一种甜灵芝发酵茶的制备方法及甜灵芝发酵茶的制作方法

专利名称：一种甜灵芝发酵茶的制备方法及甜灵芝发酵茶的制作方法
技术领域：
本发明属于药用真菌固体发酵技术领域，具体涉及一种甜灵芝发酵茶的制备方法及制备得到的甜灵芝发酵茶。
背景技术：
茶叶的有益作用一直受到普遍的关注。随着茶饮料的普及推广、茶叶生产和茶叶市场的快速发展，在茶叶种植和生产过程中，产生数量庞大的茶场修整枝叶和茶厂废碎茶末，抛之可惜甚至污染环境，用之无法或者效率低价值差，我国是产茶大国，这种浪费和环境污染问题在我国产茶大省云南、福建、浙江等地尤为突出。仅就云南省的调查结果，现有茶叶种植面积280万亩，年产茶叶10万余吨，每年自修整、采摘、加工过程中，约有30%即3万余吨成为废枝叶、茶末被遗弃，对价值较低的粗老茶鲜叶(粗老叶、秋冬修剪叶、废碎茶)进行精细加工，实现低档原料的深度开发和综合利用，变废为宝，对提高茶叶生产的经济效 益是十分必要的。灵芝俗称灵芝草、仙草、红芝、丹芝、木灵芝、菌灵芝、万年蕈，是非常珍贵的药用真菌，在分类学上属于非褶菌目灵芝菌科灵芝属。灵芝性微温，气特殊，味微苦涩。灵芝的主要有效成分有灵芝多糖、三萜类化合物、核苷酸、生物碱、氨基酸及微量元素等。灵芝作为中国传统的一种药用真菌，在我国有大量的人工栽培。从七十年代开始就有利用发酵工程的方法获得灵芝菌丝体制成适当剂型的报道。目前市场上已有多种灵芝茶产品，但是其中有的只有灵芝而没有茶叶，例如申请号为200910089464.3的申请提供了一种灵芝茶配方及其制备方法，申请号为201110124637. 8的申请提供了一种灵芝保肝茶及其制备方法；有的虽有茶叶和灵芝两种成分，却只是茶叶与灵芝简单的拼配，例如《灵芝茶的研制及其保健功能的研究》(周建芹等，食品科学，2004 (10) :123-125)，申请号为201010254567. 3的申请提供的一种复方灵芝保健茶；申请号为200910306557. 7的申请提供的灵芝岩茶及其加工工艺。也有一些技术文献涉及了采用灵芝和茶叶发酵工艺，例如林新坚等报道了以乌龙茶叶为原料采用灵芝发酵的初步研究，但该方法成本太高难以产业化(《灵芝发酵茶研制初报》，林新坚等，食用菌，2000 (05) 41);申请号为98104794.7的专利申请提供了一种灵芝发酵茶生产工艺，采用培养基配方为茶叶20 50%;麦皮或米糠2% 5%;水45 75%，在培养基上接种灵芝菌，在23 30°C范围内恒温培养，收取烘干菌丝得到。《灵芝菌在绿茶发酵中的应用》(邹礼根等)对灵芝菌在绿茶培养基和无茶培养基中摇瓶发酵时菌体生长和胞外多糖合成进行了对比研究但是现有技术涉及的技术方案使用的都是茶叶产品，成本较高，推广应用较难。应用菌种进行发酵理论上可以制备得到发酵茶，但针对不同菌种，采用不同的培养基发酵，其具体发酵工艺条件要求相差悬殊，各因素之间相互影响并最后影响发酵效果，总结针对性的整体技术方案对最终是否能成功制备得到发酵茶、并获得优良的发酵茶品质具有重要的意义。
尤其是针对茶青发酵一直是本技术领域的难题。茶青中富含醇类、醛类、多酚类以及无机物I、Cl、S等抑菌物质，同时其基质质地幼嫩，木质素、纤维素等含量相对较低，通常会抑制微生物正常生长代谢。现有灵芝茶技术都没有涉及直接利用茶青、以灵芝菌种制备发酵茶，更没有涉及价值较低的废茶青的再利用技术方案。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种甜灵芝发酵茶的制备方法，以废茶青为培养料，成功制备得到一种甜灵芝发酵菌茶，改善了茶叶的各种有效成分的含量对增加我国传统茶叶的种类，提高茶叶的综合利用率及增加经济效益具有重要的实际应用价值，解决了我国对价值较低或者茶叶种植生产过程中修剪产生的的粗老茶鲜叶(茶青)的浪费问题，真正实现了低档原料的深度开发和综合利用。本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的发酵茶以及食用方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现 本发明提供一种甜灵芝发酵茶的制备方法，以中叶茶青为主培养基，以茶青质量为基准，添加质量百分比为I % 5%的大豆粉为辅料，在初始pH自然、发酵温度25°C 30°C、发酵时间13 20天、甜灵芝菌种接种量为2 0Z0 5 %、含水量为60% 70% (质量百分比)的条件下发酵得到甜灵芝茶菌质，收集所述甜灵芝茶菌质烘干即得。