一种环状RNA及其用途的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，尤其涉及一种环状RNA及其用途。
背景技术：
：原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)简称肝癌，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有74万患者被新诊断为肝细胞癌，同时约有69万患者死于肝癌。其中，我国占到了全球每年新发病例的55％，成为全世界肝癌最高发的地区之一。环状RNA(ciucularRNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在肝癌诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术不足，而提供一种环状RNA，且本发明还提供了该环状RNA的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种环状RNA，所述环状RNA的circbaseID为has_circ_0098181。环状RNAhas_circ_0098181在基因组上的定位为：chr12：23998916-24048958，相应的线性基因为SOX5(NM_152989)，环化的核苷酸序列有443个碱基。目前尚未有任何关于环状RNAhsa_circ_0098181功能的报道。环状RNAhas_circ_0098181对应的cDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述环状RNAhas_circ_0098181的序列如SEQIDNO:2所示。所述环状RNAhas_circ_0098181的结构是由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构。另外，本发明还提供一种诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测所述环状RNA的表达量的试剂。本发明研究发现肝组织中SOX5基因的RNA存在环化现象，且环状RNAhas_circ_0098181在肝癌组织中表达显著下调。作为上述技术方案的改进，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物。作为上述技术方案进一步地改进，所述引物为由如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的DNA序列组成的引物对或由如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的DNA序列组成的引物对。作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括肝组织RNA的提取试剂、cDNA的逆转录试剂。另外，本发明还提供一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括所述的环状RNA和增加所述环状RNA的表达量的试剂中的至少一种。本发明发现，过表达的环状RNAhas_circ_0098181引起细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，抑制迁移和侵袭。另外，本发明还提供一种治疗肝癌的表达载体，所述表达载体表达所述的环状RNA。另外，本发明还提供所述的环状RNA在制备肝癌诊断试剂盒中的用途。另外，本发明还提供所述的环状RNA在制备或筛选治疗肝癌的药物中的用途。另外，本发明还提供增加所述环状RNA的表达量的试剂在制备治疗肝癌的药物中的用途。本发明的有益效果在于：(1)本发明首先通过设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR、一代测序、RNA酶降解实验证实环状RNAhsa_circ_0098181的基因hsa_circ_0098181客观存在；(2)本发明通过检测肝癌病人中环状RNAhsa_circ_0098181表达情况，发现其表达水平明显降低，可作为肝癌的诊断标志；(3)本发明对hsa_circ_0098181基因进行了体外细胞功能学的研究，通过将hsa_circ_0098181基因构建到环状RNA专用的慢病毒载体上，以建立过表达该基因的稳定细胞株；过表达环状RNAhsa_circ_0098181的肝癌细胞株的增殖速度显著减慢，hsa_circ_0098181基因及其表达产物环状RNAhsa_circ_0098181可以应用在制备治疗肝癌的药物中。附图说明图1为本发明实施例1中hsa_circ_0098181基因表达产物的琼脂糖凝胶电泳图，并对PCR产物进行Sanger测序明确测到环化位点；图2反映本发明实施例2中RNaseR对环状RNAhsa_circ_0098181和GAPDHRNA的表达量的影响；图3为本发明实施例2中肝癌组织和癌旁组织的环状RNAhsa_circ_0098181表达量；图4为本发明实施例3中构建好的稳定细胞株97L-hsa_circ_0098181和LM3-hsa_circ_0098181的环状RNAhsa_circ_0098181表达量；图5为过表达的环状RNAhsa_circ_0098181对97L和LM3细胞功能的影响示意图；其中，图5A反映本发明实施例4中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181引起肝癌细胞G1期阻滞，图5B反映本发明实施例5中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181促进细胞凋亡，图5C反映本发明实施例6中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞增殖，图5D反映本发明实施例7中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞迁移，图5E反映本发明实施例8中过表达的环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞侵袭。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。