与细胞膜标记相关的亲和肽的制作方法

本发明属于生物工程制药技术领域和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对细胞膜具有高亲和力多肽及其应用，例如用于纳米药物在体检测中。

背景技术：

细胞膜或称质膜，在细胞群体的“社会行为”中起着重要作用，诸如细胞间通讯、细胞运动和移行、细胞粘附、与细胞外环境进行物质交换、被机体免疫机制所识别等，无不与质膜的功能有关。恶性肿瘤细胞的许多生长特性及侵袭转移能力亦均与质膜的改变有关。

与正常细胞相比，肿瘤细胞膜化学组成的一个重要特点是膜磷脂中单不饱和脂肪酸，主要是油酸的含量相对增高，而饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量相对减少。因此膜的流动性增强，硬脂酸与油酸都是18个碳原子的脂肪酸，硬脂酸经酶的作用转化为油酸，肿瘤细胞膜中油酸增加，故饱和指数降低。

细胞内的物质运输调控是重大科学难题，也是科学研究的前沿热点问题。药物在细胞和亚细胞内的吸收、转运、分布、结合、代谢、排泄等细胞药代动力学参数的考察对于药物的治疗效果评价具有重要意义。故迫切需要将传统的药代动力学研究从“宏观”的血浆药物浓度深入到“微观”的靶细胞/亚细胞层面，研究药物在靶细胞上的转运速率、胞内或细胞器内蓄积量、亚细胞分布与靶向结合，与药物的靶部位活性进行相关分析，建立PK-PD模型，能够更准确地预测药物在人体的药效。

用于示踪细胞增殖时，随着细胞的每一次分裂，细胞膜荧光染料能准确地标记细胞的变化，清晰可视化研究药物在靶细胞的转运变化，以及胞内细胞器的积累。.

细胞膜标记技术早在1985年就已经进行了初步发展，DiO/DiD/DiL/DiR属于长链羰花青荧光染料，是一种亲脂性膜染料，它在水溶液中荧光极弱，然而当用稀释的染液标记细胞时，DiO/DiD中的烷基链嵌入细胞膜的磷脂双份子层中，并激发出强烈的绿色/红色荧光，DiO的最大激发波长是489nm，最大发射波长是501nm，DiD的最大激发波长是644nm，最大发射波长是665nm。DiO在最早的研宄中被用来示踪神经细胞。用于示踪细胞增殖时，随着细胞的每一次分裂，膜染料DiO/DiD的荧光能准确地平分到两个子代细胞上。DiO/DiD染料具有低荧光变异性、良好的标记稳定性以及极少发生细胞间转移这些优点，此外，DiO/DiD并不影响标记细胞及后代细胞的增殖，并能通过建立细胞分裂标准曲线定量检测体内外细胞分裂情况。特别是Dil，广泛应用于固定和非固定的组织与细胞中，进行顺行或逆行的神经示踪分析。Dil不会影响细胞的活力、生长以及基本生理特性。Dil标记运动神经元，可在培养基条件下持续跟踪长达四周，在体内长达一年。染料通过在质膜中的缓慢横向扩散均匀标记神经元，0.2～0.6mm/每天/固定标本，在活体组织里，可以达到6mm/每天。经过醛固定的组织，Dil的扩增可以持续长达1～2年。一般情况下未标记的染料不会向非标记的细胞转移，除非质膜被破坏，比如切片部位。。

较长的荧光衰减时间，在体检测时，只能用于长时间标记观察，药物代谢时间往往是短时间内完成，长时间的细胞荧光标记不利于机体的正常代谢。Di系列染料虽具有低荧光变异性、良好的标记稳定性、较低细胞毒性以及极少发生细胞间转移这些优点，但在药物进行细胞代谢时，标记的细胞功能的完整性受到影响。为了设计用于细胞内药物监控的细胞膜标记分子，生物分子多肽因其生物活性、标记方便、荧光时效性，成为新的细胞膜标记的选择。

本发明公开了能高度亲和细胞膜的多肽，这些多肽能高效结合细胞膜，从而靶向各种细胞，最终达到标记细胞的效果。这些多肽可制备成药物进入细胞监控的评价工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供能够与细胞膜相关的亲和多肽，使其能够对细胞进行标记，可用于制备新型的药物评价检测系统。