优选的方案是，以中叶茶青为主培养基，以茶青质量为基准，添加质量百分比为2%大豆粉为辅料，在初始pH自然、发酵温度25°C、发酵时间16天、甜灵芝菌种接种量为4%、含水量为65%的条件下发酵得到甜灵芝茶菌质，收集所述甜灵芝茶菌质烘干即得。所述甜灵芝发酵茶的制备方法包括以下步骤(I)茶固体培养基的制备将茶青和大豆粉混匀后，调整水分含量和pH值，灭菌后备用；(2)将活化后的甜灵芝菌种接种到步骤(I)制得的茶固体培养基；(3)按照在初始pH自然、发酵温度25°C 30°C、发酵时间13 20天、甜灵芝菌种接种量为2% 5%、含水量为60% 70% (质量百分比)的条件下发酵培养；(4)收集茶菌质烘干即得所述甜灵芝发酵茶。步骤⑷所述烘干温度为55 65°C。本发明同时提供上述制备方法制备得到的甜灵芝发酵茶。所述的甜灵芝发酵茶，其特征在于含有以下重量百分比含量的有效成分总糖8 % 13 %，多糖3. 5 % 6. 0 %，茶多酚1% 3%，氨基酸0. 5% 2%，酚氨比1% 3%，咖啡碱1% 3%，蛋白质5% 10%。本发明提供所述的甜灵芝发酵茶优选的食用方法，将所述甜灵芝发酵茶磨碎为300iim 500iim的颗粒，以茶水比I : 80 I : 110冲泡，所述冲泡时间为2min 4min。甜灵芝(甜芝)是赤芝的一个变种，本发明经过大量的实验和分析总结，甜灵芝最适合在茶叶培养基上生长，本发明针对低价值或无价值的废弃茶青叶或粗老茶鲜叶，寻找到适宜的方法和工艺，利用药用真菌甜灵芝对其进行固体发酵，获得发酵菌茶。本发明方法中，步骤⑴选取茶树的中叶(4 7叶)，蒸汽杀青，干燥备用；可以采用茶场修整枝叶产生的粗老茶鲜叶，例如粗老叶、秋冬修剪叶、废碎茶和茶厂废碎茶末；优选将干燥后的茶树中叶材料用高速粉碎机粉碎至约250 u m大小的茶青粉颗粒备用。
步骤(I)制备茶固体培养基可将茶青和大豆粉辅料充分混匀后装入250mL的玻璃组培瓶中，每瓶装100 150克，稍压实，高压灭菌后备用。优选高压灭菌的压力为I. 5kg/cm2，温度为121°C，时间为45min ；步骤(2)所述接种在超净工作台上(或无菌条件下)接到装有茶固体培养基的组培瓶中；步骤(4)所述收集茶菌质待甜灵芝菌丝长满瓶后并再经过2 3天的培养，收集茶菌质，55 65 °C条件下烘干。将烘干的茶菌质磨碎至300 500 ii m大小的颗粒。将烘干磨碎物装入过滤棉纸包装袋，每袋2克，用来冲泡饮用。 本发明的甜灵芝发酵茶的优选冲泡条件是粉碎度300 500 iim，茶水比I : 80 I : 110，冲泡时间为21^11 4111111，冲泡温度85 1001。更为优选地，甜灵芝发酵茶的最佳冲泡条件是粉碎度400 iim，茶水比I : 100，泡茶时间3min。本发明的有益效果本发明首次采用药用菌甜灵芝直接固体发酵茶中叶，精确研究总结出针对性的发酵条件，保证了灵芝有效成分和茶的有效成分有机地结合起来，发挥茶叶与灵芝的保健功效，提高了茶叶的内在品质，既充分利用了茶树中废弃的中叶叶片，提高了茶树的利用率，使茶树中叶变废为宝，解决了目前我国茶场修剪叶和茶厂废碎茶末得不到有效利用而浪费的问题，又得到具有多种活性成分的甜灵芝发酵茶，丰富了茶叶产品。本发明确定了甜芝发酵茶青的培养体系。在现有的技术条件下，在发酵过程中以多糖含量、酚氨比、生长速度综合衡量了发酵进程和发酵指标，因辅料量、含水量、培养温度、接种量、PH值等因素对甜芝发酵菌质的多糖含量和酚氨比影响较小，本发明研究甜芝发酵茶青的培养条件时采用单因素试验，确定甜芝固体发酵茶青的最佳体系为以中叶茶青为主培养基，添加2%大豆粉辅料，初始pH自然、发酵温度25°C、发酵时间16d、接种量4%、含水量65%。低档茶青采用本发明技术方案经过甜芝固体发酵后，各种活性物质含量发生改变、关系趋向协调。甜芝发酵基质总糖含量下降了 43. 47%，多糖含量提高了 I. 61倍，茶多酚降低了 82. 87%，游离氨基酸降低了 25. 98%，咖啡碱下降了 24. 11%，酚氨比下降了76. 79%，水浸出物降低了 11. 26%，蛋白质含量降低了 16.60%。显然，产品的感官品质、滋味品质、保健品质都得到了显著提高。本发明在前述研究的成果上进一步总结得到甜芝菌质冲泡最佳条件，为灵芝发酵菌茶产品的工业化推广提供有利的技术基础。本发明方法简单易行，步骤简单，成本较低，可很好地利用茶叶种植生产过程中的粗老叶、秋冬修剪叶、废碎茶和茶厂废碎茶末，变废为宝，具有重要的工业推广应用意义。