实施例1：RT-PCR反应检测环状RNAhsa_circ_0098181在肝癌组织中的表达，具体实验方案如下：1.1RNA提取(1)组织处理：取10mg左右组织加入1mLTrizol，用匀浆机匀浆；离心15min，12000g，取上清；(2)向上清中加入200μL氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3min；(3)4℃、12000g离心15min，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA、脂类等；下层为细胞残渣、蛋白、多糖等；(4)取上清到新的EP管内，加入等体积的异丙醇，混匀；静置10min后，4℃、12000g离心10min；(5)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1mL75％乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起；(6)4℃、12000g离心10min，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心；晾干约15min，至管壁无液体；加入适量体积(20～30μL)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10min；(7)取出2μL定量，测量缓冲液为10mMTrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录(1A260＝40μg/mL，A260/A280＝1.8～2.1)。1.2cDNA逆转录(1)实验体系M-MLVReverseTranscriptase：1.3引物环状RNA引物为反向引物，同时设计一对正向引物做对照，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，同时以线性基因GAPDH作为阴性对照；使用的引物如表1所列：表1为引物SEQIDNO:3hsa_circ_0098181_FdivergentGTGGGCGACAGAGTGGCGAGSEQIDNO:4hsa_circ_0098181_RdivergentTACGGAGAGGCTGGTCGCTTGSEQIDNO:5hsa_circ_0098181_FconvergentAGGTAGCCATGGTGACAAGCSEQIDNO:6hsa_circ_0098181_RconvergentTGCTGAGAAGTGGGAGTCCTSEQIDNO:7hsaGAPDHdivergent_FTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCSEQIDNO:8hsaGAPDHdivergent_RTGCGGGCTCAATTTATAGAAACCGGGSEQIDNO:9hsaGAPDHconvergent_FGAGTCAACGGATTTGGTCGTSEQIDNO:10hsaGAPDHconvergent_RGACAAGCTTCCCGTTCTCAG1.4PCR以GAPDH作为内对照，PCR的反应体系为：每个反应管中分别加入2μL10×Buffer，2μLdNTP，1μL正向引物，1μL反向引物，1μLcDNA模板，0.2μLTaq酶，加水至20μL；PCR反应条件如下：94℃，5min预变性；94℃，30s变性；55℃，30s退火；72℃，30s延伸；35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图1，图1中环状RNA引物为反向引物(黑色三角形符号)，同时设计一对正向引物做对照(白色三角形符号)，RT-PCR时设立一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。实施例2：QPCR检测肝癌组织中环状hsa_circ_0098181的表达量2.1RNA提取：同实施例1；2.2cDNA逆转录：同实施例1；2.3QPCR扩增(1)实验体系：选用实施例1的hsa_circ_0098181divergent引物用于扩增环状RNAhsa_circ_0098181，实施例1的hsaGAPDHconvergent引物用于扩增内参基因。(2)反应条件第一步：95℃，2min；第二步：95℃，3s；60℃，30s；40个循环；第三步：60～95℃，溶解曲线。(3)上机进行目标基因扩增，qPCR相对定量结果如下：目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值。△Ct＝Ct目的-Ct管家，表示各样本目的基因相对管家基因的相对Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。总RNA按3U/μg的比例加入核糖核酸酶RNaseR进行消化，qPCR检测加与不加RNaseR对环状RNAhsa_circ_0098181和GAPDHRNA的表达量影响，结果见图2，RNaseR消化证实环状RNAhsa_circ_0098181对核糖核酸酶不敏感。RNaseR是一个能消化线性RNA，但对环状RNA没有影响的核糖核酸酶，将RNA用RNaseR消化后再进行qPCR检测，结果显示加与不加RNaseR对环状RNAhsa_circ_0098181的表达量没有明显影响，但是GAPDHRNA经RNaseR消化后表达量显著降低。qPCR检测肝癌和相应癌旁组织中环状RNAhsa_circ_0098181和GAPDHRNA的表达量，结果见图3。在49对肝癌临床组织样本进行检测，结果显示环状RNAhsa_circ_0098181的表达量在肝癌组织中显著下调，其中N为癌旁组织，T为肝癌组织。实施例3：过表达环状RNAhsa_circ_0098181慢病毒及其稳定细胞系的构建3.1过表达环状RNAhsa_circ_0098181慢病毒载体的构建合成hsa_circ_0098181基因线性全序列，序列经过退火成双链DNA片段，通过多克隆位点插入到LV-Circ载体，重组质粒通过测序进行鉴定，Control阴性对照为未插入序列的LV-Circ空载体。