一种灵芝烯酸B的制备方法与流程

本发明属于天然药物
技术领域：
，具体涉及一种灵芝烯酸b的制备方法。技术背景灵芝烯酸b为三萜类化合物，cas号100665-41-6，分子式c30h42o7,分子量514.65028，分子结构式如下：灵芝三萜是灵芝的次级代谢产物，具有多种药理活性。文献报道，灵芝烯酸b在体外具有很强的抑制p388、bel-7402、sgc-7901、hela等多种肿瘤细胞的活性，进一步的深入研究表明，灵芝烯酸b有调节abcb1基因的作用，从而具有解决abcb1基因介导的多药耐药问题的潜力。通过文献检索，目前还没有发现灵芝烯酸b的制备方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种灵芝烯酸b的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)提取和富集灵芝烯酸b：将灵芝子实体加入乙醇溶液加热提取，提取液浓缩；浓缩液经大孔树脂乙醇梯度洗脱吸附后，进行减压浓缩。(2)高速逆流色谱法分离纯化制备灵芝烯酸b：用高速逆流色谱进行灵芝烯酸b分离，然后用高效液相色谱法分析检测，收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸b。具体地说，本发明的一种灵芝烯酸b的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)提取和富集灵芝烯酸b:将灵芝子实体加入5-10倍75-95％乙醇溶液加热50-70℃提取，每次1-3小时，重复2-3次。将提取液加热减压浓缩，浓缩液经过d101大孔树脂用60％乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸b的组分。(2)高速逆流色谱法分离灵芝烯酸b：溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，体积比为3-6:3-6:1-4:5-9，上为固定相，下为流动相；将富含灵芝烯酸b的组分用相溶液溶解并上样，高速逆流色谱流速范围1-3ml/min，转速范围700-900r/min，每4-10ml收集为一个馏分；然后用高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分，紫外检测波长为248nm；按出峰情况收集、浓缩、干燥，分离得到灵芝烯酸b。本发明考察了三种不同的大孔树脂(hz-818，hz-801和d-101)，分别用60％乙醇洗脱，以洗脱物的得率和用高效液相考察灵芝烯酸b的含量为考量，最终选择d101大孔树脂。依据大孔树脂、乙醇浓度的选择，请给出洗脱物的得率和用高效液相考察灵芝烯酸b的含量的具体数据。本发明考察了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系摸索，按照比例配好体系后充分震荡，分层后取上下相各2ml于试管中，加入含有灵芝烯酸b的组分样品少量，漩涡震荡，记录分层时间，待两相分层完毕后，吸取上下相各200ul于2ml离心管，放水浴锅上烘干溶剂后加1.5ml甲醇溶解，过膜后进行hplc测定，记录目标物质的峰面积，根据分配系数计算公式算k值，k值应在0.5～2.0之间。分配系数计算公式：k＝au/al式中：k为分配系数；au为上相峰面积；al为下相峰面积。依据正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系的比例的选择，给出灵芝烯酸b的k值。正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水灵芝烯酸b的k值5:5:2:91.505:5:3:92.025:5:3:82.035:5:4:90.78在hsccc分离中，转速和流速对高速逆流的分离效果会产生一定影响。针对流速的优化，低流速能提高分离效果，但相应的分离时间会加长，根据实验结果考察，流速在1-3ml/min之间，分离效果和分离时间比较适合。线圈转速对固定相的保留影响最大，而固定相保留率直接关系到分离效果的好坏，根据实验结果综合考量，转速范围在700-900r/min之间比较适合灵芝烯酸b的制备。依据转速和流速的选择，灵芝烯酸b的得率、纯度的具体数据如下：本发明以含有灵芝烯酸b的组分为分析样品，以灵芝烯酸b的理论塔板数，以及与邻近色谱峰的分离度为考察指标，建立高效液相色谱分析方法。供试子实体：沪农灵芝1号ganodermalucidum，由上海市农业科学院食用菌研究所提供。灵芝烯酸b标准品购自国家标准物质标准样品信息中心。d-101大孔树脂，净品级，天津海光化工有限公司。