图I硫酸-苯酚法测定茶菌质多糖葡萄糖标准曲线；图2没食子酸标准曲线；图3谷氨酸标准曲线；图4咖啡碱标准曲线；图5齐墩果酸标准曲线；图6牛血清白蛋白标准曲线；图7各菌种平均生长速度的比较；图8复筛菌种在PDA培养基和3%茶培养基上的生长速度比较；图9甜芝固体发酵菌质多糖和三萜的动态变化图，曲线I代表三萜，曲线2代表多糖；图10甜芝固体发酵菌质品质的动态变化图，曲线I代表酚氨比，曲线2代表茶多酚，曲线3代表氨基酸。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。除非特别说明，本发明采用的材料为市购常规材料，采用的方法为本技术领域常规方法。实施例I一、实验材料及仪器I、主要菌种及其来源本实施例在长期大量的实验结果结合理论分析的基础上，选取以下具有代表性的几种菌作为典型菌种说明本发明，但并不因菌株的具体来源限定本发明，本技术领域技术人员可以参照本发明方法选用其他常规菌株猴头6号，常山猴头、常山99、猴头王、猴头BJ-5、大猴头、美国大芝(美大芝)、泰山灵芝购自山东寿光食用菌研究所(《食用菌》，2008 年第 3 期第 31 页或者 http://www. sdsgsyj. com/pinzhongbiaoI. asp);猴头T3、猴头燕(猴头)、鹿角灵芝、京大I号(京大)、灰树花I号(千佛菌I号)、灰树花2号(千佛菌2号)购自北京吉蕈园科技有限公司(《食用菌》，2008年第3期第28页广告，http://www. bjjixunyuan. com/cul-show. asp classid = 58);舌甘芝(舌甘灵芝)、韩国灵芝、灰树花(千佛菌)购自华中农业大学菌种实验中心(http://jzsyzx.hzau. educn/jspx. html)。本实施例选用茶树品种金萱的嫩叶(一芽四叶)、中叶(五 七叶)、老叶(七叶以上)为材料，采摘于华南农业大学宁西教学基地，蒸汽杀青、干燥备用。也可以采用其他茶树叶，不做限定。大豆、土豆、玉米、麸皮、荞麦、燕麦、大米均为常规市售。土豆用30倍量(体积倍)的沸水煮30分钟取滤液，玉米、麸皮等粉碎并过60目筛。2、主要仪器设备及试剂和购买来源描述如下，但并不因此限定本发明范围，也可以采用本技术领域的同类仪器设备和试剂。Elga超纯水仪Ultra Bioscience (英国Elga公司制造)；LRH_70生化培养(上海一;〖亘科学仪器有限公司)！Universal 16R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司制造)；Mettler-Toled 电子天平 AB204_N(上海 Mettler-Toledo 仪器有限公司制造);Nano Drop分光光度计ND-1000 (美国Nano Drop公司制造)；超净工作台SW-CJ-IF (江苏苏州安泰空气技术有限公司制造)；电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司制造)；电热鼓风干燥箱101A-3S (广东广州富民测控科技有限公司制造)；旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司制造)；格兰仕微波炉WD800B (广东顺德格兰仕电器实业有限公司制造)；格兰特自动制冰机FM-70A(上海格兰特制冷有限公司制造)；恒温磁力搅拌器78HW-1 (江苏金坛仪器制造有限公司制造)；金属振荡培养箱HZQ-F160(哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造)；精密PH计PHS-3C (上海精密科学仪器有限公司制造)；752紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司制造)；美的多功能电磁炉(广东广州美的生活电器有限公司制造)；数显恒温水浴锅HH-2(江苏常州国华电器有限公司制造)；自动灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司制造)3、主要试剂氯化亚锡(上海实验试剂有限公司);水合茚三酮(天津市化学试剂研究所);葡萄糖(广州环凯生物公司)；浓硫酸(广州化学试剂厂)；苯酚(广州化学试剂厂)；冰醋酸(广州化学试剂厂)；十二水磷酸氢二钠(广州化学试剂厂)；磷酸二氢钾(分析纯)(广东光华化学厂有限公司)；磷酸氢二钾(分析纯)(广东光华化学厂有限公司)；7水合硫酸镁(分析纯)(广东光华化学厂有限公司)；没食子酸(上海立诚化工有限公司)；福林酚(上海君创生物科技有限公司)；浓盐酸(广州化学试剂厂)；牛血清白蛋白(BSA)(广州威佳科技有限公司)；氢氧化钠(分析纯)(广州化学试剂厂)；琼脂粉(广州环凯生物公司)；齐敦果酸(上海瑞芳得化工有限公司)；香草醛(上海达瑞精细化学品有限公司)；高氯酸(广州化学试剂厂)；无水硫酸钠(天津市大茂化学试剂厂)；无水乙醇(广州化学试剂厂)；甲醇(广州化学试剂厂)；谷氨酸(上海传信化工有限公司)；考马斯亮蓝G-250(广州化学试剂厂)。4、主要试剂配制方法
(l)pH8. 0磷酸盐缓冲液23. 9g十二水磷酸氢二钠，加蒸馏水溶解后定容为IL的l/15mol/L磷酸氢二钠溶液；9. 08g磷酸二氢钾经110°C烘干2h，加蒸馏水溶解后定容为IL的l/15mol/L磷酸二氢钾溶液；取上述l/15mol/L的磷酸氢二钠溶液95mL和l/15mol/L的磷酸二氢钾溶液5mL混合均匀。(2) 2%茚三酮溶液2g水合茚二酮(纯度不低于99% )，加50mL水和80mg氯化亚锡(SnCl2 2H20)搅拌均匀，放入暗处，静置一昼夜，过滤后加蒸馏水定容至100mL。(3)谷氨酸标准液400mg谷氨酸(纯度不低于99% )，加蒸馏水溶解后定容至200mL,得 2mg/mL 母液，再分别移取 5ml、7. 5ml、10ml、12. 5ml、15ml、17. 5ml 母液，蒸懼水定容至IOOmL作为工作液。(4) 5%苯酹溶液5g苯酹,热蒸懼水溶解定容至100mL。(5)葡萄糖标准液100mg葡萄糖经105°C干燥至恒重后，加蒸馏水溶解定容为IOOmL得lmg/mL母液,移取IOmL母液定容至IOOmL,得0. lmg/mL标准液。￠) 5%香草醛-冰醋酸1. 25g香草醛，加入冰醋酸25ml溶解即可。(7)齐墩果酸标准液20mg齐墩果酸干燥至恒重后，无水乙醇溶解后定容至IOOmL0(8)7. 5%碳酸钠溶液37. 50g碳酸钠，加蒸馏水溶解后定容为500mL。(9) 10%福林酚溶液20mL福林酚试剂转移到200mL容量瓶，定容摇匀。(10)没食子工作液0. 110g±0. OOlg没食子酸，加蒸馏水溶解并定容至IOOmL,分别移取上述溶液I. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. OmL于IOOmL容量瓶，加蒸馏水定容摇匀。(11)fcadford试剂IOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%的乙醇中，加IOOml 85%的H3PO4,用蒸懼水定容至1000ml。(12)牛血清白蛋白标准曲线称取IOmg牛血清白蛋白，用蒸馏水定容至10ml。(13)碱式乙酸铅溶液称取50g碱式乙酸铅，加水100ml，静置过夜，倾出上清液过滤。(14)盐酸0. 01mol/L溶液，取0. 9ml浓盐酸，用水稀释1L，摇匀。(15)硫酸4. 5mol/L溶液,取浓硫酸250ml,用水稀释至1L,摇勻。(16)咖啡碱标准液称取IOOmg咖啡碱(纯度不低于99% )溶于IOOml水中，作为母液，准确吸取5ml加水至IOOmL作为工作液(ImL含咖啡碱0. 05mg)。
(17)培养基I) PDSA培养基马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾3g、硫酸镁I. 5g、琼脂20g,蒸懼水定容至IOOOmL,高压灭菌后备用。2) PDSB培养基上述I3DSA培养基中不加琼脂，高压灭菌后备用。3)驯化培养基3%金萱中叶茶青粉，97% PDSA固体培养基。4)茶固体培养基茶青粉添加量为35%，辅料添加量为2%，自然pH值。二、实验方法I、茶青粉的制备称取一定量茶青，用手提式高速粉碎机粉碎至60目。