3.2慢病毒包装(1)转染前24h，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养24h；待细胞密度达70％～80％时即可用于转染(细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数)；(2)转染前将细胞培养基更换为无血清培养基；(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(LV-has_circ_0098181/LV-Circ载体10μg，pGag/Pol载体5μg、pRev载体5μg、pVSV-G载体5μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为1.5mL；(4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取60μLLipofectamine2000试剂在另一管中与1.5mLOpti-MEM混合，在室温下温育5min；(5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；(6)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；(7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；(8)培养6h后吸去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基10mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48h。3.3病毒的收获及浓缩(1)收集转染后48h和72h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液；(2)于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；(3)以0.45μm滤器过滤上清液于50mL离心管中；(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19mL)，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中。(5)组合好后，做好平衡，放在转头上；(6)在5000g离心，至需要的病毒浓缩体积；通常需要的时间为10～15mim；(7)离心结束后，过滤杯中的即为病毒浓缩液；(8)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存一周或在-80℃长期保存；可取其中一支进行病毒生物学滴度测定。3.4慢病毒感染细胞(1)根据细胞的量将细胞在1.5mL管中离心收集然后用100～200μL的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准；(2)吸取过表达环状RNAhsa_circ_0098181的病毒液加入细胞中，将1.5mL管放在37℃度培养箱中孵育30min，另取LV-Circ空载体对照病毒感染做对照细胞系；(3)将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里；(4)加入足够量的新鲜培养液。(5)12h后换液；(6)48h后加入2μg/mLpuromycin(嘌呤霉素)进行稳定细胞株筛选。3.5稳定细胞株鉴定将构建好的稳定细胞株收取部分细胞qPCR检测，结果如图4所示，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_的表达量显著增加。实施例4：过表达的环状RNAhsa_circ_0098181对肝癌细胞周期影响的测定(1)PBS清洗细胞三次后用胰酶将细胞消化成单细胞悬液；(2)计数细胞密度，并取1×106个细胞用70％冰乙醇于-20℃进行细胞过夜固定；(3)500g离心5min沉淀细胞；(4)吸走上清，加入500μL细胞周期染液；(5)震荡混匀，37℃孵育30min；(6)混匀后用流式细胞仪检测。结果见图5A，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_0098181引起肝癌细胞G1期阻滞。实施例5：过表达的环状RNAhsa_circ_0098181对肝癌细胞凋亡影响的测定5.1收集细胞(1)贴壁细胞生长至70％～80％的时候收取，从步骤继(3)续做；(2)悬浮细胞处于快速增长期且无饥饿时收取，从步骤(5)继续做；(3)具体操作，标记EP管，混匀培养基，吸取含血清的上层培养基于EP管中，加入PBS洗三次；(4)加入白胰酶消化，消化好后用第三步收集的培养基停止消化，并及时吸打细胞成单细胞悬液；(5)收取时吸打混匀悬浮细胞，吸取大约106个细胞于相应的EP管中；(6)300g离心1min，弃去上清，留下少许上清，弹匀细胞沉淀；(7)加入冷PBS洗一次，300g离心1min，弃去PBS；留下少许PBS，弹匀细胞沉淀。5.2标记及流式检测(1)用1倍的BindingBuffer100μL重悬细胞为1×105个细胞/mL；(2)分别加入5μLAnnexinV和5μL7-AAD；(3)混匀，室温避光孵育15min；(4)加入400μL的1倍的BindingBuffer混匀后，1h内进行流式检测。结果见图5B，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_0098181促进细胞凋亡。实施例6：过表达环状RNAhsa_circ_0098181对肝癌细胞增殖能力影响的测定(1)将过表达环状RNAhsa_circ_0098181的细胞株及对照组细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL；分装到96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为1×104个，各9孔；(2)分别在不同的时间点(24、48、72h)加入MTS试剂，比例为1:10，即100μL培养液加入10μL检测液；(3)37℃孵育4h后，酶标仪检测490nm吸光值。结果见图5C，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_0098181表达上调的肝癌细胞株增殖速度减慢；其中，横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的490nm吸光值。