20l旋转蒸发仪：bc-r2001，上海贝凯生物化工设备有限公司；配用shb-b95型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。高速逆流色谱仪购自上海同田生物技术股份有限公司，仪器型号：tbe-300b。高效液相色谱仪为waters公司，仪器型号为2695-717-600e。(3)高速逆流色谱是一种无固定相载体的连续液-液分配色谱技术，与传统的色谱技术相比具有很多优势，利用该色谱技术来制备灵芝三萜化合物，不需要固态支持物作载体，不存在不可逆吸附，灵芝三萜的分离效率高、回收率高、分离时间短，此外，在制备过程中，样品分解率较低；溶剂流失也比较少，是一种经济实用获得灵芝三萜化合物的方法。采用本发明的方法制备灵芝烯酸b，成本低，污染小，操作简单，且灵芝烯酸b得率高，纯度高。附图说明：图1为实施例1的高速逆流色谱图图2为实施例1中获得的灵芝烯酸b的高效液相图图3为实施例2的高速逆流色谱图图4为实施例2中获得的灵芝烯酸b的高效液相图具体实施方法实施例1(1)取灵芝子实体50kg切片，投入到中试提取设备中，加入8倍体积的87％无水乙醇提取2次，第一次2h，第二次1h。提取温度均为65℃。将这两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热浓缩后再用20l旋转蒸发仪加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。将灵芝子实体提取物过d101大孔树脂洗脱，用60％乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸b的组分。(2)在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(5：5：2：9，v/v)两相溶剂系统。向高速逆流色谱仪中泵入上相(固定相)，待管路充满上相后，以转速900r/min转动主机。再以2ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为248nm。待两相达到平衡即基线稳定后，用流动相配制浓度为10mg/ml的样品20ml，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，检测波长为248nm。收集各个流分，用高效液相色谱法分析检测分离情况，并与灵芝烯酸b标准品作对比，收集合并含有灵芝烯酸b的馏分，并用高效液相面积归一法测得纯度为89.1％的灵芝烯酸b15.2mg。实施例2(1)取灵芝子实体50kg切片，投入到中试提取设备中，加入8倍体积的87％无水乙醇提取2次，第一次2h，第二次1h。提取温度均为65℃。将这两次的提取液合并，在蒸煮罐中加热浓缩后再用20l旋转蒸发仪加热浓缩，获得灵芝子实体提取物。将灵芝子实体提取物过d101大孔树脂洗脱，用60％乙醇洗脱，用3-5倍溶液体积洗脱。将洗脱组分浓缩，获得富含灵芝烯酸b的组分。(2)在分液漏斗中配制正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(5:5:2:9，v/v)两相溶剂系统。向高速逆流色谱仪中泵入上相(固定相)，待管路充满上相后，以转速900r/min转动主机。再以2ml/min流速泵入下相(流动相)，检测波长为248nm。待两相达到平衡即基线稳定后，用流动相配制浓度为20mg/ml的样品20ml，由进样阀进样，紫外检测器在线监测，检测波长为248nm。收集各个流分，用高效液相色谱法分析检测分离情况，并与灵芝烯酸b标准品作对比，收集合并含有灵芝烯酸b的馏分，并用高效液相面积归一法测得纯度为88.3％的灵芝烯酸b29.6mg。实施例3用高效液相色谱法以峰面积归一法检测试管中灵芝烯酸b的含量，将含量为88％以上的试管合并，旋转蒸发浓缩，再真空离心浓缩干燥，获得高纯度的灵芝烯酸b。实施例4灵芝烯酸b的高效液相色谱法色谱柱agilentzorbaxsb-aq(4.6mm×250mm，5μm)，流动相(a为0.01％冰醋酸，b为乙腈)梯度洗脱：0min，a：72％；25min，a：70％；50min，a：61％；60min，a：0％。进样量10μl；柱温30℃；检测波长248nm；流速：1ml/min。实施例5灵芝烯酸b的高效液相色谱检测中，利用二极管阵列检测器(dad)进行色谱峰的全波段扫描，从而确定峰的纯度。当发现峰不纯时，调整洗脱溶剂的条件，最终溶剂洗脱条件确定如实施例4。在该条件下，色谱图中呈现出两个色谱峰。出峰时间为31min的色谱峰即目标化合物灵芝烯酸b，其相对峰面积为88.3％-89.1％；出峰时间为37min的色谱峰为杂质峰，其相对峰面积为10.9％-11.7％。当前第1页12