2、菌种的筛选与驯化将对比实验用的多个菌种活化后，接种至H)SA培养基平板上，于25°C恒温下培养6 7天(设三个重复)，每天测量菌落直径大。选取生长速度最快的菌种。将筛选出的菌种接种至含茶量为3%的培养基上(设三个重复)，于25°C恒温下培养，进行复筛，记录生长速度。将在3%茶培养基上培养后的菌种转接至含茶量分别为17%、24%、31 %、38%的固体培养基上培养至长满(设三个重复)，每天观察，记录长满天数以及菌丝生长状况。3、接种固体发酵取1%的驯化菌种接到茶固体培养基中，25°C恒温培养一定时间，收集菌质放置60°C干燥箱内烘干，磨碎过60目筛。4、菌丝生长速度的测定参照文献的测定方法(宋淑敏等，1999)，在普通平板培养基中央接种一块0. 5cm2左右大小的菌块，用三角板测定其菌块直径，记为屯，251培养，每天测定其直径的大小，直至菌丝长满整个平板的第t天直径记为dt，每种菌种做3个平行试验，取平均值。菌丝平均增殖速率=(dt-d0)/t5、茶菌质成分测定测定前茶菌质处理方法用研钵把干燥至恒重后的茶菌质研磨至均匀的粉状，放至密封袋密封，放在阴暗处保存。6、多糖的测定参照文献的测定方法(惟杰，1987 ;徐志祥等，2000)。(I)试液的制备称取0. 25g±0.0001g的茶菌质，用75%的乙醇30ml于60°C浸提30分钟,常温5000rmp离心IOmin,弃去上清液，以去除单糖、双糖、低聚糖等干扰性成分。预处理后的茶菌质再于沸水浴中浸提I小时，完毕后过滤定容至50ml，待测。(2)标准曲线的测定分别准确移取葡萄糖标准液0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2mI于试管内，各加蒸懼水补至2ml,再各加5%的苯酹Iml,摇勻。迅速滴加浓硫酸5ml,摇匀后于沸水中加热20min，用紫外分光光度计在489nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。(3)试样测定吸取试液0. 2ml于试管内，加蒸懼水补至2ml,再加5%的苯酹Iml,摇勻。迅速滴加浓硫酸5ml,摇勻后于沸水中加热20min,用紫外分光光度计在489nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。硫酸-苯酚法测定茶菌质多糖葡萄糖标准曲线见附图 I 所示，y = 10. 631x+0. 0067 ；R2 = 0. 9995 ；y =A489 ；x :葡萄糖浓度。7、茶多酚的测定采用国标(GB/T8313-2008)Folin试剂比色法(I)试液的制备称取0. 2g(精确到0. OOOlg)均匀磨碎的试样于IOmL离心管仲，加入经70°C中预热过的70%甲醇溶液5mL，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入70°C水浴中浸提IOmin (隔5min搅拌一次)，完毕后冷却至室温,常温3500rmp离心lOmin。将上清液转移至IOmL容量瓶。残渣再用5mL70%甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至IOmL,摇勻。(2)测定分别移取没食子酸工作液、蒸馏水(作空白对照用)及试液各I. OmL于25mL容量瓶中，分别加入5. 0mL10%福林酚试剂，摇匀。反应3 8min内加入4. 0mL7. 5%Na2CO3,加蒸懼水定容至刻度,摇勻，室温放置60min。用IOmm比色皿,在765nm波长条件下用紫外分光光度计测定吸光度(A)。(3)根据没食子酸工作液的吸光度(A)与工作液的没食子酸浓度，制作标准曲线。茶多酚测定的标准曲线见附图2所示，y = 0. 0042X+0. 0019 ；R2 = 0. 9992 ；y =A765 ；x :没食子酸浓度。 8、游离氨基酸的测定参照文献的测定方法(刘晓霞等，2008)。