本发明涉及基因工程技术领域，进一步涉及重组蛋白表达系统的构建技术，具体涉及一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法。
背景技术：
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。
目前，我国Ⅱ型糖尿病的患病率增长较快，据1979年在我国30万人口中的调查，糖尿病患病率为0.6％，1989年为2.02％，年均增长0.1％左右，1994年我国普查20万人口，患病率已上升为2.5％，目前20～75岁人群中糖尿病患病率约为3％左右。糖耐量低减患者不低于3％。一般而言，在我国富裕地区的糖尿病患病率高于贫困地区，城市高于农村，肥胖高于正常体重，高龄高于低龄。目前我国糖尿病发病率为1/1000左右，50岁以上的平均患病率为7％以上，40岁以下患病率随着年龄的增长而升高，患者高峰年龄在50～70岁。
我国患病率以北京、辽宁、宁夏、甘肃、云南、福建较高，据1979～1997年调查结果表明为全国之首，而新疆、贵州、山西较低。发病率较高的北京、辽宁与最低的贵州、新疆之间相差达10倍，城市发病率高于农村1～4倍，广西地区调查证明，产糖地区糖尿病患病率高于非产糖区2倍。
尽管多种治疗方法可以控制血糖浓度，但目前仍未实现糖尿病的根治。现有技术中，药物干预仍是糖尿病治疗的主要手段，其中以GLP-1类似物、DPPIV抑制剂等应用较为广泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein)，是指可诱导胰腺中β细胞增殖、进而促进胰岛素分泌的一类功能性蛋白，由于其不直接参与人体糖代谢机制，因此降糖作用较为温和，对人体副作用较小。然而，此类蛋白的规模化生产是目前制约其临床应用的直接技术问题，其中人源蛋白的获取较为困难，而其他生物来源的pBpp蛋白其药效及安全性又难以得到保障。此外，尽管具有确切的β细胞增殖诱导效果，但由于pBpp蛋白对胰岛细胞靶向性不高，因此在一定程度上影响了pBpp蛋白的药效。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法，以解决现有技术中缺乏一种pBpp蛋白表达系统的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是常规的在利用pBpp蛋白进行血糖调节的过程中，pBpp蛋白本身缺乏靶向性。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中pBpp蛋白表达菌株对哺乳动物血糖的调节效果难以得到准确的量化考察。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，该菌株是由以下方法制备的：
1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。
作为优选，步骤2)中pBpp蛋白表达基因与Abvec载体的连接是先经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到Abvec载体上。
作为优选，步骤4)所述的电转法包括以下步骤：取重组质粒Abvec-pBpp与所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。
作为优选，步骤4)所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于3～7ml LB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；
D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。
一种上述pBpp重组蛋白表达菌株制备pBpp重组蛋白的方法，包括以下步骤：取HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株，以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。
作为优选，HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。
作为优选，所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。
一种上述pBpp重组蛋白表达菌株的功能验证方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取小鼠，连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；
2)取pBpp重组蛋白表达菌株，以灌胃的方式对步骤1)所得的II型糖尿病模型小鼠给药，每次给药剂量为105～106CFU，每2天给药1次；每隔7天监测所述II型糖尿病模型小鼠的血糖变化。
本发明提供了一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法，该技术方案以斑马鱼粪便菌群DNA为模板，扩增得到pBpp表达基因，再利用Abvec质粒为载体，先于大肠杆菌TOP10中扩增质粒，而后采用电击转化的方式导入鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株。该技术方案依托于减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009胞内侵袭的特性，可携带pBpp蛋白靶向作用于胰岛β细胞，在保证pBpp蛋白高效表达的基础上提升其血糖调节作用。
在此基础上，为考察上述菌株的降糖效果，本发明建立了相应的功能验证方法，该方法先利用链脲佐菌素构建II型糖尿病模型小鼠，而后采用灌胃的方式进行活菌给药，以给药后小鼠血糖变化情况来对菌株的降糖效果进行分析。实验发现，本发明所提供的pBpp重组蛋白表达菌株可确切诱导胰腺中β细胞的增殖，从而对因胰岛β细胞损伤所导致的糖尿病起到治疗效果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
以下实施例中，所用到的E.coli Top10，减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，Abvec载体质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；所用到的限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA连接酶购自NEB公司；所用到的LB固体培养基和液体培养基由本实验室自行配制。
实施例1
1、pBpp重组蛋白表达菌株的构建
以斑马鱼粪便菌群DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.3所示的pBpp片段，命名为pBpp。
已获得的pBpp片段和质粒Abvec，经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Abvec(SEQ ID No.4)质粒中，重组质粒命名为Abvec-pBpp。
将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5ml LB中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100ml LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，制成VNP20009感受态分装后-80留存备用。
将已获得的重组质粒Abvec-pBpp电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，采用0.1cm电转杯，条件设置为：1.8kv 200Ω25uF，电转4.7ms；通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，命名为Abvec-pBpp-VNP20009。
2、pBpp重组蛋白表达菌株的功能验证
试剂配置：0.1M枸橼酸缓冲液(PH4.5)：0.1M枸橼酸液4.5mL(0.21014枸橼酸溶于10mL蒸馏水中)+0.1M枸橼酸钠液5.5mL(0.29412枸橼酸钠溶于10mL蒸馏水中)；7.5mg/mL无菌STZ溶液(取37.5mgSTZ溶于5mL枸橼酸缓冲液，与超净台0.22um滤器过滤，分装存于-20℃即可)(注意避光)