本发明的目的还在于提供包含或部分包含SEQ ID NO：1序列多肽或蛋白的分子作用方式，其结合细胞膜，标记在细胞膜表面。

本发明的另一个目的在于提供一种含有SEQ ID NO：1的膜标记试剂，作为体内外检测纳米药物进出细胞速率的有效成分。

本发明所述的SEQ ID NO：1肽是由酸性氨基酸和烷酸结构修饰和优化得到，其具有天然氨基酸序列，免疫原性小，生物活性好。

为了检测本发明多肽的药理活性，体外实验通过荧光染料罗丹明B对多肽进行标记，体内实验通过近红外染料ICG-Der-02对多肽进行标记，以检测其对细胞膜的体内外靶向性。在体外细胞亲和力实验和摄取实验中，本发明的SEQ ID NO：1肽展现出了其良好的对细胞膜的靶向能力。在体外细胞毒性实验中，本发明的SEQ ID NO：1肽未表现出对细胞的毒性。在体内组织成像和组织切片均能反映，本发明的SEQ ID NO：1肽具有良好的在体细胞膜标记特性。

本发明所述的SEQ ID NO：1肽包含多种变形模式，详细发明进行了4种衍生肽的验证，其中H4肽，即修饰多肽为赖氨酸正十六烷酸，效果最佳，作为发明实例。

详细发明内容如下：

一、标记体外实验荧光染料

本发明应用于体外细胞实验的荧光染料为罗丹明B(Rhodamine B)，简称RhB，分别与本发明H4肽通过酰胺键连接，简称为H4-RhB，连接方法具体为取1mg罗丹明B(详见参考文献：Cao，J.，et al.，Fast clearing RGD-based near-infrared fluorescent probes for in vivo tumor diagnosis.Contrast Media Mol Imaging，2012.7(4)：p.390-402)溶于1ml PBS(pH为7.4)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)(摩尔比Rhodamine B∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5)，避光反应4h，活化。分别称取1mmol H4肽溶入含有荧光染料罗丹明B的1ml PBS缓冲液(pH7.4)中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液(pH7.4)作洗脱液，得到纯化的H4-RhB，-20℃储存备用。

二、体外细胞亲和力实验

将培养好的人肝癌HepG2细胞和人肝细胞L02从12孔板上洗脱后重悬于PBS溶液，分别与罗丹明B标记的H4肽(10umol/L)共孵育2小时，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度，荧光强度越强证明对细胞的亲和力越强。当探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高。体外亲和力实验结果显示浓度相同的标记了RhB的H4肽的探针分别与HepG2和L02细胞孵育后，在HepG2细胞中H4肽探针平均荧光强度为62，在L02细胞中H4肽探针平均荧光强度为24，空白染料平均荧光强度为4，结果表明这些探针在与HepG2和L02细胞亲和力强弱对比中，本发明H4的强度最大。

三、体外细胞标记实验

将培养好的人肝癌细胞HepG2，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人脑胶质瘤细胞U87和正常肝细胞L02转移到共聚焦皿中，过夜孵育后分别加入相同浓度的罗丹明B标记的H4肽(40umol/L)，加入DiO标记的作为阳性对照，37℃孵育2小时后，加入染核试剂12μg/mL Hochest33342染色，最后用激光共聚焦显微镜观察细胞内探针的摄取情况。在人脑胶质瘤U87细胞中(图3所示)，H4肽探针显示出了很强的荧光强度，这一结果说明本发明多肽探针对细胞膜有靶向性且无特异性。

四、体外细胞毒性实验

U87MG细胞、MDA-MB-231细胞与正常肝L02细胞，待长至90％以上时，用0.25％胰蛋白酶液消化后，制备成单细胞悬液(完全生长培养基)，以3000个细胞/孔铺96孔板，于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养，在培养24h后换为1％FBS的低血清培养液，然后加入不同浓度梯度的H1-H4肽，使他们的终浓度为5，10和20μM。结果显示(图6所示)H1-H4肽对这几种细胞的存活率均在80％以上，说明H1-H4肽对这些细胞基本无毒。

五、活体细胞标记实验

本发明应用于体内动物实验的英冠染料为红外有机染料ICG-Der-02，与H4通过酰胺键连接，简称ICG-Der-02-H4，连接具体方法为取2mg ICG-Der-02(详见参考文献)溶于1ml PBS(pH为7.4)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)(摩尔比ICG-Der-02∶EDC∶NHS＝1∶1.5∶1.5)，避光反应4h，活化。称取1mmol H4肽溶于含有荧光染料ICG-Der-02的1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液(pH＝7.4)作洗脱液，得到纯化的ICG-Der-02-H4，-20℃储存备用。在注射后0-6小时，进行活体组织成像，肌肉细胞膜均有较清晰显示，如图8所示。24h后进行切片仍可观察到荧光信号，48h无荧光信号。