(I)试液制备称取3g(准确至0. OOlg)磨碎试样于500mL锥形瓶中，加沸蒸懼水450mL，立即移人沸水浴中，浸提45min (每隔IOmin摇动一次)。浸提完毕后立即趁热减压过滤。滤液移入500ml容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2 3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。(2)测定准确吸取试液lmL，注人25mL的容量瓶中，加0. 5mLpH8. 0磷酸盐缓冲液和0. 5ml2%茚三酮溶液，摇匀，在沸水浴中加热15min。待冷却后加水定容至25mL。用5mm比色杯，在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。谷氨酸标准曲线见附图3所示，y = I. 1259x-0. 0268 ；R2 = 0. 9809 ；y =A570 ；x :谷氨酸浓度。9、咖啡碱的测定采用国标(GB/T 8312-2002)-紫外分光光度法(I)试液制备称取3g(准确至0. OOlg)磨碎试样于500mL锥形瓶中，加沸蒸懼水450mL，立即移人沸水浴中，浸提45min (每隔IOmin摇动一次)。浸提完毕后立即趁热减压过滤。滤液移入500ml容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2 3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。(2)测定用移液管准确吸取试液IOmL移人IOOmL容量瓶中，加人4mL0. 01mol/L盐酸和Iml碱式乙酸铅溶液，用水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤，准确吸取滤液25mL，注人50ml容量瓶中，加人0. lmL4. 5mol/L硫酸溶液，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤。用IOmm比色杯，在波长274nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。(3)咖啡碱标准曲线分别吸取0、1、2、3、4、5、61^，咖啡碱工作液于一组251^容量瓶中，各加人I. OmL盐酸，用水稀释至刻度，混匀，测定吸光度(A)。将测得的吸光度与对应的咖啡碱浓度绘制标准曲线。见附图4所示，y = 47. 929x-0. 0093 ；R2 = 0. 9992 ；y =A274 ；x 咖啡碱浓度。10、三萜的测定参照文献的测定方法(江绍琳等，2006 ;弓晓峰等，2006)。(I)试液的制备称取0. 25g的茶菌质,加40ml无水乙醇用超声波处理I小时,温度控制在8 °C左右，然后过滤收集滤液，定容至50ml。(2)测定吸取试液0. 4ml于试管内，参比管加0. 4mL无水乙醇，密封，加热挥去溶齐U，然后加入新配制的0. 30mL5%香草醛-冰乙酸溶液和I. OmL高氯酸，在60°C恒温水浴中加热20min后，拿出用冰水冷却至室温，并加入5. OmL冰乙酸，摇匀后置于室温，以试剂空白溶液作参比，在548nm处测定吸光度(A)。(3)标准曲线的制作准确吸取标准溶液0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mL于试管内，密封，加热挥去溶剂，然后加入新配制的0. 30mL5 %香草醛-冰乙酸溶液和I. OmL高氯酸，在60°C恒温水浴中加热20min后，冰浴冷却至室温，并加入5. OmL冰乙酸，摇匀后置于室温，选择波长548nm测定吸光度。齐墩果酸标准曲线见附图5所示，y = 7. 0764x-0. 0278 ；R2 = 0. 9953 ；y =A548 ；x :齐墩果酸浓度。11、蛋白质的测定(I)测定取菌质0. 5g,加30mL蒸懼水,沸水浴30min,过滤定容至50mL。取IOOii L滤液，加5mLBradford试剂，摇匀，室温放置5min，以试剂空白溶液作参比，在595nm处测定吸光度(A)。(2)标准曲线的制作准确吸取标准蛋白母液0、20、30、40、50、601^于试管内，加水稀释至IOOu L,各加5mLBradford试剂,摇勻，室温放置5min,在595nm处测定吸光度(A)。牛血清白蛋白标准曲线见附图6所示，y = 0. 8451x+0. 0123 ；R2 = 0. 9925 ；y =A595 ；x 牛血清白蛋白浓度。、