(1)剂量及给药方式：阳性组：50mg/kg/天STZ溶液；阴性组：与阳性组同等剂量枸橼酸缓冲液；
给药方式：腹腔注射；
(2)取12只健康雄性老鼠，观察24h，无异常后进行试验；小鼠随机分为2组，称重；第一次给药前饥饿处理24h，禁食不禁水；称重后，按照阳性组剂量换算后，与超净台中腹腔注射STZ药物，打完后，正常给予饲料，无菌水喂养，连续5天同一时间注射STZ药物；并于打完第3，7，10，14，21，28天用试纸测定小鼠空腹8h后的血糖和接着喂食2h后的血糖，若阳性组大于11.1mmol/L，则造模成功；
(3)造模成功后，每日灌胃Abvec-pBpp-VNP20009，灌胃105-106CFU/次，灌胃频率2天一次，正常饮食；阴性组，灌胃PBS作为对照；
(4)在第7天，第14天，第21天检测小鼠空腹8h后的血糖及接着喂食2h后的血糖，观察血糖有无下降；
实施例2
一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，该菌株是由以下方法制备的：
1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)中pBpp蛋白表达基因与Abvec载体的连接是先经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到Abvec载体上。
步骤4)所述的电转法包括以下步骤：取重组质粒Abvec-pBpp与所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。
步骤4)所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，35℃振荡培养10h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值为0.4；
D)冰浴15min后，离心取沉淀用1/8体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80体积预冷的、8％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80体积预冷的、8％(mL/mL)的甘油中。
应用上述pBpp重组蛋白表达菌株制备pBpp重组蛋白的方法，包括以下步骤：取HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株，以二者的细胞量为1:80的比例在细胞培养板中混合，培养4h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40h，而后破碎细胞收集上清。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
HEK293-T细胞的加入量为8000个/孔；HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380μL。
所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。
上述述pBpp重组蛋白表达菌株的功能验证方法，包括以下步骤：
1)取小鼠，连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；
2)取pBpp重组蛋白表达菌株，以灌胃的方式对步骤1)所得的II型糖尿病模型小鼠给药，每次给药剂量为105CFU，每2天给药1次；每隔7天监测所述II型糖尿病模型小鼠的血糖变化。
实施例3
一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，该菌株是由以下方法制备的：
1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤2)中pBpp蛋白表达基因与Abvec载体的连接是先经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到Abvec载体上。
步骤4)所述的电转法包括以下步骤：取重组质粒Abvec-pBpp与所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。
步骤4)所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：
A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；
B)挑取单菌落接种于7ml LB液体培养基中，39℃振荡培养14h；
C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值为0.6；
D)冰浴25min后，离心取沉淀用1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/120体积预冷的、12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/120体积预冷的、12％(mL/mL)的甘油中。
应用上述pBpp重组蛋白表达菌株制备pBpp重组蛋白的方法，包括以下步骤：取HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株，以二者的细胞量为1:120的比例在细胞培养板中混合，培养16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养56h，而后破碎细胞收集上清。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
HEK293-T细胞的加入量为12000个/孔；HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为420μL。
上述述pBpp重组蛋白表达菌株的功能验证方法，包括以下步骤：
1)取小鼠，连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；
2)取pBpp重组蛋白表达菌株，以灌胃的方式对步骤1)所得的II型糖尿病模型小鼠给药，每次给药剂量为106CFU，每2天给药1次；每隔7天监测所述II型糖尿病模型小鼠的血糖变化。
实施例4
一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，该菌株是由以下方法制备的：
1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；
2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；
3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；
4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgtcgagtc gaaccggtat gaacaagcgt aactggttgc tg 42
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtgctca ccgtacggcg gctcgtttca gtcaagtc 38
<210> 3
<211> 783
<212> DNA
<213> 天然序列（斑马鱼）
<400> 3
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cgc 783
<210> 4
<211> 4756
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300
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tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480
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gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2820
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