不溶物。通过反相半制备HPLC配置C5色谱柱对上清液进行分离纯化，以0-70％乙腈为梯度进行洗脱，由Frac-920馏分自动收集器收集样品洗脱液，间隔时间1分钟。结果如图1所示，箭头所指为东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8。

2.东方铃蟾生物活性肽的结构测定

采用快原子轰击质谱法测定多肽分子量，等电聚焦电泳测定等电点，氨基酸自动测序仪测定氨基酸序列结构。

测序结果表明东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8为直链多肽，分子量2437.93道尔顿，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，且其羧基末端氨基酸酰胺化，即该氨基酸序列可具体表现为：

Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe-NH₂(GIGSAILSAGKSIIKGLAKGLAEHF-NH₂)

实施例4

东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8的功能性研究

1.东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8抑制细菌生长的作用

本发明采用微量肉汤稀释法测定多肽抑菌活性。使用接种环从Muellar-Hinton Agar(MHA)固体培养基上挑取已复苏的单个带检菌落，接种于Muellar-Hinton Broth(MHB)液体培养基中，37℃孵育16-20h。扩增后的菌液用MHB培基进行稀释，制备出相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液。再将上述菌液以1：500稀释，加至灭菌96孔板中，每孔100μL。将提前配制好的一系列浓度的Bombinin-8加至菌液中，密封后置生化培养箱中孵育24h，于550nm波长处测定吸光度。能完全抑制受试菌生长的最低多肽浓度即为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。取10μL多肽处理后的菌液涂布于MHA固体培养基上过夜培养，第二天观察培养基上细菌的生长情况，细菌无明显生长的给药浓度被认定为最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)。供试菌株来源于中国药用微生物菌种保藏管理中心，实验重复三次，取平均值，结果见表1。

表1东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8的抑菌作用

由表1可知，东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用。

2.东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8的抗肿瘤作用

将指数生长期的人体肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7细胞分别接种于96孔板中，培养24h后加入不同浓度(0.1、0.5、1、2.5、5、10、20μM)的东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8，继续培养6，24及48h，再加入20μL MTT溶液，共同孵育4h，然后除去MTT溶液，加入150μL DMSO溶解蓝紫色结晶，用酶标仪在490nm波长处测定各孔OD值，计算各给药浓度的抑制率及IC50，以评价Bombinin-8对不同肝癌细胞体外增殖的抑制作用。实验重复三次，取平均值，结果见图2、图3和图4。

实验结果显示东方铃蟾生物活性肽Bombinin-8可显著抑制三种人体肝癌细胞的生长增殖，且呈剂量依赖性。经统计学计算后，得到Bombinin-8在48h对肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7细胞增殖活性的半数抑制浓度(IC50)分别为3.75μM、0.76μM以及3.91μM。其中，对肝癌SK-HEP-1细胞的抑制作用最为明显。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，本发明所述技术领域的技术人员可以做出若干推演或替换，都应视为本发明的保护范围。