三、茶固体发酵培养条件的优化I、单因素实验设计(I)固体发酵不同老嫩度茶青的研究将嫩叶、中叶、老叶分别按35%的量与2%的大豆混匀，含水量为63%，I %接种量，25°C恒温培养一定时间，收集菌质烘干待测,共3个处理,每个处理3个重复。(2)不同辅料对固体发酵基质的影响将不同辅料各按2%分别添加到中叶培养基中，其他条件不变，共7个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据以大豆、土豆、玉米、麸皮、荞麦、燕麦、大米为例。(3)辅料量对固体发酵基质的影响茶培养基中分别添加不同量的大豆粉，其他条件不变，共5个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据以添加0 %、I %、2 %、3%、4%的大豆粉为例。(4)发酵时间对固体发酵基质的影响35%的中叶与2%的大豆混匀，其他条件不变，以接种时为起点，在发酵不同天数(d)之后取样烘干测定各活性成分，每次3个重复。本实施例提供的实验数据以0、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d为例。(5)培养温度对固体发酵基质的影响35%的中叶与2%的大豆混匀，其他条件不变，分别在不同温度下培养，共4个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据以25 °C、28 °C、30°C、32 °C温度下培养为例。(6)含水量对固体发酵基质的影响不同含水量添加2%大豆粉，其他条件不变，共4个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据分别以55 %、60 %、65 %、70 %为例。(7)接种量对固体发酵基质的影响以不同接种量，其他条件不变，共5个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据分别以接种量1%、2%、3%、4%、5%为例。(8)起始pH值对固体发酵基质的影响不同起始pH值,其他条件不变,共5个处理，每个处理3个重复。本实施例提供的实验数据分别以PH值为5、pH值为6、pH值为7、PH值为8、pH值为9为例。2、响应面分析方法(RSM)优化培养基及培养条件根据Box-Bohnken设计原理，由二水平设计确定的因素，每个因素取3个水平，以(_1，0，1)编码进行实验。以酚氨比为响应值，借助Design-Expert 7. I. 3软件对数据进行二次回归拟合，得到多元二次回归方程，分析各因素的主效应和交互效应，对实验数据分析得到多元二次回归方程各变量的偏回归系数估计值，从而建立二次响应面经验模型，依据回归方程来绘制响应面立体分析图，得出响应面规范分析结果，从而寻求最佳水平，进而确定最佳培养体系。3、发酵茶菌质中氨基酸种类分析氣基酸样品的提取精确称取恒重后的灰树花菌质2g(甜芝菌质4g)，加煮沸的蒸馏水20ml浸泡15分钟间歇搅拌数次。待茶叶沉淀收集茶汤IOOmL的容量瓶中，如此反复操作5次合并所有的茶汤,待冷却后用蒸懼水定容至100mL。在60°C旋转蒸发干燥,加5mL0. 02mol/L的盐酸，过0. 22 ii m水相微孔滤膜后待测。氨基酸自动分析仪检测条件日立855-350型色谱柱；柱温程序变温；反应柱温134°C ;分析时间:IIOmin ;进样量20u I04、发酵茶菌质挥发性成分分析挥发性成分提取采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)提取菌质中的香气成分。称取IOg菌质于150mL密封顶空样品瓶中，40°C水浴，磁力搅拌，将SPME手持器通过瓶盖的橡皮垫插入到萃取瓶中，推出固相微萃取纤维头(75iimCAR/PDMS)，顶空萃取30min，220°C解吸3min,进样。GC-MC分析条件色谱柱HP-INN0WAX，30X0. 25mm。