一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法与流程

本发明涉及食品安全与检测、临床医学等领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)定向筛选一条脂多糖的广谱性核酸适配体，它能特异识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等4种细菌来源的脂多糖，为该核酸适配体在食品、药品及生物制品中脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和等方面的应用提供科学依据和理论基础。

背景技术：

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，又名内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分。它主要由Lipid A，核心多糖和O-特异性多糖重复单元三部分组成，其中Lipid A是脂多糖的活性和毒性中心，位于外模的内侧，具有高度的保守型，而决定LPS抗原性的O-特异性多糖链位于外膜的外层，暴露于细胞表面，结构不稳定，核心多糖则位于两者中间，起连接作用。不同细菌来源的脂多糖结构不尽相同，毒性也不同，但是均具有相似的Lipid A结构。LPS在体内可通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成或释放出多种细胞因子和炎症介质，从而引起机体一系列的反应，如发烧、腹泻、休克、败血症、多器官衰竭甚至死亡。当菌体溶解或被杀灭死亡后，脂多糖被大量释放到周围环境中，因此它广泛存在于日常生活种的饮用水、食品、药品及生物制品中，严重危害了产品质量和人民的健康安全。

目前，传统的内毒素检测方法主要有家兔热源检查法、鲎试剂法(LAL法)等，但是该类方法主要是基于酶催化反应的，因此在实际样品检测中容易受到蛋白酶等酶的影响而导致结果不准确，同时检测耗时长，灵敏度低，不能满足快速灵敏的市场需求。另外，由于细菌死亡溶解导致LPS的释放，其污染难以避免，尤其是生物制品和最终产品中。因此发展快速、高效、灵敏的脂多糖检测方法具有重要的意义。近年来，一些基于特异性识别LPS分子的生物传感器如蛋白生物传感器(LBP结合蛋白、CD14、rFC)、多肽生物传感器(PmB)、抗体生物传感器等在脂多糖检测方面得到了初步应用。这些检测方法虽然提高了检测的灵敏度，但是这些蛋白分子特异性不强，容易与其他分子结合，从而影响了检测结果的准确性；多肽的设计和制备成本高，同时检测过程较复杂；而抗体制备需要进行动物实验，同样存在时间长、成本高的缺点。

核酸适配体是利用上世纪90年代初发展的一种新的组合化学技术——SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集的配体系统进化技术)技术通过孵育、分离、扩增等反复多轮筛选得到的一段具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标分子的单链DNA或RNA序列。作为一种新型的仿生识别分子，核酸适配体能选择性地特异结合靶标分子。由于其具有靶分子范围广、可体外化学合成、稳定性好、制备及修饰方便、成本低等优点，近年来在疾病治疗、医疗诊断、环境检测和食品安全等方面的应用引起了广泛的关注。

经过近30年的发展，已开发了各种各样的SELEX技术，如CE-SELEX、Magnetic-CELEX、GO-SELEX、PD-SELEX、Capture-SELEX、Cell-SELEX等，尽管利用这些SELEX技术筛选得到诸如有机染料、金属离子、氨基酸、抗生素、蛋白质、细胞、致病菌等近600种核酸适配体，但是除了哌加他尼钠(pegaptanib sodium)和凝血酶核酸适配体外，能实际应用和开发的核酸适配体并不多。这可能是与筛选过程的不确定性有一定的关系。目前大部分筛选技术都是建立在固定靶标的基础上发展起来的，由于靶标的固定需要进行化学修饰从而改变了目标物质的天然结构，因此筛选到的适配体特异性不强、亲和性不高，实际应用受限。而毛细管电泳-SELEX技术等(CE-SELEX)虽然使靶标和文库均游离状态，保持了靶标的天然结构，但是该方法仅适用于大分子的筛选，另外，大分子可能存在多个结合位点，因此难以筛选到特定结合位点的核酸适配体。Capture-SELEX技术是通过非共价平衡作用将寡核苷酸文库固定到磁珠、琼脂糖颗粒等基质上而发展的一种文库固定、靶标游离的SELEX技术，虽然具有免标记、免固定的优点，弥补了CE-SELEX不能筛选小分子的不足，但是同样存在着筛选的不确定性。因此，开发定向SELEX筛选技术具有广阔的应用前景。