实施例7：过表达环状RNAhsa_circ_0098181对肝癌细胞迁移影响的测定(1)胰酶消化成单细胞悬液，计数，用无血清培养基调整细胞浓度至1×106/mL；(2)加入100μL细胞悬液至小室上室，在下室中加入600μL含不同浓度胎牛血清的完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h；(3)取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，显微镜观测并拍照。结果见图5D，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞迁移。实施例8：过表达环状RNAhsa_circ_0098181对肝癌细胞侵袭影响的测定(1)将Matrigel置于4℃中过夜溶解，用预冷的基础培养基按Matrigel:培养基＝1:3的比例稀释，取40μL加入预冷的Transwell小室中，动作要慢，避免产生气泡；(2)37℃孵育2h使Matrigel凝固；(3)分别在上下室加入100μL和600μL基础培养基，37℃水合过夜，次日吸去培养基；(5)实验细胞胰酶消化后，取适量细胞悬液，800rpm离心5min；(5)吸去上清，用基础培养基重悬细胞后，细胞计数并用基础培养基调整细胞浓度至1×106/mL，取100μL加入至Transwell小室上室，在下室加入600μL完全培养基；(6)放入培养箱中培养24、48h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定15min；PBS洗涤一次，1％结晶紫染色10min；PBS洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔。结果见图5E，证实过表达环状hsa_circ_0098181的细胞株LM3-hsa_circ_0098181、97L-hsa_circ_0098181与对照组细胞株LM3NC、97LNC相比，环状RNAhsa_circ_0098181抑制细胞侵袭。最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>中山大学附属肿瘤医院广州永诺生物科技有限公司<120>一种环状RNA及其用途<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>443<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>1gatgtcttccaagcgaccagcctctccgtatggggaagcagatggagaggtagccatggt60gacaagcagacagaaagtggaagaagaggagagtgacgggctcccagcctttcaccttcc120cttgcatgtgagttttcccaacaagcctcactctgaggaatttcagccagtttctctgct180gacgcaagagacttgtggccataggactcccacttctcagcacaatacaatggaagttga240tggcaataaagttatgtcttcatttgccccacacaactcatctacctcacctcagaaggc300agaagaaggtgggcgacagagtggcgagtccttgtctagtacagccctgggaactcctga360acggcgcaagggcagtttagctgatgttgttgacaccttgaagcagaggaaaatggaaga420gctcatcaaaaacgagccggaag443<210>2<211>443<212>RNA<213>智人（Homosapiens）<400>2gaugucuuccaagcgaccagccucuccguauggggaagcagauggagagguagccauggu60gacaagcagacagaaaguggaagaagaggagagugacgggcucccagccuuucaccuucc120cuugcaugugaguuuucccaacaagccucacucugaggaauuucagccaguuucucugcu180gacgcaagagacuuguggccauaggacucccacuucucagcacaauacaauggaaguuga240uggcaauaaaguuaugucuucauuugccccacacaacucaucuaccucaccucagaaggc300agaagaaggugggcgacagaguggcgaguccuugucuaguacagcccugggaacuccuga360acggcgcaagggcaguuuagcugauguuguugacaccuugaagcagaggaaaauggaaga420gcucaucaaaaacgagccggaag443<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gtgggcgacagagtggcgag20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4tacggagaggctggtcgcttg21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5aggtagccatggtgacaagc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6tgctgagaagtgggagtcct20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7tcctcacagttgccatgtagaccc24<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8tgcgggctcaatttatagaaaccggg26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9gagtcaacggatttggtcgt20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gacaagcttcccgttctcag20当前第1页1 2 3