色谱分析条件升温程序为60°C保持 2min,以 3°C /min 升至 80°C，保持 2min,以 10°C /min 升至 180°C，保持 2min,进样口温度220°C，以He为载体，流速I. OmL/min。质谱分析条件离子源EI，电子能量70eV，电力电压350V，扫描质量范围35 335amu。挥发性物质的定性分析及相对含量挥发性成分经GC-MC测定后得到总离子流图及质谱图。利用标准质谱数据库(NIST/WILLEY)对质谱图进行计算机串联检索和人工解析，结合定性匹配因子，对可信度较高的组分加以确认。采用峰面积归一法计算各组分的相对含量。5、菌茶感官评定分析试验以粉碎度(A)、茶水比(B)、泡茶时间(C) 3个因素3个水平做正交试验，对发酵菌质的感官指标进行综合评分。正交试验因素水平见表I。表I菌质冲泡条件的正交试验因素与水平 [oho]
权利要求
1.一种甜灵芝发酵茶的制备方法，其特征在于是以中叶茶青为主培养基，以中叶茶青的质量为基准，添加质量百分比为1% 5%的大豆粉为辅料，在初始pH自然、发酵温度25°C 30°C、发酵时间13 20天、甜灵芝菌种接种量为2% 5%、含水量为60% 70%的条件下发酵得到甜灵芝茶菌质，收集甜灵芝茶菌质烘干即得。
2.根据权利要求I所述甜灵芝发酵茶的制备方法，其特征在于是以中叶茶青为主培养基，以茶青质量为基准，添加质量百分比为2%大豆粉为辅料，在初始pH自然、发酵温度25°C、发酵时间16天、甜灵芝菌种接种量为4%、含水量为65%的条件下发酵得到甜灵芝茶菌质，收集所述甜灵芝茶菌质烘干即得。
3.根据权利要求I或2所述甜灵芝发酵茶的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)茶固体培养基的制备将茶青和大豆粉混匀后，调整水分含量和PH值，灭菌后备用； (2)将活化后的甜灵芝菌种接种到步骤(I)制得的茶固体培养基； (3)按照权利要求I所述的发酵条件下发酵培养； (4)收集茶菌质烘干即得所述甜灵芝发酵茶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述烘干温度为55 65°C。
5.一种权利要求I或2所述制备方法制备得到的甜灵芝发酵茶。
6.权利要求5所述的甜灵芝发酵茶，其特征在于含有以下重量百分比含量的有效成分总糖8% 13%，多糖3. 5% 6. 0%,茶多酚1% 3%，氨基酸0. 5% 2%，酚氨比1% 3%，咖啡碱1% 3%，蛋白质5% 10%o
7.—种权利要求3所述制备方法制备得到的甜灵芝发酵茶。
8.权利要求5所述的甜灵芝发酵茶的食用方法，其特征在于将所述甜灵芝发酵茶磨碎为300 ii m 500 ii m的颗粒，以茶水比I :80 I :110的比例冲泡，所述冲泡时间为2min 4min。
9.根据权利要求8所述的甜灵芝发酵茶的食用方法，其特征在于将所述甜灵芝发酵茶磨碎为400iim的颗粒，以茶水比I :100的比例冲泡，所述冲泡时间为3min。
10.权利要求7所述的甜灵芝发酵茶的食用方法，其特征在于将所述甜灵芝发酵茶磨碎为300iim 500iim的颗粒，以茶水比I :80 I :110的比例冲泡，所述冲泡时间为2min 4min。
全文摘要
本发明公开了一种甜灵芝发酵茶的制备方法及甜灵芝发酵茶。是以中叶茶青为主培养基，以中叶茶青质量为基准，添加质量百分比为1%～5%的大豆粉为辅料，在初始pH自然、发酵温度25℃～30℃、发酵时间13～20天、甜灵芝菌种接种量为2%～5%、含水量为60%～70%的条件下发酵得到甜灵芝茶菌质，收集所述甜灵芝茶菌质烘干即得。本发明首次采用药用菌甜灵芝直接固体发酵茶中叶，使灵芝有效成分和茶的有效成分有机的结合起来，发挥茶叶与灵芝的保健功效，提高了茶叶的内在品质。既充分利用了茶树中废弃的中叶叶片，提高了茶树的利用率，使茶树中叶变废为宝，解决了目前我国茶场修剪叶和茶厂废碎茶末得不到有效利用而浪费的问题，又得到具有多种活性成分的甜灵芝发酵茶，丰富了茶叶产品。
文档编号A23F3/10GK102669320SQ20121012338
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者付显令, 林俊芳, 熊荣园, 郭丽琼, 马立青 申请人:华南农业大学