本发明以鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体为唯一靶标，利用生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe₃O₄磁性纳米颗粒上，经过孵育、分离、扩增、酶切制备单链、克隆测序等步骤进行筛选，当文库富集到一定程度后，再加入沙门氏菌和大肠杆菌完整的活性菌作为定向分子进行定向筛选出特异性和广谱性均较高的细菌脂多糖核酸适配体。这种筛选策略利用脂多糖的结构特点和Capture-SELEX技术的优势，无需使用多靶标混筛选，就能筛选到能识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等不同细菌来源的脂多糖核酸适配体，具有操作简便、效果明显、筛选成本低的优势。所获得的适配体具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，能应用于饮用水、食品或临床医学等方面脂多糖的分析检测、分离富集和毒性中和。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种细菌脂多糖广谱性寡核苷酸适配体的定向筛选方法，它操作简单、效果明显。

本发明的另一目的在于提供一条识别细菌脂多糖的广谱性寡核苷酸适配体，为开发细菌脂多糖的新型分离富集或分析检测技术奠定良好基础。

本发明方法基于靶标游离、文库固定的Capture-SELEX筛选技术，利用生物素-亲和素作用将随机寡核苷酸文库通过生物素化的短互补链固定在亲和素包被的Fe₃O₄磁性纳米颗粒上，经过孵育、分离、扩增、酶切制备单链、克隆测序等步骤反复筛选，当与脂多糖亲和性的文库富集到一定程度后，再加入沙门氏菌和大肠杆菌完整的活性菌作为定向筛选分子进行定向筛选，经过共15轮的反复筛选最终获得一条能识别四种脂多糖的广谱性核酸适配体。

本发明的优点：(1)与传统的筛选技术相比，该定向策略操作简单、效果显著，同时无需使用多靶标混筛选，不仅降低了成本，还提高了筛选成功率；(2)适配体可在体外筛选，筛选周期短，稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告分子，可长期保存使用；(3)所获得的核酸适配体能同时识别鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌等4种细菌来源的脂多糖，具有较好的广谱性和特异性。

附图说明

图1是LPS广谱核酸适配体的定向筛选流程图。

图2是寡核苷酸适配体EA7的模拟二级结构图。

图3是寡核苷酸适配体EA7的饱和结合曲线图。

图4是寡核苷酸适配体EA7的特异性试验结果。

具体实施方式：

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

1、体外化学合成随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库及引物(IDT公司合成)，具体序列如下：

ssDNA文库：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG-(40nt)-TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3′；(长度80bp,中间为40个碱基的随机序列，两端分别为20nt的固定序列，库容量在10¹⁴以上。)

上游引物P1：5′-ATAGGAGTCACGACGACCAG-3′

5′磷酸化下游引物P2：5′-(phosphate)-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3′

生物素化的文库互补序列bCS：5′-biotin-CTGGTCGTCGTGACT 3′

将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液存于-20℃备用。

2、随机寡核苷酸文库互补杂交和固定

第一轮筛选反应体系为600μL，将互补序列bCS和ssDNA文库按照2：1的摩尔比加入到BB缓冲液(50mM Tris-HCl,5mM KCl,100mM NaCl,1mM MgCl₂,pH 7.4)中，混匀后于95℃变性处理10min再于37℃，130rpm条件下振荡孵育2h，以形成互补杂交链。随后向其中加入一定量的2mg/mL亲和素包被的磁珠溶液(ssDNA:磁珠质量比＝1:400)，再于37℃，130rpm下反应1h，由于亲和素-生物素的特异性作用，ssDNA文库因此而固定在磁珠上。为去除非特异性结合的ssDNA，ssDNA固定化的磁珠用BB缓冲液清洗10次以上后再用600μL BB溶解备用。