将标记了RhB的H4肽进行肾组织、肌肉组织、肿瘤组织切片染色孵育，均能对固定组织进行细胞膜标记如图7所示。

综上所述，本发明的SEQ ID NO：1肽能够靶向到细胞膜上，而对细胞基本无特异性，并且SEQ ID NO：1肽对细胞基本无毒性。由此可见SEQ ID NO：1肽能够成为对细胞膜进行亲和荧光标记，检测药物进入细胞的情况。

本发明的SEQ ID NO：1肽可以优选用实施例1固相合成的方法制备。

本发明的多肽是细胞膜亲和肽。尽管不希望受理论约束，发明人相信本发明多肽的亲和作用是基于其脂肪酸链的插入作用和多肽分子电性。

药物组合物：可以任何本文所述适应症，包括抑制脑胶质瘤细胞、乳腺癌细胞增殖的治疗有效量，任选地与药学上可接受的添加剂、载体或赋形剂组合，来制备基于SEQ ID NO：1肽，或其药学上可接受的盐或前药，包括酯的药物组合物。治疗有效量可随着要治疗的感染或病况、其严重性、所应用的治疗方案、所用药剂的药动学性质以及受治疗的患者而改变。

本发明还包括药物制剂，该制剂包含作为活性成分的SEQ ID NO：1肽或其酯或前药或药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，是指一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂，助剂等，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。

本发明组合物的剂型可以是片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂、注射液等药剂学上常用的剂型。口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如填充物、稀释剂、润滑剂、分散剂以及粘合剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。

以上活性剂的剂量将因配方而异。

有益效果：

1.发明了一系列新的对细胞膜具有高亲和力的多肽，扩大了细胞膜标记分子的种类。

2.这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉。

3.这些肽均为首次报道，获取渠道方便。

4.本品用ICG-Der-02花菁类近红外荧光染料，其侧链上有一个羧基官能团，适用作生物荧光标记。通过EDC/NHS催化体系可以有效地将将其活化，与多肽分子链末端的氨基共价偶联形成酰胺键，构建ICG-Der-02-peptide分子探针，从而可使多肽带有明显的近红外荧光特性。

附图简要说明：

图1 H4肽质谱图

图2 H4肽液相纯化图

图3激光共聚焦细胞摄取实验观察罗丹明B标记的探针对U87MG细胞的摄取

图4流式细胞仪检测细胞亲和实验观察罗丹明B标记的探针对HepG2细胞的亲和力

图5流式细胞仪检测细胞亲和实验观察罗丹明B标记的探针对L02细胞的亲和力

图6体外细胞毒性实验考察多种肽对不同细胞的毒性

图7离体组织切片H4肽染色情况，蓝色为细胞核，红色为细胞膜

图8 H4肽活体细胞成像

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要说明的是，下述实施例仅是用于说明，而并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的教导所做出的各种变化均应在本申请权利要求所要求的保护范围之内。

实施例1

本发明多肽H4的合成过程

1：偶联

先将Fmoc-Arg-Rink amide MBHA resin(芴甲氧羰酰基-精氨酸-rink氨基树脂)0.33/2mmol6.06g溶胀于二甲基甲酰胺中，10ml/g树脂，接着用20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc保护基(以下称之为脱帽)，用二甲基甲酰胺洗涤脱帽子后的树脂，加入原料Fmoc-Lys(Boc)-OH 2.3g，缩合剂用HBTU 1.44g，反应时间30分钟，kaiser法检测，如检测结果为阴性，说明偶联反应完成，则接下去进行脱帽，时间30分钟，如检测结果仍为阳性，则说明偶联反应未完成或反应不完全，需要延长偶联时间或重新投料偶联，直至偶联反应完成。重复上述操作，依次偶联，完成所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的peptidyl resin，真空干燥箱里充分干燥。

2：树脂与肽的分离裂解

将120ml裂解液(10ml/g peptidyl resin)加入树脂中，25℃条件下，磁力搅拌2.5h后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液。将滤液缓慢滴加到10eq体积的冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后用高速离心机离心10min(4000rpm)，弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干燥8-10h，得到干粉粗品。

3：纯化

取上述干粉粗品1g，用0.1％三氟乙酸/水溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用高效液相进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。把合格的样品混合后旋蒸，最后用冻干机冻干，得到Arg Trp Arg Gly Gly Gly Gly Lys Xaa Lys Lys Xaa，纯度大于98％。

序列为：Arg Trp Arg Gly Gly Gly Gly Lys Xaa Lys Lys Xaa，其中Xaa为正十六烷酸修饰。

质谱图如图1，液相图如图2。

紫外光谱图中273nm处有肽的吸收峰。