3、随机寡核苷酸文库的孵育与分离

向固定好的ssDNA-磁珠溶液中加入5μg鼠伤寒沙门氏菌脂多糖(LPS)并在37℃，130rpm条件下孵育2h，这样与LPS亲和力高的ssDNA从磁珠上解离下来形成LPS-ssDNA复合物而游离于溶液中，利用磁分离收集上清即为第一轮筛选富集得到的核酸适配体文库，以此作为模板进行PCR扩增。

4、PCR扩增、纯化及ssDNA单链制备

50μL PCR扩增反应体系为：模板1μL，上游引物P1(10μmol/L)0.5μL，下游磷酸化引物P2(10μmol/L)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，dNTP(2.5nmol/L)2μL，10×PCR buffer 5μL，超纯水40.5μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，PCR循环数后进行大量扩增，然后72℃延伸5min，最后4℃冷却。PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bio-Rad凝胶成像仪进一步验证大小是否为80bp，条带是否单一后，采用PCR产物纯化试剂盒纯化。然后加入一定量的Lambda核酸外切酶于37℃反应30-60min，75℃条件下灭酶10min，以切除5′端磷酸基团修饰的DNA链，制备ssDNA。酶切产物采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)电泳验证酶切完全后，用酚/氯仿法进行纯化。将纯化后得到的ssDNA单链溶于200μL TE缓冲液并利用Thermo NanoDrop-2000超微量分光光度计定量后作为次级文库用于下一轮筛选。

5、第二至第十五轮筛选

第二轮至第十五轮按照第一轮方法进行筛选，筛选反应体系为300μL。为增加筛选压力，提高筛选效果，随着筛选轮数的增加，ssDNA次级库和靶标LPS的用量逐渐减少(次级库用量由第二轮的100pmol逐渐减少到第15轮的10pmol，LPS用量由最初的5μg逐渐减低到0.5μg)、孵育时间逐渐缩短(由最初的2h缩减到30min)。为提高适配体的特异性，第四轮、第六轮、第八轮用BSA进行反向筛选。当核酸适配体文库富集到一定程度后，为获得广谱性核酸适配体，在第七轮、第九轮、第十三轮用沙门氏菌和大肠杆菌作为定向筛选物进行定向筛选，磁分离去除上清，将磁珠溶液用BB缓冲溶液清洗多次去除非特异性吸附后，再加入LPS进行孵育、分离，收集的上清即为下一轮筛选所用文库。

6、克隆测序

将第十五轮筛选得到的PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行克隆测序，即得到上述权利要求中所述的核酸适配体序列。

7、LPS核酸适配体亲和力和特异性分析

7.1亲和力分析

将5’端FAM荧光基团标记的核酸适配体EA7用BB缓冲溶液配置成一系列浓度(10，20，40，80，160，200nM)，按照筛选的方法将其固定到磁珠上后，与1μg LPS在37℃，130rpm条件下孵育20min后，磁分离收集上清。然后用F-7000荧光光度计(490nm激发，520nm发射)测定上清液荧光强度，实验设置一个空白对照组和三个平行，整个过程采用避光处理。以核酸适配体浓度为横坐标，以相对荧光强度为纵坐标，利用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性回归拟合计算解离常数Kd值，并绘制结合饱和曲线(图3)。

6.2特异性分析

将100μl 120nM浓度的5’-FAM标记的核酸适配体EA7按照筛选的方法固定到磁珠上后，分别与鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、肠炎沙门氏菌脂多糖、大肠杆菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖、沙门氏菌、大肠杆菌以及BSA在37℃，130rpm条件下孵育20min后磁分离收集上清。然后用F-7000荧光光度计(490nm激发，520nm发射)测定上清液荧光强度，实验设置一个空白对照组和三个平行，整个过程采用避光处理。结果表明该核酸适配体能识别四种不同细菌来源的脂多糖，而对两种细菌和BSA结合力较弱(图4)。因此，推测该核酸适配体是一种广谱性的LPS核酸适配体。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部该进，都将视为在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种特异识别细菌脂多糖的广谱核酸适配体及其定向筛选方法

<130> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<223> EA7

<400> 1

ataggagtca cgacgaccag ccttctaaca gaatgttgtt agatagcttt gaagctggtc 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80